majun-基因工程-基因文庫的構(gòu)建 目的基因的獲取

1、第六章第六章 基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院基因文庫基因文庫基因文庫（gene librarygene library）也稱也稱DNADNA文庫，是指某一生物體全部或部文庫，是指某一生物體全部或部分基因的集合。具體來講，某個(gè)生物的基因組分基因的集合。具體來講，某個(gè)生物的基因組DNADNA或或cDNAcDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并通過一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的的陽性菌落（或噬菌體），所有菌落或噬菌體的集

2、合即為該生物的基因文基因文庫庫。用于基因克隆的用于基因克隆的DNADNA材料的來源材料的來源從特定組織提取的染色體基因組DNA-基因組文庫基因組文庫mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA拷貝-cDNAcDNA文庫文庫用于基因克隆的用于基因克隆的DNADNA材料的選擇材料的選擇如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列的結(jié)構(gòu)直接推導(dǎo)出來； 如果要研究的是控制基因表達(dá)活動(dòng)的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色體基因組DNA中獲得。 第一節(jié)第一節(jié) 基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫 (GENOMIC LIBRARY) 定 義：

3、某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體儲(chǔ)存于某一受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為該生物基因組的文庫。即指將某生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落或噬菌斑。目 的： a）分離有用的目的基因 b）保存某種生物的全部基因基因組基因組DNADNA文庫的類型文庫的類型構(gòu)建基因文庫的載體類型決定了插入片段的大小和用途。每類載體構(gòu)建基因文庫的載體類型決定了插入片段的大小和用途。每類載體適合構(gòu)建不同的基因文庫，滿足不同的研究目的。適合構(gòu)建不同的基因文庫，滿足不同的研究目的。1 1、質(zhì)粒文庫、質(zhì)粒文庫質(zhì)粒載

4、體是最早用于構(gòu)建基因組文庫的載體。質(zhì)粒載體是最早用于構(gòu)建基因組文庫的載體。質(zhì)粒載體所容納的外源質(zhì)粒載體所容納的外源DNADNA片段一般在片段一般在10kb10kb以內(nèi)。以內(nèi)。質(zhì)粒文庫一般應(yīng)用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。質(zhì)粒文庫一般應(yīng)用于構(gòu)建亞克隆文庫或亞基因組文庫。2 2、噬菌體文庫、噬菌體文庫噬菌體載體是噬菌體文庫中應(yīng)用最廣泛的載體，其利于用分子雜噬菌體載體是噬菌體文庫中應(yīng)用最廣泛的載體，其利于用分子雜交的方法進(jìn)行篩選，因此常用于構(gòu)建小基因組物種的基因克隆。交的方法進(jìn)行篩選，因此常用于構(gòu)建小基因組物種的基因克隆。M13M13單鏈?zhǔn)删w載體一般用于構(gòu)建單鏈?zhǔn)删w載體一般用于構(gòu)建BACBAC

5、和和PACPAC亞克隆文庫或亞克隆文庫或cDNAcDNA文庫。文庫。3 3、黏粒文庫（柯斯質(zhì)粒文庫）、黏粒文庫（柯斯質(zhì)粒文庫）黏粒載體與噬菌體載體類似。黏粒載體與噬菌體載體類似。主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組主要用于構(gòu)建小基因組物種的基因組DNADNA文庫。有時(shí)也用于構(gòu)文庫。有時(shí)也用于構(gòu)建大基因組物種的基因組建大基因組物種的基因組DNADNA文庫，利用他們?cè)诤Y選上的優(yōu)勢文庫，利用他們?cè)诤Y選上的優(yōu)勢來分離單個(gè)基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組來分離單個(gè)基因或構(gòu)建一定區(qū)間范圍的亞基因組DNADNA文庫。文庫。4 4、人工染色體文庫、人工染色體文庫也稱為大片段基因組也稱為大片段基因組DNADNA文庫

