2分子生物學(xué)樣品制備和檢測

1、目錄22.1.1 采樣須知（3W4H）、采集原則22.1.2 采樣前防護(hù)22.1.3 血液樣品22.1.4 咽拭子、鼻咽拭子、咽漱液、痰液32.1.5 尿液、糞便、肛拭子32.1.6 結(jié)膜拭子、嘔吐物、腦脊液、膿汁和創(chuàng)傷感染樣品32.1.7 組織、頭發(fā)42.1.8 當(dāng)遇上呼吸道、消化道疾病時(shí)、進(jìn)行地貧檢測時(shí)42.1.9 樣本的保存4 核酸分離純化及鑒定52.2.1 提取原則52.2.2 操作步驟：核酸釋放、分離純化、濃縮沉淀洗滌5DNA提取5（一）酚抽提法：6DNA的沉淀：6CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）7核酸分離、純化7（二）甲酰胺解聚法：7（三）磁珠法：7（四）微柱法：8（五）試

2、劑盒法8核酸回收的方法8質(zhì)粒DNA的提取9DNA提取常見問題10RNA提取11關(guān)于RNase酶11血液樣品處理12影響RNA提取的因素13RNA提取常見問題15人體九大系統(tǒng)（Nine human body system）：人體由九大系統(tǒng)組成，即運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。器官（Organ）組織（Tissue）：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織細(xì)胞和染色體采集原則注意生物安全樣品代表性或針對性（人數(shù)較少全部采集病例人數(shù)較多時(shí)，至少采集10-20例或采集全部病例的15-20%）采集對象（盡量采集未用藥的病例，采集暴露但未發(fā)病者的

3、標(biāo)本）采樣時(shí)間和種類避免污染注意對樣品的詳細(xì)標(biāo)記（每份標(biāo)本都應(yīng)標(biāo)記患者姓名、送檢號(hào)碼、標(biāo)本來源、具體部位、日期、時(shí)間及相關(guān)臨床信息）臨床樣品的采集和保存采樣須知（3W4H）、采集原則采樣須知（3W4H）采樣的目的（why）采什么樣，哪些信息（what）何時(shí)采集（when）如何采樣（how to sample)采多少樣（how many）如何保存（how to store）如何送樣(how to deliver)2.1.2采樣前防護(hù)第一類病原微生物指能夠引起人類或動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或已宣布消滅的微生物。第二類病原微生物指能夠引起人類或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或間接在人與

4、人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。一、二類病原微生物標(biāo)本采集人必須穿戴N95口罩、眼罩、帽子、連體式防護(hù)衣、鞋套、乳膠手套第三類病原微生物指能引起人類或動(dòng)物疾病，但一般情況下對人、動(dòng)物或環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。第四類病原微生物指通常情況下不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病的微生物。生物醫(yī)學(xué)樣品：包括血液、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽液、胃液、胰液、淋巴液、糞便等樣品。最常用：血漿和血清。三、四類病原微生物標(biāo)本應(yīng)當(dāng)遵循標(biāo)準(zhǔn)防護(hù)方法，并采用隔離防護(hù)措施（如手套、白大褂、口罩等）2.1.3血液樣品l血樣

5、的采集使用較多的方法是從靜脈采血。根據(jù)血中藥物濃度和分析方法靈敏度的要求，一般每次采血15ml。2血樣的制備(1)血漿的制備：是將采集的靜脈血液置含有抗凝劑的離心管中，混合后，以25003000rpm離心510min，使血漿與血細(xì)胞分離，所得淡黃色上清液即為血漿。(2)血清的制備：采集的靜脈血液置離心管中，放置30min到1h。用細(xì)竹棒或玻璃棒輕輕剝?nèi)ツ淘谠嚬鼙谏系难?，? 5003000rpm離心5l0min，上層澄清的淡黃色液體即為血清。(3)全血的制備：將采集的血液置于含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞混合在二起，則稱為全血。Hanks保存液紅色無三抗無色有三抗青霉

