粘性放線菌菌毛生物性能的研究Ⅲ.粘性放線菌菌毛粘附與凝集活性

1、    粘性放線菌菌毛生物性能的研究.粘性放線菌菌毛粘附與凝集活性的研究        摘要目的:了解粘放菌兩種菌毛在粘附牙面和與血鏈球菌34凝集中的生物活性。方法:采用粘放菌型和型菌毛提取物及兩種抗菌毛抗體,通過它們對粘放菌粘附唾液包被的羥磷灰石(SHA)的抑制實驗來判斷兩種菌毛的粘附活性,通過粘放菌與血鏈球菌34的凝集實驗及兩種抗菌毛抗體對凝集反應(yīng)的抑制實驗來確定兩種菌毛的凝集活性。結(jié)果:粘放菌型和型菌毛提取物及兩種抗菌毛抗體均能抑制粘放菌對SHA的粘附;只有型菌毛能間接

2、引起肉眼可見的血鏈球菌34的凝集反應(yīng),抗型菌毛抗體能抑制凝集反應(yīng),抗型菌毛抗體無此抑制作用。結(jié)論:型和型菌毛均有粘附性能;型菌毛有凝集性能,型菌毛無凝集性能;本課題所采用的菌毛分離法未破壞菌毛的生物活性。關(guān)鍵詞粘性放線菌菌毛粘附凝集A Study on Biological Properties of Fimbriae of A.viscosus. Adherence Activity of Fimbriae of A.viscosusLiu Tianjia, Li Wen, Yue SonglingCollege of Stomatology, West China University o

3、f Medical SciencesAbstractObjective: To investigate the adherence activity of two types of fimbriae of A.viscosus on tooth surface or with S.sanguis 34. Methods: The inhibited adherence tests, coaggregation tests and the inhibited coaggregation tests were done. Results: The purified type and type fi

4、mbriae inhibited the adherence of A. viscosus to salivary-treated hydroxyapatite (SHA) and the two specific IgG to type and type fimbriae blocked the adsorption of strain T14V, strain 5519 and strain 5951 to SHA; Only type fimbria indirectly mediated the visible agglutintion of S. sanguis 34 and onl

5、y IgG to type fimbriae inhibited coaggregation of strain T14V and strain 5915 with S. sanguis 34. Conclusion: Type and type fimbriae have adherence ability, and only type fimbria has the agglutination activity. Additionally, the methods which were used to prepare fimbriae don't damage the biolog

6、ical activity of fimbriae.Key words:A.viscosusS.sanguisfimbriaeadherecoaggregation菌斑是導(dǎo)致口腔內(nèi)兩大常見病齲病和牙周病的始動因子。粘性放線菌(以下簡稱粘放菌)是菌斑的主要成員。許多研究結(jié)果表明1,2,粘放菌的致病作用與其表面菌毛有關(guān)。粘放菌有兩種功能及抗原性均不同的菌毛:型菌毛和型菌毛。它們在粘放菌粘附到牙面和凝集一些鏈球菌的過程中起著非常重要的作用2,3。因此,本實驗?zāi)康闹荚诹私庹撤啪鷥煞N菌毛在粘附牙面和與血液鏈球菌34(簡稱血鏈球菌34)凝集中的生物活性。1材料和方法1.1實驗菌株及培養(yǎng)條件粘放菌5519(

7、1+2-)、5951(1-2+)、T14V(1+2+)和血鏈球菌34均由上海第二醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所劉正教授惠贈。粘放菌的培養(yǎng)條件見參考文獻4。血鏈球菌34的培養(yǎng)條件與粘放菌相同。1.2抗體的制備制備抗體參見參考文獻5,并采用DEAE-纖維素層析法分別提取抗型菌毛IgG和抗型菌毛IgG。1.3菌毛對粘放菌粘附唾液包被羥基磷灰石(SHA)的抑制1.3.1菌毛的制備制備菌毛參見參考文獻4。分別取兩種菌毛提取過程中三個階段的提取物:上清粗提物、20%硫酸銨沉淀物和純化菌毛。用KCl緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度,均為1.0 mg/ml(考馬斯亮藍法測定)。1.3.2唾液的收集不加任何刺激物的條件下,取一志愿者