6、，容納的外源文庫，容納的外源DNADNA片段為片段為100kb-100kb-1Mb1Mb。主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組主要用于大基因組物種的基因克隆、物理圖譜構(gòu)建和基因組測序等。測序等。5 5、亞基因組文庫、亞基因組文庫亞基因組文庫亞基因組文庫是相對(duì)于基因組文庫提出的，文庫的對(duì)象不是是相對(duì)于基因組文庫提出的，文庫的對(duì)象不是全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組全基因組范圍，而是基因組的某一區(qū)段，如基因組DNADNA某一特某一特定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段。定大小酶切片段的組合、一條染色體或更小的區(qū)段。一般而言，亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種

7、基因一般而言，亞基因組文庫主要應(yīng)用在基因組較小的物種基因克隆和大基因組物種的后期研究?？寺『痛蠡蚪M物種的后期研究。文庫的代表性和隨機(jī)性文庫的代表性和隨機(jī)性為保證能從基因組文庫中篩選到某個(gè)特定的基因，基因組文為保證能從基因組文庫中篩選到某個(gè)特定的基因，基因組文庫必須具有一定的代表性和隨機(jī)性。庫必須具有一定的代表性和隨機(jī)性。代表性指文庫中所有克隆所攜帶的代表性指文庫中所有克隆所攜帶的DNADNA片段可以覆蓋整個(gè)基因片段可以覆蓋整個(gè)基因組，也就是說，可以從文庫中分離任何一段基因組組，也就是說，可以從文庫中分離任何一段基因組DNADNA。代表。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。性是衡量文庫質(zhì)量的一

8、個(gè)重要指標(biāo)。采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來打斷染色體采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來打斷染色體DNADNA，以保證克，以保證克隆的隨機(jī)性，使包裝每段基因組隆的隨機(jī)性，使包裝每段基因組DNADNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。一、原核生物基因組一、原核生物基因組DNADNA的提取的提取染色體DNA質(zhì)粒DNA要求：制備的DNA的長度為100-200kb，防止在制備過程中的機(jī)械斷裂二、基因組二、基因組DNADNA的不完全酶切的不完全酶切1、根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶 a) 四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256 b) 六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/10242、分

9、離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個(gè)基因： 10 kb b) 克隆基因族：99%對(duì)于人-珠蛋白基因的例子，N值應(yīng)是： N =（0.99）/1 -（ 1.5 100 / 3106 ） = 9.2 106基因組大小酶切片段大小文庫克隆子數(shù)的關(guān)系基因組大小酶切片段大小文庫克隆子數(shù)的關(guān)系例：期望值為例：期望值為0.99，插入片斷為，插入片斷為20kb的的 E.coli (4.6106 bp) 和和 human (3109 bp) 基因組基因組的克隆數(shù)的計(jì)算。的克隆數(shù)的計(jì)算。364.101 . 1)106 . 4/102(1ln)99. 01ln(coliEN594109 . 6)103/102(1

10、ln)99. 01ln(humanN三、酶切片段與克隆載體連接三、酶切片段與克隆載體連接、酶切片段的分離與純化、酶切片段的分離與純化低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段試劑盒回收目的片段2 2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段 (有效的范圍為10kb)載體可承載25kb DNA左右片段(有效的范圍為15 kb)Cosmid 載體可承載45kb DNA左右片段(有效的范圍為1同聚物加尾法：同聚物加尾法：cDNAcDNA和載體末端添加同聚物和載體末端添加同聚物質(zhì)粒質(zhì)粒載體載體酶切酶切CTGACGGACGTC加同聚物尾加同聚物尾CT

11、GACGGGGGGGGGGGGACGTC雙鏈雙鏈cDNA加同聚物尾加同聚物尾CCCCCCCCCC連接連接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化2 2 接頭法：在接頭法：在cDNAcDNA末端添加含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的接頭末端添加含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的接頭質(zhì)粒質(zhì)粒載體載體酶切酶切CTGACGGACGTC雙鏈雙鏈cDNA加接頭加接頭GACTGCTGACACGTCTGCAG連接連接酶切酶切CGACTGTGCAGC轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化3 3 銜接頭法：特殊的接頭，一端可以和銜接頭法：特殊的接頭，一端可以和cDNAcDNA平末端連接，另一端可以直接和酶切后平末端連接，另一端可以直接和酶切后的載體粘末端結(jié)合。的載體粘末端結(jié)合。質(zhì)粒質(zhì)粒載體載體酶切