6、素鏈霉素制霉菌素2.1.4咽拭子、鼻咽拭子、咽漱液、痰液咽部病毒聚集較多的地方用于流感、禽流感、手足口病等呼吸道及消化道病毒核酸檢測或病毒分離培養(yǎng)最好發(fā)病3天內(nèi)采集采集方法用2根無菌棉拭子沾濕紅色Hanks液讓患者張口發(fā)“啊”音（必要時(shí)使用壓舌板），迅速地擦拭兩腭弓、咽及扁桃體，避免接觸舌及唾液咽漱液應(yīng)在病人進(jìn)食2小時(shí)后采集標(biāo)本讓患者先咳嗽數(shù)聲，然后用3ml無菌生理鹽水或肉湯漱口，漱口時(shí)讓患者頭部后仰，發(fā)出噢聲，讓采樣液在咽喉部轉(zhuǎn)動(dòng)35秒，隨后通過紙漏斗緩緩?fù)禄氐接行D(zhuǎn)蓋的50ml塑料離心管中。鼻咽拭子將棉簽平行于上顎插入鼻孔，伸入鼻咽部，保持幾秒鐘，吸收分泌物去掉尾部放入Hanks保存液同一

7、方法采集另一側(cè)鼻孔。棉拭子去掉尾部，放進(jìn)無色Hanks液保存痰液發(fā)病早期，晨起后最好選擇體溫在38以上時(shí)采集囑咐患者將痰液咳入無菌平皿中，然后用棉簽刮取痰液放入3ml采樣液的螺口塑料管中2.1.5尿液、糞便、肛拭子糞便黏液膿血便應(yīng)挑取黏液或膿血部分，液狀糞便采集水樣便或含絮狀物的液狀糞便25ml成形糞便取蠶豆大小糞便1塊（3-5g）肛拭子肛拭子不太適用于病毒分離，只有無法取得足夠量的糞便標(biāo)本才使用采集方法：用保存液或增菌液濕潤過的棉拭子插入肛門45cm深處（小兒23cm）輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一圈，直至見到拭子上有糞便為止。將拭子折斷，放入盛有3-4ml采集液的試管中。尿液較少用于病原學(xué)分析，但麻疹病毒、風(fēng)

8、疹病毒、腺病毒等有時(shí)也可在尿中發(fā)現(xiàn)，對發(fā)熱伴皮疹、發(fā)熱伴肝或腎功能損傷的不明原因疾病患者也可采集尿液。一般在發(fā)病時(shí)采集尿液，囑病人用一次性杯子采集1020ml中段尿，然后倒入50mL干燥螺口管。2.1.6結(jié)膜拭子、嘔吐物、腦脊液、膿汁和創(chuàng)傷感染樣品結(jié)膜拭子主要用于采集紅眼病樣品翻開眼瞼，用棉拭子直接涂抹結(jié)膜，吸取分泌液，然后去掉尾部放入保存液中。嘔吐物如有嘔吐物第一時(shí)間采集采樣量盡可能多洗胃液最好采集最初抽出的腦脊液臨床醫(yī)生采集抽取23ml腦脊液，放入15ml離心管中。如懷疑為流行性腦膜炎需保溫保存，其余標(biāo)本應(yīng)冷藏保存。膿汁和創(chuàng)傷感染樣品創(chuàng)傷樣品以棉拭子直接蘸取膿汁或分泌物。膿腫樣品先于患者皮

9、膚消毒，再以無菌注射器抽取膿液，然后注入生理鹽水試管；也可在切開排膿時(shí)，用棉拭子擦拭。折斷拭子置于生理鹽水試管。2.1.7組織、頭發(fā)組織在過量服用藥物而引起的中毒死亡時(shí)，藥物在臟器的貯存情況可為藥物的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)過程提供重要信息，常常需要采集肝、脾、腎、肺、胃、腦等臟器及其他組織進(jìn)行藥物檢測。處理方法：勻漿化法、沉淀蛋白法、酸水解或堿水解、酶水解法頭發(fā)毛發(fā)樣品可進(jìn)行微量元素含量測定，可用于：藥物史的估計(jì)、臨床用藥物和濫用藥物的區(qū)別、毒性藥物的檢測缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)材料的預(yù)處理繁雜、干擾多。分析對象的含量低，需要精密儀器測定。2.1.8當(dāng)遇上呼吸道、消化道疾病時(shí)、進(jìn)行地貧檢測時(shí)當(dāng)遇上呼吸

