實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞內(nèi)糖原蛋白質(zhì)及核酸的顯示

1、   實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞內(nèi)糖原、蛋白質(zhì)及核酸的顯示         實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉糖原、蛋白質(zhì)、核酸在細(xì)胞內(nèi)的主要存在部位。 2.了解細(xì)胞內(nèi)糖原、蛋白質(zhì)、核酸顯示的原理和方法。 3.進(jìn)一步掌握顯微鏡的使用方法。       實(shí)驗(yàn)用品1.材料：土豆、洋蔥、肝糖原切片、蟾蜍。 2.器材：顯微鏡、載（蓋）玻片、刀片、小鑷子、解剖剪刀、染色缸、染色架。 3.試劑：革蘭氏碘液、5%三氯醋酸、固綠染液、甲基綠·派洛寧染液、carno

2、y固定液、酒精、丙酮。         實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法   一、糖原淀粉的顯示（一）原理糖原和淀粉是生物有機(jī)體生命活動(dòng)能量的主要來(lái)源。淀粉是一種植物多糖，貯藏于植物的種子、塊莖、塊根中。淀粉遇碘呈藍(lán)色，這是由于碘被吸附在淀粉上，形成一復(fù)合物碘化淀粉。碘化淀粉是不穩(wěn)定的，極易被醇、氫氧化鈉和熱分解，因而使顏色褪去。其它多糖大多能與碘呈特異的顏色反應(yīng)，這些呈色物質(zhì)不穩(wěn)定。糖原又稱動(dòng)物淀粉，是動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)貯藏能量的多糖類物質(zhì)。在肝臟中尤為豐富。可用過(guò)碘酸雪夫試劑反應(yīng)（periodic acid

3、 schiff reaction），簡(jiǎn)稱pas反應(yīng)檢測(cè)。含乙二醇基的多糖在高碘酸的作用下氧化而產(chǎn)生雙醛基，醛基進(jìn)而與schiff氏液反應(yīng)，使其中的無(wú)色品紅變成紫紅染料而附于含糖的組織上，著色的部分即為肝糖原。（二）試劑配制革蘭氏碘液：稱碘化鉀1g，溶于50ml蒸餾水中，再加0.5g碘使之溶解。最后用蒸餾水稀釋至150 ml，盛于棕色瓶?jī)?nèi)，保存暗冷處。（三）方法1. 淀粉（1）馬鈴薯徒手切片。（2）取一薄片放在載玻片上，用吸管吸取革蘭氏碘液一滴于馬鈴薯薄片上，蓋上蓋玻片。（3）置光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察?？梢?jiàn)在多角形的薄壁細(xì)胞中，有許多橢圓形藍(lán)色的顆粒，即為淀粉粒。2. 糖原：在光鏡下觀察肝糖原切

4、片（schiff氏反應(yīng)肝組織切片），可見(jiàn)肝細(xì)胞略呈多角形，中央有12個(gè)染成藍(lán)色圓形的細(xì)胞核。在細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)許多紫紅色的小顆粒，即為肝糖原，如圖2-1。圖 2-1 肝細(xì)胞的糖原1.糖原顆粒  2.細(xì)胞核二. 細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白質(zhì)和堿性蛋白質(zhì)的顯示（一）原理蛋白質(zhì)的基本組成單位是氨基酸，是兩性電解質(zhì)。隨著溶液ph值的不同，蛋白質(zhì)可離解為正離子、負(fù)離子或兩性離子，如果在某一ph值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上所帶的正、負(fù)電荷總數(shù)相等，在電場(chǎng)中既不向正極移動(dòng)也不向負(fù)極移動(dòng)，這時(shí)溶液的ph值即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。由于蛋白質(zhì)的游離基團(tuán)除了末端氨基和末端羧基外，還有許多側(cè)鏈，其上許多集團(tuán)在溶液中也可以電離，因此，一

