T-SPOT診斷結(jié)核感染臨床應(yīng)用進(jìn)展

1、 T-SPOT.TB診斷結(jié)核感染 臨床應(yīng)用進(jìn)展主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用2主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用3結(jié)核的現(xiàn)狀結(jié)核的現(xiàn)狀 結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)WHO統(tǒng)計，全球約有統(tǒng)計，全球約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約200萬人死于結(jié)核。萬人死于結(jié)核。 我國是世界上我國是世界上22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的感染

2、導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍以上。倍以上。4中國是結(jié)核感染高負(fù)擔(dān)國家n患者人數(shù)占全球的14.3%，具體表現(xiàn)為“五多”n感染人數(shù)多5.5億人感染過結(jié)核n患病人數(shù)多現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者500萬n潛伏感染人數(shù)多受限于檢測條件較難統(tǒng)計，2009年流行病調(diào)查結(jié)果為總?cè)丝诘?4.5%（因采用PPD檢測，假陽性較多）n新發(fā)患者多僅活動性肺結(jié)核2009年新發(fā)病患107萬n死亡人數(shù)多13萬/年5結(jié)核的傳統(tǒng)診斷手段結(jié)核的傳統(tǒng)診斷手段u結(jié)核菌素皮試：結(jié)核菌素皮試：低敏感性：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。低特異性：低特異性：與卡介苗接種和其他環(huán)境分枝桿菌有交叉，易造成“假陽性”結(jié)果。u

3、免疫學(xué)診斷 抗原、抗體（膠體金）u細(xì)菌學(xué)檢查：細(xì)菌學(xué)檢查：常規(guī)培養(yǎng)：2月；快速培養(yǎng)：1周； 涂片陽性率取決于采集標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量，不利于早期診斷。u病理學(xué)檢查：病理學(xué)檢查：陽性率低，對取材有較高要求，有創(chuàng)傷，對肉芽腫性病變需進(jìn)一步鑒別。u分子生物學(xué)診斷 PCRu影像學(xué)檢查6 免疫學(xué)診斷PPD皮膚試驗 抗體檢測 假陽性率高 48-72h讀取結(jié)果 敏感性、特異性差 7WHO關(guān)于血清學(xué)檢測聲明n2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式聲明，要求禁止將血清學(xué)檢測方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。WHO warns against the use of inaccurate

4、 commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB. A substandard test with unreliable results TB can be wrongly diagnosed A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice Problems of misdiagnosis The inaccurate serological tests are costly Selling substandard test

5、s with unreliable results8 細(xì)菌學(xué)診斷抗酸染色涂片 分枝桿菌培養(yǎng) 陽性率低 含菌量1萬/mL痰液 需時4-6周 9快速培養(yǎng)系統(tǒng)1. BD BACTEC MGIT 960培培養(yǎng)系統(tǒng)養(yǎng)系統(tǒng) 2. BacT ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng) 10分子生物學(xué)診斷實時熒光定量PCR技術(shù)：HRM 線性探針耐多藥檢測技術(shù)：HAIN技術(shù) 基因芯片 PCR 電離質(zhì)譜檢測技術(shù) 11病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查n陽性率低n對取材有較高要求，有創(chuàng)傷n對肉芽腫性病變需進(jìn)一步鑒別12影像學(xué)檢查n目前診斷活動性肺結(jié)核的重要手段，尤其是粟粒性肺結(jié)核n對潛伏性結(jié)核診斷價值不大n對肺外結(jié)核診斷價值不大13現(xiàn)有檢

