實驗 柑橘皮化學成分分析

1、實驗11 柑橘皮化學成分分析一、實驗目的1掌握水溶性性和脂溶性成分的提取方法。2掌握碘量法測定維生素C含量。3掌握建立HPLC混合物分離的色譜條件，并以外標法測定相關(guān)物質(zhì)的含量。4掌握建立GC混合物分離的色譜條件，并以外標法測定相關(guān)物質(zhì)的含量。二、實驗原理柑橘皮是柑橘果實加工后余留的最大比例副產(chǎn)品，其內(nèi)含豐富的生理活性成分以及磷、鈣、鐵、鋅等微量元素。中醫(yī)觀點認為：柑橘皮味辛、苦、性溫，其功能主要為化痰止咳、理氣止痛，可入藥。其所含營養(yǎng)成分除氨基酸外，其余均高于果肉，尤其是富含具有一定生理活性成分如維生素C、類黃酮、類胡蘿卜素等物質(zhì)，使柑橘皮及其提取物具有多重生理功效。 維生素C是可溶于水的無

2、色結(jié)晶，是一種分子結(jié)構(gòu)最簡單的維生素。維生素C有防治壞血病的功能，所以在醫(yī)藥上常把它叫做抗壞血酸。滴定法是維生素C含量測定最主要的方法，滴定法主要有2，6一二氯靛酚滴定法和碘量法，前者更加簡便。染料2,6二氯靛酚的顏色反應表現(xiàn)兩種特性：一是取決于其氧化還原狀態(tài)，氧化態(tài)為深藍色，還原態(tài)變?yōu)闊o色；二是受其介質(zhì)的酸度影響,在堿性溶液中呈深藍色，在酸性介質(zhì)中呈淺紅色。用藍色的堿性染料標準溶液，對含維生素C的酸性浸出液進行氧化還原滴定，染料被還原為無色,當?shù)竭_滴定終點時，多余的染料在酸性介質(zhì)中則表現(xiàn)為淺紅色，由染料用量計算樣品中還原型抗壞血酸的含量。柑橘皮中的微量金屬元素主要有鉀、鈣、鐵、鋅等，這些金屬

3、離子的含量測定可以原子吸收光譜法測定。待測的柑橘皮的提取液在空氣-乙炔火焰中原子化，在光路中分別測定鉀、鈣、鐵、鋅等對特定波長譜線的吸收。含量計算需要先建立各個金屬的標準工作曲線。在測定鈣離子時，需要加入鑭作釋放劑，以消除磷酸等的干擾。黃酮類化合物是一類具有C6一C3一C6 結(jié)構(gòu)的酚類化合物的總稱，目前已從柑橘中鑒定出來的黃酮類化合物有6O余種，最常見的為橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素蕓香苷等二氫黃酮類。橙皮苷是目前柑橘屬黃酮中最主要的研究對象，橙皮苷（又稱陳皮苷或桔皮苷）為二氫黃酮苷類化合物，是橙皮素與葡萄糖和鼠李糖結(jié)合形成的苷類。由于橙皮苷和Al(NO3)3溶液在80反應15min后能形

4、成黃色絡合物，通過波長掃描，可測其420nm有最大吸收，通過橙皮苷對照品的系列溶液得到工作曲線后，進行樣品中橙皮苷含量的測定。柑橘皮中含有多種香精油，其中含量最大的4種香精油分別是：檸檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。這四種成分沸點不高，受熱基本穩(wěn)定，可用GC進行含量測定。成 分結(jié) 構(gòu)沸 點檸檬烯175177Beta-蒎烯155156芳樟醇193194乙酸芳樟酯219220 上述四種成分的標準品可在GC-FID上得到有效分離和檢測，可通過外標法對被測溶液中的上述四種成分進行定量計算。柑橘皮中含量最大的一種類胡蘿卜素是葉黃素，其化學結(jié)構(gòu)如下表所示。這種類胡蘿卜素可在HPLC上進行有效的分