5、個(gè)蛋白質(zhì)分子表面四周都有電荷。不同蛋白質(zhì)分子所帶有的堿性氨基酸和酸性氨基酸的數(shù)目不等，它們的等電點(diǎn)也不一樣。因此蛋白質(zhì)分子所帶的靜電荷既受所在溶液的ph值的影響，也取決于蛋白質(zhì)分子組成中堿性氨基酸和酸性氨基酸的含量。在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷多，為酸性蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)偏向酸性）；帶正電荷多，為堿性蛋白質(zhì)（等電點(diǎn)偏向堿性）。所以，用不同ph值的固綠染液（一種弱酸性染料，本身帶負(fù)電荷）對(duì)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)染色，可使細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白分別顯示。（二）試劑配制1. 5%三綠醋酸液：稱取2.5g三綠醋酸溶于50ml蒸餾水中。2. 染色液：（1）三種母液（實(shí)驗(yàn)前配制）a：0.2%固綠染液：取0.2

6、%固綠溶于100ml蒸餾水中。b：1/75 mol/l hcl (稀釋一倍后ph值為2.02.5)：取12mol/l的濃鹽酸0.11ml加入到98.89ml蒸餾水中混勻。c：0.05%碳酸鈉溶液（稀釋一倍后ph值為8.08.5）：稱取50mg碳酸鈉（na2co3）溶于100 ml蒸餾水中，混勻。（2）兩種蛋白質(zhì)染液（實(shí)驗(yàn)時(shí)混合）甲液：0.1%酸性蛋白固綠染液：母液a+b (11)， 即為0.1%酸性固綠染液。（1/150 mol/l hcl ph值為2.02.5）。乙液：0.1%堿性蛋白固綠染液：母液a+c（11），即為0.1%堿性固綠染液（0.025% na2co3  ph值為8.

7、08.5)。(三) 方法1. 取材與涂片：將贍蜍用乙醚麻醉后，剪開(kāi)胸腔，打開(kāi)心包，小心地在心臟上剪一小口，取心臟血一小滴，滴在干凈載玻片右端，另取一邊緣光滑平齊的玻片作為推片，制作厚薄適中的血涂片。制成的涂片室溫晾干。每個(gè)同學(xué)制血涂片二張，并做好標(biāo)記。    注意：取血滴不宜太大，以免涂片過(guò)厚，影響觀察。要使涂片厚薄適中。注意拿片姿勢(shì)，推片角度和速度要適中，要用力均勻。涂片一般在后半部觀察效果較好。2. 固定：將晾干的涂片浸于70%乙醇中固定5分鐘，取出后，室溫下晾干。3. 三氯醋酸處理：將已固定的血涂片浸于5%三氯醋酸中60溫度處理30分鐘。取出后用清水沖洗3分

8、鐘以上 (注意一定要反復(fù)洗凈，不可在涂片上留下三氯醋酸痕跡，否則酸性蛋白和堿性蛋白的染色不能分明)。然后用濾紙吸干玻片上的水分。4. 染色和鏡檢：將顯示酸性蛋白的涂片放入0.1%的酸性固綠溶液中染510分鐘，清水沖凈，晾干。將顯示堿性蛋白的涂片在0.1%的酸性固綠溶液中染0.51小時(shí)(視染色深淺而定)，清水沖凈，晾干。分別鏡檢。5. 觀察結(jié)果：用0.1%的酸性固綠染液染色處理過(guò)的蟾蜍紅細(xì)胞，胞質(zhì)和核仁中蛋白質(zhì)均被染成綠色，此即酸性蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布；而胞核內(nèi)染色質(zhì)部分并不染上色 (但時(shí)間太長(zhǎng)可能染上色)。經(jīng)0.1%的堿性固綠染液染色處理的標(biāo)本中，只有細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)部分被染成綠色，此即堿性蛋白在