6、測手段不能滿足臨床要求n假陰性：免疫力低下或HIV人群，新生兒、老弱人群，藥物影響；n假陽性：BCG接種人群，其它分支桿菌感染，交叉污染n肺外的結(jié)核感染無法明確診斷n抗癆治療療效無法評價n無法排篩結(jié)核感染，造成生物制劑或移植手術(shù)治療后病患免疫力下降，引發(fā)結(jié)核，形成醫(yī)療事故14主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用1521世紀(jì)結(jié)核檢測的重大突破n -干擾素釋放實驗（IGRAs)被商化（2006年），用于結(jié)核感染的檢測n將結(jié)核菌特異性抗原加入含受試者的血液標(biāo)本的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵化，如果受試者受到過MTB感染，那么被結(jié)核菌激活的記憶T細(xì)胞就會對這些

7、特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生增殖分化并釋放-干擾素n通過定量檢測-干擾素的釋放水平，來診斷MTB感染nT-SPOT.TB(結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗)16干擾素檢測陰性干擾素檢測陽性TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞 干擾素17基于基于T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理n結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫為主，結(jié)核感染為主，結(jié)核感染后體內(nèi)長期存在后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性抗原特異性的記憶性T細(xì)胞細(xì)胞n當(dāng)再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放當(dāng)再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放r r干擾干擾素素nr r干擾素干擾素是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答

8、中最重要是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子的細(xì)胞因子18基于基于T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理T-SPOT.TB技術(shù)：技術(shù)：n利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞（利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞（PBMC）中存）中存在結(jié)核特異性在結(jié)核特異性T T細(xì)胞細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核特異抗這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核特異抗原刺激后分泌原刺激后分泌r r干擾素而設(shè)計的干擾素而設(shè)計的T T細(xì)胞細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗免疫斑點(diǎn)試驗。n檢測外周血中受結(jié)核特異抗原刺激釋放檢測外周血中受結(jié)核特異抗原刺激釋放r r干擾素的干擾素的T T淋淋巴細(xì)胞，經(jīng)巴細(xì)胞，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色酶聯(lián)免疫顯色后，通

9、過后，通過ELISPOTELISPOT分析系統(tǒng)分析系統(tǒng) 對斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)，對斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)，1 1個斑點(diǎn)代表一個細(xì)胞，計算出抗原個斑點(diǎn)代表一個細(xì)胞，計算出抗原特異性細(xì)胞的頻率。特異性細(xì)胞的頻率。19基于基于T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理包包20基于基于T淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測結(jié)核感染的原理患者體內(nèi)存在針對MTB的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞患者體內(nèi)不含針對MTB的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞21T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高靈敏度高靈敏度 22T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內(nèi)容摘要內(nèi)容摘要受試者數(shù)受試者數(shù)量量文獻(xiàn)發(fā)表文獻(xiàn)發(fā)表活動性結(jié)核活動性

10、結(jié)核/ /靈靈敏度敏度將將T-SPOT.TB的檢測結(jié)果與最后通過涂片和培養(yǎng)確診的結(jié)果進(jìn)的檢測結(jié)果與最后通過涂片和培養(yǎng)確診的結(jié)果進(jìn)行比較。包括牛型結(jié)核桿菌和非洲型結(jié)核桿菌感染的患者。行比較。包括牛型結(jié)核桿菌和非洲型結(jié)核桿菌感染的患者。T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為97.2%。（。（CI 90.3-99.7%）72Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis(2005)；24: 529-536在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核受試者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核受試者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為96.6%。其中。其中29例免疫力低下患者，例免疫力低下患者，

11、T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為100%87Lee et al. ERJ 2006; 28:2430在確診病例（涂片或培養(yǎng)陽性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀在確診病例（涂片或培養(yǎng)陽性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀和抗癆治療有效）中，和抗癆治療有效）中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為90.3%，并且不，并且不受受CD4細(xì)胞數(shù)量影響。細(xì)胞數(shù)量影響。30Clark et al. Clin. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在經(jīng)痰培養(yǎng)或肺部病變組織病理活檢確診的結(jié)核患者中，在經(jīng)痰培養(yǎng)或肺部病變組織病理活檢確診的結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為92%。