8、的全唾液,室溫下,10000 r/min離心10分,取上清,備用。1.3.3粘附抑制實驗40孔酶標板,每孔稱取4 mg羥基磷灰石(HA),KCl緩沖液浸泡過夜。空白對照組加入KCl緩沖液(100 l/孔)。實驗組和陽性對照組加入全唾液(100 l/孔),室溫下旋轉(zhuǎn)1小時,形成SHA。KCl緩沖液洗滌2次。加入含5 mg/ml牛血清白蛋白的KCl緩沖液100 l/孔,旋轉(zhuǎn)1小時以封閉唾液未覆蓋的HA表面。洗滌后,實驗組分別加入上述兩種菌毛三個階段提取物的蛋白溶液(100 l/孔)。旋轉(zhuǎn)1小時,洗滌2次后,實驗組、陽性對照組、空白對照組分別加入3H-胸苷標記的細菌5519、5951(OD540 n

9、m=0.4,100 l/孔),旋轉(zhuǎn)1小時,洗滌3次,將HA轉(zhuǎn)入閃爍瓶,閃爍計數(shù)。所有實驗均重復(fù)兩次,取均數(shù)。計算粘附相對百分率及粘附抑制率。1.4抗體對粘放菌粘附SHA的抑制實驗方法同1.3.3。先形成SHA。每孔分別加入3H-胸苷標記的三種菌液(5519、5951、T14V)(OD540 nm=0.8,50 l/孔),再分別在各孔中加入三種抗體:抗型菌毛IgG(即IgG,50 l,50 g/ml),抗型菌毛IgG(即IgG,50 l,50 g/ml),IgG和IgG(各25 l,50 g/ml)。以上實驗均重復(fù)2次,取均數(shù),計算粘附抑制率。1.5菌毛介導(dǎo)血鏈球菌34的凝集1.5.1菌毛的制備

10、菌毛制備見參考文獻4。取純化的型菌毛和型菌毛,用凝集緩沖液(5 mmol/L磷酸鉀鹽,0.1 mmol/L CaCl2,50 mmol/L NaCl,pH8.0)調(diào)節(jié)蛋白濃度,均為1 mg/ml(考馬斯亮藍法)。1.5.2凝集實驗直接凝集實驗:各取兩種菌毛溶液25 l于清潔玻片上,分別加入25 l血鏈球菌34(OD650 nm=1.0),室溫下充分混勻,放置30分1小時,肉眼觀察結(jié)果并記錄。間接凝集實驗:各取兩種菌毛溶液25 l于清潔玻片上,分別加入10 l抗5519抗血清和抗5951抗血清,混勻數(shù)分鐘后,分別加入25 l血鏈球菌34,充分混勻,放置30分1小時,肉眼觀察結(jié)果并記錄。1.6抗體

11、對粘放菌與血鏈球菌34凝集的抑制分別吸取粘放菌5951、T14V菌液于3支試管中(OD650 nm=1.0,1 ml/支),兩種菌液的各3支試管中分別加入IgG(50 g/ml,1 ml)、IgG(50 g/ml,1 ml)、IgG和IgG(50 g/ml各0.5 ml),充分混勻數(shù)分鐘后,離心,棄上清。吸附過抗體的細菌加入凝集緩沖液1 ml/支,振動打散細菌后分別加入1 ml血鏈球菌34(OD650 nm=1.0)。陽性對照為未吸附過抗體的粘放菌5951和T14V(1 ml/支),分別加入1 ml血鏈球菌34。陰性對照為粘放菌5951、T14V、血鏈球菌34菌液各2 ml。將菌懸液在試管內(nèi)充