12、酶切CTGACGGACGTC雙鏈雙鏈cDNA加接頭加接頭連接連接TCGACAGCTGACTGTGCAGTCGCCAGCG轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較基因組DNA文庫的優(yōu)點(diǎn)基因組DNA文庫包括了基因組的全部信息，如間隔序列、非轉(zhuǎn)錄區(qū)段序列等，能用于研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)與功能。CDNA文庫的優(yōu)點(diǎn)cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒等的基因組結(jié)構(gòu)研究及有關(guān)基因的克隆分離。cDNA文庫的篩選比較簡單易行。cDNA文庫可用于在細(xì)菌中能進(jìn)行表達(dá)的基因的克隆，直接應(yīng)用于基因工程操作。cDNA克隆還可用于真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)和功能研究?；蚪M文庫和基因組文庫和c

13、DNAcDNA文庫的擴(kuò)增和保存文庫的擴(kuò)增和保存保存保存-80度度轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)印NC膜膜噬菌體噬菌體123混合菌液混合菌落第七章第七章 目的基因的獲取目的基因的獲取生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院n基因工程或基因工程或DNADNA重組技術(shù)的目的是從生物體基因組中分離克重組技術(shù)的目的是從生物體基因組中分離克隆目的基因。隆目的基因。n目的基因獲得之后，通過基因工程要完成：目的基因獲得之后，通過基因工程要完成：1、確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能2、建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌3、將目的基因在體外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。n目的基因的克

14、隆戰(zhàn)略分為兩大類：目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。n目的基因用途很廣，主要有以下幾個(gè)方面：目的基因用途很廣，主要有以下幾個(gè)方面：研究該基因的全貌與內(nèi)涵，如詳細(xì)分析其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控。與正?；?qū)Ρ?，尋找異常基因的異常點(diǎn)，進(jìn)而探索疾病發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)理及治療對(duì)策。研究生物種系進(jìn)化與相關(guān)同源性。應(yīng)用某種基因大量表達(dá)，生產(chǎn)所需要的蛋白質(zhì)或多肽（如胰島素、干擾素等藥物）。在農(nóng)、林、牧、副、漁

15、業(yè)中，改造某些目的基因，以改良品種，促進(jìn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。建立基因療法院，選用某種正?；?引入患者體內(nèi)，對(duì)某些先天性遺傳疾病進(jìn)行治療。目的基因的獲取目的基因的獲取對(duì)于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個(gè)，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個(gè)目的基因在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。分離的基因分離的基因promoter or terminatorpromoter or terminator編碼區(qū)：只分離編碼區(qū)：只分離ORFORF操縱子：啟動(dòng)子、功能相關(guān)的編碼基因和終止子操縱

16、子：啟動(dòng)子、功能相關(guān)的編碼基因和終止子有功能的基因：啟動(dòng)區(qū)、編碼區(qū)和終止區(qū)有功能的基因：啟動(dòng)區(qū)、編碼區(qū)和終止區(qū)目的基因的分離和獲取目的基因的分離和獲取是基因工程研究和應(yīng)用的關(guān)鍵內(nèi)容是基因工程研究和應(yīng)用的關(guān)鍵內(nèi)容不同基因組類型的不同基因組類型的基因組大小基因組大小、基因組成基因組成和和基因排列基因排列各不相同各不相同根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，采用不同的途徑和方法分離目的基因。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求，采用不同的途徑和方法分離目的基因。直接分離法直接分離法化學(xué)合成法化學(xué)合成法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）分離法）分離法基于基因文庫的分離法基于基因文庫的分離法直接分離法（1 1）限制性核酸內(nèi)切酶

