實(shí)驗(yàn)十 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)

1、實(shí)驗(yàn)十 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的技術(shù)和原理；2. 掌握用此法分離蛋白質(zhì)組分的操作方法。【實(shí)驗(yàn)原理】在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和基因（遺傳）工程實(shí)驗(yàn)中，常常要進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的分離工作。聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸分離的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱ACR）和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 簡稱BIS）在催化劑的作用

2、下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，用于分離分子量大小不同的物質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：催化劑采用過硫酸銨，加速劑為N,N,N,N四甲基乙二胺（簡稱TEMED）。通?？刂七@二種溶液的用量，使聚合在1小時(shí)內(nèi)完成。（2）光聚合：通常用核黃素為催化劑，通過控制光照時(shí)間、強(qiáng)度控制聚合時(shí)間，也可加入TEMED加速反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續(xù)的凝膠（僅有分離膠）電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。一般地，不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）； 凝膠的分子

3、篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）。濃縮效應(yīng)（濃縮膠與分離膠中聚丙烯酰胺的濃度及pH的不同，即不連續(xù)性所致）。因此，樣品分離效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，簡稱SDS）是陰離子表面活性劑，它能以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這時(shí)，蛋白質(zhì)即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別降低仍至消除。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨于一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的電泳遷移率的差異，僅僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。另外，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原

4、劑 （巰基乙醇）存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵被打開，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)聚合法制膠，進(jìn)行不連續(xù)的凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)快速染色，以分離和鑒定大腸桿菌菌體、發(fā)酵液中和純化的蛋白產(chǎn)物?！驹噭┡c器材】（一）試劑（(全班分兩大組，每組配一份，如15組一份，610組一份)（1）30% 的凝膠貯備液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于 100 mL去離子水中，用3號新華濾紙過濾至棕色瓶中，4 避光貯存（1）。（2）3

5、mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddHO 至100 mL）（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 6.05g Tris base 溶于40mL ddHO中，加1mol/L HCl 48mL, 加水補(bǔ)至100mL.（4）5×Tris-甘氨酸電泳buffer（pH8.3):（配1L） Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用時(shí)稀釋5倍）。（5）10% SDS:：稱10克SDS溶解于100mL去離子水中，貯存于室溫中。（6）TE

6、MED（四甲基乙二胺）：濃度10%，20 mL (全班共用)，4保存。（7）10% AP（過硫酸銨）：10 mL，新鮮配制，分裝至1.5mL 離心管中，20保 存待用（2）。（8）樣品溶解液：內(nèi)含1% SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL緩沖液。 * 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液：稱Tris 0.6g ，加入50 ml重蒸水，再加入約3 ml 1mol/L HCL,調(diào)pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml*按下表配制樣品溶解液：*如樣品為液體，則應(yīng)用濃一倍的樣品溶解液，然后等體

7、積混合。*或配制2 X SDS樣品緩沖液：   100mmol/L    Tris-HCl (pH6.8)            200mmol/L    DTT                 4%     

8、      SDS                  0.2%        溴酚藍(lán)                   20% 

9、        甘油必要時(shí)加入少量（1%）巰基乙醇。（9）考馬斯亮藍(lán)染色液(3)：0.05 g考馬斯亮藍(lán)R250溶于25 mL異丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用濾紙過濾除去不溶物。（10）0.1%溴酚藍(lán)指示劑（全班共用）（11）脫色液：75 mL冰乙酸 + 50 mL甲醇 + 875 mL H2O（若只配500 mL，各物質(zhì)減半）（二）器材 電泳儀 垂直板電泳槽，電泳板微量進(jìn)樣器（50L） 染色/脫色搖床。【操作方法】1.膠板模型的安裝：在干凈的凹形玻璃板的三條邊上放好塑料條（有些型號的電泳板已有固定的

10、隔板），然后將另一塊玻璃板壓上，用夾子夾緊（或裝在制板模型中），在兩塊板之間滴上熱融的10 瓊脂糖凝膠封邊（4）。2.分離膠的制備10 ml，可供兩塊板( 11cm x10 cm)使用用手輕搖混勻, 小心將混合液注入準(zhǔn)備好的玻璃板間隙中，為濃縮膠留足夠的空間（2.5cm）,輕輕在頂層加入幾毫升去離子水覆蓋，以阻止空氣中氧對凝合的抑制作用。剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全，整個(gè)過程約需30分鐘（25室溫）。3.濃縮膠的制備：先把已聚合好的分離凝膠上層的水吸去，再用濾紙吸干殘留的水液。 按下列配方制備各種體積的濃縮膠溶液：混合后