12、140Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65在確診的肺結(jié)核患者和疑似肺外結(jié)核患者中，在確診的肺結(jié)核患者和疑似肺外結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的陽的陽性率性率94%。32Kim et al. Arch Intern Med.2007; 167;20:2255-2259在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，T-SPOT.TB的靈敏的靈敏度分別為度分別為94%和和95%。所有受試者中，所有受試者中，42%為肺外結(jié)核患者。為肺外結(jié)核患者。186Kim et al. Am J Med 2009；122, 189-195經(jīng)培

13、養(yǎng)確診、抗癆治療不超過經(jīng)培養(yǎng)確診、抗癆治療不超過2 2周的結(jié)核患者用周的結(jié)核患者用T-SPOT.TB檢檢測，陽性率測，陽性率98%（57/58）。）。58Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核患者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94%。32Dominguez et al Clin VaccImmunol 2008; 15;168-71在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核患者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動性結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94.1%。270Chee et al J Clin Micro

14、biol.2008; 46(6):1935-4023T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高特異性高特異性 ESAT-6CFP 10均來自結(jié)核分枝桿菌基因組均來自結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)區(qū)域域 僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（人型、牛型、非洲型）存在僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1區(qū)區(qū)基因基因 卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌缺失卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌缺失RD1區(qū)區(qū)基因基因（M.gordonaeM.gordonae、M.kansasiiM.kansasii、M.marinumM.marinum、M.szulgaiM.szulgai） T-SPOT.TB不會受卡介

15、苗接種及其他分枝桿菌的影響不會受卡介苗接種及其他分枝桿菌的影響 24T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內(nèi)容摘要內(nèi)容摘要受試者數(shù)受試者數(shù)量量文獻(xiàn)發(fā)表文獻(xiàn)發(fā)表特異性特異性用用T-SPOT.TB檢測檢測14例鳥分枝桿菌感染者，例鳥分枝桿菌感染者，13例陰性，例陰性，1例為例為臨界值，復(fù)查也為陰性。臨界值，復(fù)查也為陰性。14Adams et al Sc. J Inf. Dis.2008;40(3):196-203.經(jīng)過結(jié)核篩查的無癥狀的受試者，經(jīng)過結(jié)核篩查的無癥狀的受試者，T-SPOT.TB檢測結(jié)果全部為檢測結(jié)果全部為陰性，特異性陰性，特異性100%。47Clark et al. Clin

16、. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在德國用在德國用T-SPOT.TB對健康的衛(wèi)生保健工作者進(jìn)行篩查。僅對健康的衛(wèi)生保健工作者進(jìn)行篩查。僅1例陽性例陽性（1/95） ，為影像學(xué)工作者，接觸病人超過，為影像學(xué)工作者，接觸病人超過35年。年。 TST檢測假陽性結(jié)果檢測假陽性結(jié)果34% （32/95）。）。 95Barsegian et al. J of Hospital Inf 2008；69(1):69-76在接觸結(jié)核的健康醫(yī)務(wù)工作者和健康對照受試者中用在接觸結(jié)核的健康醫(yī)務(wù)工作者和健康對照受試者中用TST和和T-SPOT.TB檢測。檢測。155健康醫(yī)務(wù)工作者中，健康醫(yī)務(wù)工

17、作者中，TST陽性的陽性的27例，而例，而T-SPOT.TB僅僅3例陽性。健康對照組例陽性。健康對照組T-SPOT.TB全部陰性而全部陰性而TST有有3例陽性。例陽性。 218 Storla et al. BMC Infectious Diseases 2009,9:60 25T-SPOT.TB 的高特異性與靈敏度，給臨床準(zhǔn)確、快速的診斷結(jié)果 特異性美國FDA臨床研究數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國內(nèi)臨床研究數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度美國FDA臨床研究數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國內(nèi)臨床研究數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)26T-SPOT.T