12、分混勻,室溫靜置30分鐘1小時,取上層菌液0.6 ml,測定OD650 nm值。所有實驗均重復(fù)2次,取均數(shù),計算凝集百分率及凝集抑制率6。2結(jié)果2.1兩種菌毛在粘放菌粘附SHA中的作用兩種菌毛提取過程中不同階段提取物對粘放菌粘附SHA均有不同程度的抑制,見表1。同時表明,隨著菌毛純化程度的增加,對粘放菌粘附SHA的抑制率也相應(yīng)增加。表1不同純化階段、型菌毛提取物對粘放菌粘附SHA的影響菌株(菌毛表達)粘附抑制率(%)*上清粗提物20%硫酸銨沉淀物純化菌毛5519(1+2-)6.914.431.25951(1-2+)6.412.328.6注以空白對照組的粘附為100%,計算陽性組、實驗組的粘附相

13、對百分率抗型菌毛IgG和抗型菌毛IgG對粘放菌粘附SHA的影響結(jié)果見表2。結(jié)果表明:單一的抗型菌毛IgG或抗型菌毛IgG能抑制有相應(yīng)菌毛的粘放菌變異株對SHA的粘附,不能完全抑制有兩種菌毛的粘放菌T14V對SHA的粘附;當兩種抗體共同作用時,則對粘放菌T14V的粘附抑制率明顯增加。表2抗菌毛抗體對粘放菌粘附SHA的影響菌株(菌毛表達)粘附抑制率(%)IgGIgGIgG+IgG5519(1+2-)85.614.2/5951(1-2+)12.175.6/T14V(1+2+)31.616.571.22.2兩種菌毛在粘放菌與血鏈球菌34凝集反應(yīng)中的作用當純化菌毛直接與血鏈球菌34作用時,兩種菌毛不能引

14、起血鏈球菌34肉眼可見的凝集。當純化型菌毛與相對應(yīng)的抗5951抗血清形成免疫復(fù)合物后,引起血鏈球菌34的凝集;而純化型菌毛采用同樣的處理方法,則無此現(xiàn)象?？剐途贵w對有兩種菌毛的粘放菌T14V與血鏈球菌34的凝集反應(yīng)無影響,而抗型菌毛抗體對粘放菌5951、T14V與血鏈球菌34的凝集反應(yīng)有明顯抑制作用(表3)。 表3抗菌毛抗體對粘放菌與血鏈球菌34凝集反應(yīng)的影響菌株(菌毛表達)凝集抑制率(%)*IgGIgGIgG+IgG5951(1-2+)095.6/T14V(1+2+)085.629.3*3討論粘放菌在口內(nèi)主要定植于牙面,特別是根面,而且加速菌斑的形成,這與粘放菌菌毛的生物性能密切相關(guān)。早

15、期研究1表明,粘放菌菌毛在粘放菌粘附牙面中有著重要的作用。Clark等7通過抗粘放菌T14V型菌毛的抗體能抑制粘放菌對SHA的粘附,且能促進已粘附于SHA上的粘放菌解吸附,而抗型菌毛的抗體無此作用,認為型菌毛介導(dǎo)粘放菌粘附于SHA,型菌毛與粘附SHA無關(guān)。Cisar等8研究也認為型菌毛具有對SHA的粘附性能,型菌毛對SHA呈弱或無粘附現(xiàn)象。但最近,Strmberg等9研究認為型菌毛以一種對GalNAc敏感的方式介導(dǎo)放線菌對SHA的粘附。趙麗娟等10研究表明,牙面獲得性膜中,既有型菌毛受體,又有型菌毛受體。兩種菌毛共同參與粘放菌對牙面的粘附,不同菌毛上粘結(jié)素作用于獲得性膜上不同的位點。本實驗首先

16、采用提取的兩種菌毛分別進行粘附抑制實驗。在菌毛與SHA充分作用后,再加入粘放菌。結(jié)果顯示,兩種菌毛均對粘放菌粘附SHA有抑制作用。說明SHA上部分位點被事先加入的菌毛所占據(jù),使后加入的粘放菌粘附量下降。由此可判斷,兩種菌毛均具有對SHA的粘附性能。進一步進行抗體對粘放菌粘附SHA的抑制實驗,則再次證實兩種菌毛均能介導(dǎo)粘放菌粘附于牙面。關(guān)于菌毛在粘放菌與某些血鏈球菌凝集反應(yīng)中的生物活性研究,本實驗首先采用提取的菌毛直接與血鏈球菌34作用。發(fā)現(xiàn)兩種菌毛均沒有引起血鏈球菌34的肉眼可見的凝集,但當型菌毛與抗5951抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物后,就引起血鏈球菌34的凝集,型菌毛仍無此作用。此實驗結(jié)果與Ci