11、將其注入分離膠上端，插入梳子，小心避免氣泡的出現(xiàn)。4.在濃縮膠聚合的同時(shí)，將蛋白樣品與2x樣品緩沖液等體積混合，置沸水或微量恒溫器（100）中加熱3分鐘，馬上插入冰上冷卻待用。5.濃縮膠聚合完全后，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入1X電泳緩沖液，小心地拔出梳子，用移液器沖洗梳孔，檢查有無漏，并驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。6.按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，所加樣品混合液體積要根據(jù)樣品蛋白濃度而定，一孔加一個(gè)樣品，同時(shí)用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對照。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中需要分離鑒定的是純化的GFP蛋白，點(diǎn)樣樣品和次序包括：蛋白Marker   &

12、#160;                    pUC18細(xì)菌總蛋白                        pGFP未誘導(dǎo)總蛋白  

13、0;                     pGFP加Glu及IPTG誘導(dǎo)總蛋白                        pGFP加IPTG誘導(dǎo)破菌后上清總蛋白&

14、#160;                       層析時(shí)的穿流峰（雜蛋白）                        層析時(shí)的洗滌峰I

15、60;                       層析時(shí)的洗滌峰II                       GFP對照7.電泳：開始時(shí)電壓為58V/cm

16、（約100V）凝膠，待染料濃縮成一條線開始進(jìn)入分離膠后，將電壓增到1012V/cm（約180V）凝膠，繼續(xù)電泳直到染料（溴酚藍(lán)）抵達(dá)分離膠底部，斷開電源。8.剝膠：取下膠板，從底部一側(cè)輕輕撬開玻璃板，用手術(shù)刀切去濃縮膠，并切去一小角作記號。9.固定及染色：取下凝膠放入大培養(yǎng)皿，用考馬斯藍(lán)染色液染色并固定，最好放在搖床緩慢旋轉(zhuǎn)1-2小時(shí)。10.脫色：先用水洗去染料，再放入脫色液中浸泡，更換脫色液3-4次，約4-8小時(shí)或過夜。11.將脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)分離色帶照相或干燥，也可無限期地用塑料袋封閉在含20%甘油的水中?！咀⒁馐马?xiàng)與提示】（1)丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺具有神經(jīng)毒性，因此稱量時(shí)要戴手套

17、。兩者聚合后即無毒性，但為避免接觸少量可能未聚合的單體，所以建議在配膠和制板過程中都要帶上手套操作。另外，配好的溶液之所以要避光保存，是因?yàn)榇巳芤阂姽鈽O易脫氨基分解為丙烯酸和雙丙烯酸。（2）過硫酸銨極易吸潮失效，因此要密閉干燥低溫保存。配好的10過硫酸銨要分裝冷藏。（3）考馬斯亮藍(lán)R-250(三苯基甲烷）染色: 每分子含有兩個(gè)SO3H 基團(tuán)，偏酸性，結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)上。與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色。檢測靈敏度約為0.20.5ug。也可用銀染色：將蛋白帶上的硝酸銀還原成金屬銀、以使銀顆粒沉積在蛋白帶上。此法比考馬斯亮藍(lán)靈敏兩個(gè)數(shù)量級，但步驟較復(fù)雜。（4）制備聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，倒膠后常漏

18、出膠液，那是因?yàn)槎K玻璃板與塑料條之間沒封緊，留有空隙，所以這步要特別留心操作。有些型號的電泳板可在模型中直接安裝，免去了封邊和拆邊的麻煩，還可以同時(shí)制備多塊凝膠。（5）AP和TEMED是催化劑，加入的量要合適，過少則凝膠聚合很慢甚至不聚合，過多則聚合過快，影響倒膠。為避免過快聚合，可將加了催化劑的凝膠先放在冰中。（6）加熱使蛋白質(zhì)充分變性。（7）用移液器沖洗梳孔可將空中的凝膠除去，以免點(diǎn)樣孔不平齊或影響蛋白樣品的沉降。（8）兩玻璃板間凝膠底部的大氣泡可阻斷電流，因此必須除去。（9）總量一般不超過20l，如果點(diǎn)樣量太多溢出梳孔，就會污染旁邊泳道。要根據(jù)樣品濃度來加樣品溶解液。每點(diǎn)一個(gè)樣品后換一支吸頭或清洗吸頭后再點(diǎn)另一個(gè)樣品。（10）電泳時(shí)間要依據(jù)所用電壓及待測蛋白分子量大小而定。（11）電泳完畢撬板取凝膠時(shí)要小心細(xì)致，不能在凹形板雙耳處撬，也不能用死力弄壞玻璃板。（12）考馬斯亮藍(lán)染色液蓋過凝膠即可，染色后染色液要回收，可重復(fù)使用多次。（13）脫色過夜可使背景更干凈，譜帶更清晰?！緦?shí)驗(yàn)安排】本實(shí)驗(yàn)試劑配制和電泳可在一天內(nèi)