10、道疾病時(shí)細(xì)菌：腦膜炎奈瑟菌、Hib、結(jié)核桿菌、軍團(tuán)菌、耶爾森菌等病毒：SARS、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、腸道病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、乙型腦炎病毒等原核細(xì)胞類：衣原體、支原體樣品類別：上呼吸道：咽拭子、咽漱液、痰液、鼻咽吸取物下呼吸道：呼吸道吸取物、呼吸道灌洗物、肺組織活檢標(biāo)本當(dāng)遇上消化道疾病時(shí)傳染?。杭?xì)菌性痢疾、傷寒、副傷寒、霍亂、阿米巴痢疾、輪狀病毒、諾如病毒、手足口病等食物中毒：沙門氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、志賀氏菌等樣品種類：糞便，肛拭子，嘔吐物或洗胃液，血液，食物，水樣，環(huán)境樣當(dāng)進(jìn)行地貧檢測時(shí)l外周血: 5mLl臍帶血l羊水：20

11、30mLl絨毛：15mgl唾液l組織2.1.9樣本的保存常規(guī)外周血標(biāo)本，采集后做血常規(guī)，常溫24小時(shí)內(nèi)，4可保存1周；做血紅蛋白電泳常溫1周，電泳4可保存15天；DNA提取樣本常溫24小時(shí)，4保存1個(gè)星期，20 保存3個(gè)月，70 保存半年3年；RNA提取樣本常溫6小時(shí)，4保存12小時(shí)，70 保存3個(gè)月，羊水在12小時(shí)內(nèi)離心可保存同上。樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實(shí)驗(yàn)室（一般不超過23h；路途遙遠(yuǎn)時(shí)，應(yīng)在46h送達(dá)）樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如用于DNA測定的EDTA抗凝血等，則可在室溫下運(yùn)送或郵寄建議：將全血標(biāo)本或DNA樣本用冰袋加泡沫盒快遞運(yùn)送。如需提取RNA的樣本需預(yù)處理后加lm

12、lTrizol在低溫運(yùn)送（A類感染性物質(zhì)運(yùn)輸箱；普通運(yùn)輸箱）核酸分離純化及鑒定基本步驟1. 材料準(zhǔn)備2. 破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放3. 核酸分離、純化4. 沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)5. 核酸溶解在適量緩沖液或水中提取原則保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性；其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；其他核酸分子，如提取DNA中的RNA，也應(yīng)盡量去除。操作步驟：核酸釋放、分離純化、濃縮沉淀洗滌1、核酸的釋放：破裂細(xì)胞Ø材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低Ø針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理

13、方式：植物材料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶K細(xì)菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠Ø高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩2、核酸的分離與純化：將含有核酸分子復(fù)雜復(fù)合物中，將核酸與其他物質(zhì)分離：非核酸的大分子污染物（蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子）、非需要的核酸分子、試劑和溶液3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌沉淀可去除部分雜質(zhì)與某些鹽離子加入一定的鹽類（醋酸鈉、氯化鈉等）后使用有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇等）少數(shù)鹽類可使用70-75%的乙醇洗滌DNA提取常見的標(biāo)本：血液、尿液、唾液、組織及培養(yǎng)細(xì)胞等生物組織：最好新鮮組織，若不能馬上提取，應(yīng)貯存70或液氮肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ DNA聚合酶均很強(qiáng)的抑

14、制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上。對標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用每g核酸標(biāo)本中加入的肝素，即可100%的抑制酶活性在標(biāo)本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸在于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2,40 U RNasin 25 下作用2小時(shí)可去除肝素的抑制作用Ø最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融Ø組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會(huì)造成DNA降解Ø含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集（一）酚抽提法：先用EDTA、SDS

15、 、蛋白酶K破碎細(xì)胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris飽和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100150kb。主要試劑的作用：1、EDTA：1）二價(jià)金屬螯合劑，抑制核酸酶；2）降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性2、蛋白酶K：水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。3、SDS：1）SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能溶解膜蛋白和脂肪，使細(xì)胞膜破裂，溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；2）對RNA、DNA酶有抑制作用；3）與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變

16、性4、苯酚：蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑、抑制DNA酶活性苯酚溶于有機(jī)溶劑，微溶于水苯酚用Tris-Hcl飽和，氧化苯酚會(huì)破壞DNADNA的沉淀：1）無水乙醇沉淀沉淀前加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，無水乙醇使用前冰凍，可以減少DNA沉淀析出過程釋放熱量對DNA的損傷。2）異丙醇沉淀除了使DNA沉淀外，還可以溶解少量的小的RNA分子CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）ØCTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜

17、，并與核酸形成復(fù)合物。Ø該復(fù)合物在高鹽溶液中（）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15。CTAB提取緩沖液組分üTris-HCl（）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；üEDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；üNaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；üCTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；ü-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌

18、，避免褐變，使酚容易去除。核酸分離、純化q蛋白質(zhì)的去除：ü酚/氯仿抽提ü使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）ü高鹽洗滌ü蛋白酶處理q多酚的去除：ü在抽提液中加入防止酚氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等ü加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合q鹽離子的去除：ü70的乙醇洗滌q多糖的去除：ü高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl，高鹽可溶解多糖。ü用多糖水解酶將多糖降解。ü在提取緩沖

19、液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。ü用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。（二）甲酰胺解聚法：破碎細(xì)胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA。高濃度甲酰胺可以裂解蛋白質(zhì)與DNA的復(fù)合物，可以使蛋白質(zhì)變性。減少了酚多次抽提的步驟甲酰胺解聚法適用于從標(biāo)本中制備高分子量的DNA樣品。可得DNA 200kb左右。（三）磁珠法：磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸分離，再通過移動(dòng)磁珠來獲取DNA（四）微柱法：利用

20、DNA在高鹽、低pH的特定溶液環(huán)境下可吸附在固相介質(zhì)（如硅膠膜）上，洗滌去除雜質(zhì)后，再改變?nèi)芤涵h(huán)境使DNA溶解到純水或TE中。（五）試劑盒法試劑盒法步驟：1、切膠回收后，在離心管內(nèi)用1ml槍頭搗碎。2、加入等體積的溶液I3、50-60水浴加熱約10分鐘至膠全融4、加入到DNA純化柱內(nèi)，室溫放置1分鐘。5、最高速(16000g，約12000-14000rmp左右)離心1分鐘，倒棄收集管內(nèi)的液體6、在DNA純化柱內(nèi)加入700微升溶液II，室溫放置1分鐘7、最高速離心1分鐘，洗去雜質(zhì)。倒棄收集管內(nèi)的液體8、重復(fù)79、將DNA純化柱置于毫升離心管上，加入30微升溶液III至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。10

21、、最高速離心1分鐘，所得液體即為高純度DNA。核酸回收的方法1、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中有機(jī)試劑抽提。2、用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中回收DNA。3、瓊脂糖酶消化法。4、凝膠切槽法。5、凍融法。6、Kit法。1、試劑盒法優(yōu)點(diǎn)：簡單，得率高，純度好。2、低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中有機(jī)試劑抽提步驟：1、利用低熔點(diǎn)瓊脂糖制備膠塊，電泳，使目的片段與其它條帶完全分開。在紫外燈下，用一鋒利的刀片切下含有目的條帶的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠切片，轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的一次性使用的塑料管中（盡量將多余的凝膠切掉，以減少抑制劑對DNA的污染量）；2、加5倍體積的LMT洗脫緩沖液20mM (pH8.0), 1mM EDTA(pH8.0)至瓊脂糖切

22、片中。蓋好管蓋，于65 °C溫育5分鐘熔化凝膠。3、待凝膠冷卻至室溫后，加等體積的Tris平衡酚，將混合液混旋20 S。在20 °C以4000g離心10分鐘，回收水相（界面的白色物質(zhì)是瓊脂糖）。4、再用等體積的酚：氯仿、氯仿各抽提一次。5、水相轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中。加倍體積的10M乙酸銨和2倍體積4 °C的無水乙醇。混合液在室溫下放置10分鐘。然后4 °C，5000g(Sorvall SS-34轉(zhuǎn)子相當(dāng)于6500r/min)離心20 min，沉淀回收DNA。6、用70的乙醇洗滌沉淀，并溶于適當(dāng)體積的TE（）中。3、其它的凝膠電泳方法PAGE凝膠電泳:

23、分辨率比瓊脂糖凝膠要高得多，一般用于DNA測序，小片段核酸的分離、DNA的多態(tài)性分析等。SDS-PAGE:蛋白質(zhì)電泳,Western blot分析。質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)粒DNA-堿裂解法q堿裂解法原理ü染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；ü當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；ü變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA-煮沸法q煮沸法原理

24、ü染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；ü當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；ü變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。材料準(zhǔn)備&細(xì)胞裂解Ø使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）Ø培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失Ø盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量Ø菌株

25、不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）Ø菌體量適當(dāng)Ø培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮Ø變性的時(shí)間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷Ø復(fù)性時(shí)間也不宜過長，否則會(huì)有基因組DNA的污染ØG菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁核酸分離、純化Ø采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系Ø采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔Ø離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間Ø針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法質(zhì)粒DNA的提取核酸沉淀、溶解Ø當(dāng)沉淀時(shí)間有限