17、sar等11研究結(jié)果一致。一方面,說明型菌毛有凝集活性,型菌毛無;另一方面表明,單個型菌毛與血鏈球菌34是單價結(jié)合,結(jié)合力較弱,故不能產(chǎn)生肉眼可見的血鏈球菌34的相互凝集,而當型菌毛與相應(yīng)的抗全菌細胞抗體形成免疫復(fù)合物后,與血鏈球菌34的凝集反應(yīng)成為多價結(jié)合。因此,引起肉眼可見的血鏈球菌34的凝集現(xiàn)象。采用抗體抑制凝集反應(yīng)的實驗,也間接證明了型菌毛的凝集性能。實驗結(jié)果與Revis等12研究結(jié)果一致?？剐途獻gG能抑制粘放菌5951、T14V與血鏈球菌34的凝集,而抗型菌毛抗體無此作用。本實驗同時證實了,本文所采用的菌毛分離法即機械攪動法4,未破壞菌毛的生物活性。國外采用的4種菌毛分離法(勻漿

18、法、壓擠法、酶解法、超聲法)均已證明不會破壞菌毛的抗原性。但超聲法制備的菌毛,未見報道其能進行粘附競爭實驗,可能是超聲波破壞了菌毛的生物活性13。只有French壓榨機壓擠法得到的菌毛進行了競爭抑制實驗,說明此方法得到的菌毛,其粘附性能仍然存在14。壓擠法和機械攪動法,均是機械處理,故未引起菌毛蛋白質(zhì)變性和構(gòu)型的改變,菌毛的粘附活性仍然存在。雖然對型菌毛和型菌毛的生物性能有了初步認識,但關(guān)于型菌毛和型菌毛上與粘附有關(guān)的粘結(jié)素,目前仍不清楚,尚需進一步探索。本課題為國家自然科學(xué)基金資助項目(編號 39270717)作者單位:華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院610041參考文獻1Wheeler TT, Cl

19、ark WB, Birdsell DC. Adherence of Actinomyces viscosus T14V and T14AV to hydroxyapatite surfaces in vitro and human teeth in vivo. Infect Immun, 1979,25(3):106610742Cisar JO, Curl SH, Kolenbrander PE, et al. Specific absense of type 2 fimbriae on a coaggregation-defective mutant of Actinomyces visco

20、sus T14V. Infect Immun, 1983, 40(2):7597653Cisar JO, Barsumian EL, Curl SH, et al. Detection and localization of a lectin on Actinomyces viscosus T14V by monoclonal antibodies. J Immunol, 1981, 127(4):131813224李文,劉天佳,章崇杰,等.粘性放線菌菌毛生物性能的研究.粘性放線菌菌毛的提取.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,17(1):69715李文,劉天佳,章崇杰,等.粘性放線菌菌毛生物性能的研

21、究.粘性放線菌兩種菌毛的化學(xué)組成的分析.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,17(2):1661686McIntire FC, Vatter AE, Baros J, et al. Mechanism of coaggregation between Actinomyces viscosus T14V and Streptococcus sanguis 34. Infect Immun, 1978, 21(3):9789887Clark WB, Wheeler TT, Cisar JO. Specific inhibition of adsorption of Actinomyces viscosus

22、 T14V to saliva-treated hydroxyapatite by antibody against type 1 fimbriae. Infect Immun, 1984, 43(2):4975018Cisar JO, Vatter AE, Clark WB, et al. Mutants of Actinomyces viscosus T14V lacking type1, type2, or both types of fimbriae. Infect Immun, 1988, 56(11):298429899Strmberg N, Boren T, Carlen A, et al. Salivary receptors for GalNAc -sensitive adherence of Actinomyces spp: evidence for heterogeneous GalNAc and prolin-rich protein receptor properties. Infect Immun, 1992, 60(8):327832861