17、酶切分離法）限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法對(duì)已知序列的DNA分子；對(duì)已知定位的目的基因；其它DNA分子可與基因組文庫相結(jié)合；缺點(diǎn)：該方法適于從基因組簡單的生物體中分離目的基因，如病毒等（2 2）物理化學(xué)法）物理化學(xué)法根據(jù)基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等的差異，從生物基因組中分離目的基因。密度梯度離心法單鏈酶解法分子雜交法物理化學(xué)法物理化學(xué)法-密度梯度離心法：密度梯度離心法：其原理是GC含量高DNA片段的浮力密度較高，而富含AT的DNA片段的浮力密度低，利用密度梯度超速離心技術(shù)可以分離GC含量較高的目的基因片段。海膽基因組海膽基因組DNAGC含量含量63%的的rDNAR

18、E酶切酶切離心離心方射性標(biāo)記方射性標(biāo)記 mRNA 雜交雜交分離分離rRNA基因基因物理化學(xué)法物理化學(xué)法-單鏈酶解法：單鏈酶解法：DNA分子中某基因片段GC堿基含量高，則其熱穩(wěn)定性高，即其解鏈溫度（Tm）值就高。因此可通過控制解鏈溫度使富A=T區(qū)變性解鏈，而富GC區(qū)的DNA的片段不變性解鏈。然后通過S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA。GC63%rDNAGC63%rDNATm1Tm1Tm2Tm2Tm3Tm3Tm2Tm2：9797S1S1酶切酶切得到得到rDNArDNA1976年H.G. Khorana提出了用化學(xué)方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪

19、氨酸t(yī)RNA基因的論文?；瘜W(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。從反應(yīng)機(jī)理上來講，DNA化學(xué)合成有：1、磷酸二酯法2、磷酸三酯法3、亞磷酸液三酯法具體操作過程又有液相合成液相合成和固相合成固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計(jì)的化學(xué)合成法固相磷酸三酯合成過程DNA合成儀（1）戊糖上5羥基被DMT保護(hù)，3磷酸基團(tuán)其中一個(gè)單價(jià)的羥基被對(duì)氯苯保護(hù)，此外與固相支持物結(jié)合。（2）三氯乙酸處理，5羥基上DMT脫落，暴

20、漏5羥基。（3）合成DNA的原料與活化劑四氮唑混合，得到反應(yīng)活性很高的核苷亞磷酸活化中間體（其3端被活化，5-羥基的仍然被DMT保護(hù)），與固定在支持物上的核苷酸的5-羥基發(fā)生縮合反應(yīng)。（4）縮合反應(yīng)中可能極少數(shù)5-羥基沒有參加反應(yīng)，帶帽反應(yīng)中使用乙酸酐和1-甲基咪唑使這些核苷5-羥基反應(yīng)形成酰，終止其繼續(xù)發(fā)生反應(yīng)而成為短片段，這種短片段在純化時(shí)分離掉；化學(xué)合成DNA片斷的組裝化學(xué)合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。長片段的化學(xué)合成方法：1、互補(bǔ)連接法：、互補(bǔ)連接法：預(yù)先設(shè)計(jì)合成的片斷之間都有互補(bǔ)區(qū)域，不同片斷之間的互補(bǔ)區(qū)域能形成有斷點(diǎn)的完整雙鏈。用T4多核苷酸激酶使各個(gè)片段的5端帶上磷酸。T4 DNA連接酶將不同的互補(bǔ)片段連接。T4 DNA連接酶T4多核苷酸激酶使5-OH磷酸化完整的DNA雙鏈2. 互補(bǔ)延伸連接法互補(bǔ)延伸連接法預(yù)先設(shè)計(jì)的片斷之間有局部互補(bǔ)區(qū)，可以相互作為另一個(gè)片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。355353T4DNA連接酶Klenow片段引物PCR擴(kuò)增獲得目的基因PCR 可以把 數(shù)量放大染色體PCR 基因放大連瑣反應(yīng)基因文庫、CDNA文庫獲取目的基因大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個(gè)重組克隆