5、離，并用對照品通過外標法進行柑橘皮中的含量測定。成分結(jié) 構(gòu)葉黃素 三、實驗步驟3.1 2%HCl 萃取維生素C及以及金屬離子：柑橘皮曬干研碎，稱量，加2%HCl成漿狀，定容，紗布過濾，抽濾，濾液用白陶土吸附色素后，用于維生素C含量測定以及金屬離子的含量測定。3.2 維生素C含量測定： 抗壞血酸標準溶液(1mg/ml):稱取 100mg(準確至 0.1mg)抗壞血酸,溶于2% HCl中并稀至100ml。現(xiàn)配現(xiàn)用。2,6二氯靛酚溶液:稱取碳酸氫鈉 52mg溶解在200ml 熱蒸餾水中,然后稱取 2,6二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氫鈉溶液中。冷卻定容至250ml,過濾至棕色瓶內(nèi),保存在冰箱中。每次

6、使用前,用標準抗壞血酸標定其滴定度。即吸取1ml抗壞血酸標準溶液于50ml錐形瓶中,加入10ml浸提劑,搖勻,用2 ,6二氯靛酚溶液滴定至溶液呈粉紅色15s不褪色為止。同時,另取 10ml浸提劑做空白試驗。 滴定度 T(mg/ml)C·V/（V1V2） 式中: T每毫升2,6二氯靛酚溶液相當于抗壞血酸的毫克數(shù); C抗壞血酸的濃度,mg/ml; V吸取抗壞血酸的體積, ml; V1滴定抗壞血酸溶液所用 2,6二氯靛酚溶液的體積,ml; V2滴定空白所用2,6二氯靛酚溶液的體積,ml。 滴定：吸取10ml濾液放入50ml錐形瓶中,用已標定過的 2,6二氯靛酚溶液滴定,直至溶液呈粉紅色 1

7、5s不褪色為止。同時做空白試驗。 計算：C(mg/100g)(VV0)·T·A·100/W 式中: V滴定樣液時消耗染料溶液的體積,ml; V0滴定空白時消耗染料溶液的體積,ml; T2,6二氯靛酚染料滴定度,mg/ml; A稀釋倍數(shù); W樣品重量,g。 結(jié)果評價：用算術(shù)平均值表示，取三位有效數(shù)字，含量低的保留小數(shù)點后兩位數(shù)字。平行測定結(jié)果的相對相差，在維生素C含量大于 20mg/100g時,不得超過 2%,小于20mg/100g時，不得超過 5%。3.3 鉀、鐵、鋅含量的測定：鐵標準貯備液（質(zhì)量濃度1mg/mL）：稱取金屬鐵粉（光譜純）0.1g，用1:1硝酸4m

8、l溶解，用水定容于100ml的容量瓶中。鋅標準貯備液（質(zhì)量濃度1mg/mL）：稱取金屬鋅粉（光譜純）0.1g，用1:1硝酸4ml溶解，用水定容于100ml的容量瓶中。鈣標準貯備液（質(zhì)量濃度1mg/mL）：稱取干燥的碳酸鈣(光譜純)0.25g，用1:4的鹽酸10mL溶解，并定容于100mL容量瓶中。標準工作曲線的繪制：選用靈敏吸收線Fe 248.3nm;Zn213.9nm;Ca422.7nm.用毛細管吸噴2%的鹽酸溶液，測定鈣時用含鑭1mg/ml的體積分數(shù)為2%的鹽酸調(diào)零。分別測定混合標準溶液中各離子的透光率，對各元素含量繪制標準曲線。樣品測定：鐵、鋅的測定：將待測液用2%鹽酸稀釋到一定濃度，直