18、B的臨床意義的臨床意義n基于結(jié)核抗原特異性基于結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞向病變部位集細(xì)胞向病變部位集中的特點(diǎn)，中的特點(diǎn)， T-SPOT.TB的檢測物已不局的檢測物已不局限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等也可用于對肺內(nèi)及肺外胸腹水、腦脊液等也可用于對肺內(nèi)及肺外結(jié)核的診斷。結(jié)核的診斷。n敏感性優(yōu)于敏感性優(yōu)于ADA、TB-DNA，約在，約在62-75%，特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。，特異性無統(tǒng)計學(xué)差異。27T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義n在結(jié)核病治療中的評價意義在結(jié)核病治療中的評價意義n效應(yīng)效應(yīng)T細(xì)胞隨結(jié)核桿菌的清除而消失，其陰細(xì)胞隨結(jié)核桿菌的清除而消

19、失，其陰性及陽性結(jié)果可作為評估治療效果的手段之性及陽性結(jié)果可作為評估治療效果的手段之一一 。 28T-SPOT.TB的缺點(diǎn)的缺點(diǎn)n仍有一定的假陽性及假陰性結(jié)果n實驗結(jié)果是對結(jié)核感染的判斷，陽性結(jié)果包括了活動性結(jié)核及潛伏性結(jié)核感染的可能，需要結(jié)合臨床來確診是否是結(jié)核病患者n不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床來判斷29主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用30病例1患者，男，35歲 患者于一月前開始無誘因下出現(xiàn)高熱、胸悶，動則氣急，無咳嗽，咯血，盜汗 。 胸片：兩肺（），右側(cè)胸腔積液，心包積液 心超：心包積液 心包穿刺：血性 診斷：腫瘤

20、？結(jié)核？細(xì)菌感染？ 31檢測結(jié)果外周血T-SPOT.TB：陽性 心包積液T-SPOT.TB：陽性 診斷：結(jié)核性心包炎 治療： INH、RFP、PZA、EMB、強(qiáng)的松 體會：診斷快速 心包積液結(jié)核培養(yǎng) 6周后報陽 32病例2患者，女性，60歲，浙江溫州人 主訴：反復(fù)發(fā)熱2月余，頭痛2周伴意識障礙2天 外院頭顱MRI見腦實質(zhì)內(nèi)彌漫性點(diǎn)狀、結(jié)節(jié)狀及環(huán)形病灶。 有皮肌炎史，外院予激素治療 33腰穿壓力250mmH2O，有核細(xì)胞420 x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L 隱球菌乳膠凝集試驗：陰性 34治療：抗細(xì)菌+抗結(jié)核美羅培南、利奈唑胺、異煙肼、利福平、

21、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治療，同時予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天7.5mg。 2天后患者體溫即平，意識障礙好轉(zhuǎn) 腦脊液T-SPOT.TB：陽性 診斷：傾向結(jié)核性腦膜腦炎 35五聯(lián)抗結(jié)核給予HRZE及左氧五聯(lián)抗結(jié)核 2周后，CSF分枝桿菌快速培養(yǎng)：陽性 3個月后： 36病例3女性，14歲，初中學(xué)生主訴：發(fā)熱1月余 患者5月初無明顯誘因下出現(xiàn)發(fā)熱，Tmax：39，以午后為著。伴頭暈、畏寒、盜汗，不伴寒戰(zhàn)、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退燒藥（具體藥物不詳），體溫可恢復(fù)正常，但午后體溫仍反復(fù) 2013-05-24患者就診，查血常規(guī)示：WBC: 4.7x109/L， N:43.2% 。查尿常規(guī)示：WBC:8-10個/HP，Pro(+)。考慮為尿路感染，予頭孢丙烯等抗感染治療，但仍出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，病程中，患者無尿頻、尿急、尿痛、腹脹、腹痛、腰痛等不適 2013-06-01予希刻勞0.5g及羅氏芬2.5g對癥治療后體溫有所好轉(zhuǎn)，但停藥后體溫仍上升 2013-06-09查肺CT示：左肺上葉炎性病變。增強(qiáng)CT示：左肺上葉