9、細(xì)胞內(nèi)的分布，而胞質(zhì)及核仁不著色。三、細(xì)胞內(nèi)dna和rna的顯示(一) 原理    早年曾用甲基綠·派洛寧 (methylgreen-pyronin) 作為一般的組織學(xué)染色。后來(lái)用核酸水解酶 (rnase和dnase) 作為“酶水解對(duì)照”研究，證實(shí)甲基綠所染者為dna，可被脫氧核糖核酸酶 (dnase) 消化而特異性失染。派洛寧所著色者為rna，可經(jīng)核糖核酸酶消化使原派洛寧陽(yáng)性物質(zhì)失染。從而使甲基綠·派洛寧染色成為一種顯示核糖核酸的組織化學(xué)方法。甲基綠染dna和派洛寧染rna不是化學(xué)作用，而是與dna和rna聚合程度不同，對(duì)堿性染料有不同的親和

10、力而進(jìn)行選擇性染色。甲基綠分子上有兩個(gè)相對(duì)的正電荷，它對(duì)聚合程度高的dna有強(qiáng)的親和力，故可使分布在胞核中的dna被染成藍(lán)色或綠色；而派洛寧分子上只有一個(gè)相對(duì)的正電荷，它僅和聚合程度較低的rna相結(jié)合，使分布于胞質(zhì)和核仁中的rna染成紅色。因此，可用brachet反應(yīng)對(duì)細(xì)胞中的dna分子和rna分子進(jìn)行定位、定性和定量分析。(二)試劑的配制1. 2%甲基綠染液：稱取2g去雜質(zhì)甲基綠粉溶于0.2mol/l的醋酸緩沖液100ml中。甲基綠粉中往往混有雜質(zhì)甲基紫，此雜質(zhì)可影響染色效果，必須預(yù)先除去。除去甲基紫雜質(zhì)的方法是：將甲基綠粉溶于蒸餾水中，往分液漏斗中加入足量的氯仿 (三氯甲烷)，用力振蕩，然

11、后靜置，棄去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重復(fù)數(shù)次，直至氯仿中無(wú)甲基紫為止，最后放入4045溫箱中干燥后備用。2. 5%派洛寧染液：稱取5g派洛寧 (吡羅紅) 溶于100ml 0.2mol/l的醋酸緩沖液中混勻。3. 甲基綠·派洛寧染液：a液：5%派洛寧染液17.5 ml，2%甲基綠染液10 ml，蒸餾水250 ml。    b液：0.2mol/l醋酸緩沖液 (ph 4.8)：o.2mol/l醋酸4份 (1.2 ml醋酸加蒸餾水至100 ml)，0.2mol/l醋酸鈉溶液6份 (2.7g醋酸鈉naac·3h20，加蒸餾水至100ml)。 

12、   使用液：將a、b二液等量混合即成。該液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。4. carnoy固定液：無(wú)水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸i份。使用前現(xiàn)配。(三) 方法1. 洋蔥表皮細(xì)胞dna、rna的顯示(1) 切開(kāi)洋蔥鱗莖，用鑷子輕輕撕下洋蔥鱗片的內(nèi)側(cè)面膜狀的半透明內(nèi)表皮，用剪刀剪下一小塊 (約4mm2大小) 置于玻片上。(2) 用吸管吸取甲基綠·派洛寧染液，滴一滴于洋蔥表皮上，染色3040分鐘。(3) 用吸管吸取一滴蒸餾水沖洗表皮，并立即用吸水紙吸干，因?yàn)榕陕鍖幰酌撋?4) 蓋上蓋玻片，置顯微鏡下進(jìn)行鏡檢?？梢?jiàn)細(xì)胞質(zhì)和核仁呈淡紅色或紅色，表明含rna；而核質(zhì)呈藍(lán)色，表明含有dna。2. 蟾蜍血涂片dna、rna的顯示（1）制備蟾蜍血涂片。（2）固定：將晾干的涂片于carnoy氏液中固定1030分鐘。    （3）80%酒精浸洗23分鐘。    （4）蒸餾水洗數(shù)次 (每次12分鐘)，晾干。    （5）染色：將血涂片平放在染色架上，用吸管吸取甲基綠·派洛寧染色液，滴數(shù)滴于血標(biāo)本上，染色1020分鐘，    （6）沖洗：用蒸餾水沖洗。除去片上的