9、接上機測定。鈣的測定：將待測液用2%鹽酸稀釋到一定濃度，并加入一定量的鑭溶液后上機測定。計算：樣品中元素含量（mg/100g）=(C1-C2)×V×A×100/(m×1000)C1- 測定液中元素的濃度（µg/ml）C2- 測定空白液中元素的濃度（µg/ml）V - 樣液體積，mlA - 稀釋倍數(shù)m -樣品的質(zhì)量，g結(jié)果評價：兩次平行測定結(jié)果之差不得超過兩次測定平均值的 5%。3.4 乙醇回流提取橙皮苷：定量橘皮在乙醇中50下回流4小時，過濾濃縮，加入飽和的氫氧化鈣水溶液，靜置過濾，加鹽酸調(diào)節(jié)PH=5-6，靜置，離心，沉淀以乙醇和水洗

10、滌后，干燥得到橙皮苷粗品，用于UV測定橙皮苷的含量。3.5 橙皮苷含量的測定：對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的橙皮苷標準品20mg，用無水乙醇溶解，定容至100ml，配制成濃度為0.2mgml的對照品溶液。最大吸收波長的選擇：精密吸取橙皮苷標準液3ml，加入無水乙醇9ml，振搖溶解，置于50ml容量瓶中，靜置5min，再加入5的 NaNO2溶液2ml，振搖，靜置6min，加入10的AI(NO3)3溶液2ml，振搖，靜置6min，最后加入5的NaOH溶液20ml，振搖，靜置15min用無水乙醇定容至刻度以沒加入橙皮苷且按照上述相同方法配制的乙醇溶液為空白溶液在200nm700nm的波長范圍

11、內(nèi)掃描，確定最大吸收波長。 標準曲線的繪制：分別精密量取00ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml的橙皮苷標準品(02mg/m1)儲備溶液，按照上述操作方法進行操作以第一瓶為空白液在最大波長處測定吸光度值，以 值(y)為橫坐標、橙皮苷的含量(x，mgm1)為縱坐標作線性回歸，得標準曲線。樣品含量的測定：精密稱取供試品浸膏2mg，加入無水乙醇1 0ml溶解，按上述方法操作，在最大吸收波長處測定吸光度。同時扣除空白。 結(jié)果評價：兩次平行測定結(jié)果之差不得超過兩次測定平均值的 5%。3.6 水蒸氣蒸餾提取橘皮香精油: 定量的柑橘皮進行水蒸氣蒸餾，得到的油層用無水硫酸鈉干燥，以GC-FI

12、D檢測其中的4種精油含量。3.7 GC-FID測定香精油的含量：柑橘皮中含量最大的4種香精油分別是：檸檬烯，beta-蒎烯，芳樟醇，乙酸芳樟醇。將上述4中對照品配成標準溶液在GC上分離得到對照品的色譜圖，樣品進樣，按照外標法測定含量。GC-FID的色譜條件：DB-1 非極性毛細管柱，F(xiàn)ID檢測器進樣溫度：150; 檢測器溫度：250; 爐溫：80停留5min, 8/min升溫到250，停留5min （ 需調(diào)整）3.8 丙酮-乙醚提取類胡蘿卜素: 柑橘皮曬干研碎,稱量, 加含0.1%BHT的丙酮提取, 離心,沉淀用0.1BHT的丙酮分23次重復提取，至樣品無色，合并上清液，減壓蒸干，溶于乙醚(含0.1 BHT)后，再加10K0H-甲醇溶液皂化反應3 h；加入10NaC1使之分層萃取，水相再用乙醚萃取2次，合并乙醚相，蒸餾水反復洗至中性，用無水硫酸鈉脫水后,減壓蒸干；用甲醇定容，以高壓液相色譜檢測3種類胡蘿素。3.9 HPLC測定類胡蘿卜素柑橘皮中含量最大的一種類胡蘿卜素是葉黃素。將上述3中對照品配成標準溶液在HPLC上分離得到對照品的色譜圖，樣品進樣，按照外標法測定含量。HPLC的色譜條件：C18柱，紫外460nm甲醇/乙腈/水/磷酸作流動相（ 需調(diào)整） 4參考文獻1. 邵偉，熊澤，李昕. 光譜實驗室,2005,22(5)2. 陶俊, 張上隆, 中