26、時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分Ø沉淀時(shí)加入1/10體積的NaOAc（，3M），有利于充分沉淀Ø沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等Ø晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）Ø若長期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為，可防止DNA發(fā)生酸解DNA提取常見問題q問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。原因：1. DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2. DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3. DNA中殘留有金屬離子對策：1.重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等

27、雜質(zhì)2.重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3.增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）q問題二：DNA降解。原因：1.材料不新鮮或反復(fù)凍融2.未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3.提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷4.外源核酸酶污染5.反復(fù)凍融對策：1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融2.液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量4.細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6.將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融q問題三：DNA提取量少。原因：1.實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉

28、淀不完全4.洗滌時(shí)DNA丟失對策：1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材料2.動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁3.高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長（對于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）4.低溫沉淀，延長沉淀時(shí)間5.加輔助物，促進(jìn)沉淀6.洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒RNA提取理論上所有有核真核細(xì)胞、細(xì)菌、病毒都可以提取RNA樣本選擇取決于試驗(yàn)?zāi)康娜腔蚪M提取RNA最常見的樣本關(guān)于RNase酶RNA易被RNase水解，RNase除胞內(nèi)還廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境中RNase具有水解核糖殘基和磷酸二酯鍵RNase分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵使其生物學(xué)活性非常穩(wěn)定，去除

29、變性劑后，RNase的活性又可恢復(fù)臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活如何避免RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在1. 內(nèi)源性RNA酶（intrinsic RNase）去除RNase的污染及強(qiáng)有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵必須在總RNA提取分離的最初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性2. 外源性RNA酶(extrinsic RNase)主要來源：被污染的緩沖液、細(xì)菌或微生物污染，高壓不能去除RNA酶、自動(dòng)移液裝置3. 實(shí)驗(yàn)室采取避免RNA酶污染的措施設(shè)置專門R

30、NA移液裝置小份保存緩沖液設(shè)置專門的RNA電泳裝置準(zhǔn)備溶液或緩沖液時(shí)，使用無RNA酶的器皿、DEPC處理水等分離RNA過程中使用RNA酶抑制劑4. RNA酶的去除DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化試劑，破壞RNA酶活性。用來滅活緩沖液或器皿中的RNA酶。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC5. RNA提取所用器皿的處理DEPC處理過的塑料制品如試管，離心管等基本上無Rnase；實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180干烤8小時(shí)以上,或灌滿DEPC的器皿于37下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于10

31、0干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾6. RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備對于RNA提取所需溶液的配制，必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?，溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37至少處理12小時(shí)，然后于100加熱15分鐘或高壓蒸汽滅菌15分鐘須注意的是，DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液，因此可存幾瓶新的，未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液7. RNA提取中RNase 污染的控制實(shí)

32、驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。策略是：在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套，口罩，帽子在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套在RNA專用區(qū)操作，操作過程中避免談話血液樣品處理1.取新鮮抗凝血23ml入15ml無菌塑料管，600g離心5分鐘，棄上清。2.加入6倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液（約12ml），輕輕吹打混勻（在室溫或4度操作均可）。裂解時(shí)間至4-5分鐘，并且裂解過程中宜適當(dāng)偶爾搖動(dòng)以促進(jìn)紅細(xì)胞裂解。3. 600g離心5分鐘，棄紅色上清。4離心效果更佳。4.一般情況下，裂解1次紅細(xì)胞應(yīng)該裂解的差不多，如果有較多紅細(xì)胞沒有裂解的

33、話，可以再加點(diǎn)紅細(xì)胞裂解液約5ml裂解1次。步驟同3。Trizol法：1.每mg組織中加入1mlTrizol試劑，高速破碎組織（使用高速組織搗碎器）2.加入氯仿0.2ml,輕輕顛倒混勻，室溫靜置分層。3.高速離心12000rpm，4-8，10分鐘4.吸上清液至新離心管中，約600ul5.加入600ul異丙醇，混勻，室溫靜置5-10分鐘6.高速離心12000rpm，4-8 ，10分鐘7.棄上清液，沉淀為RNA8.加入1mlDEPC處理的75%乙醇，混勻，8000rpm離心，4°C，5分鐘9.室溫晾干，加入DEPC處理水30ul，混勻5.向得到的細(xì)胞團(tuán)中加Trizol，彈勻，將細(xì)胞團(tuán)打散

34、，轉(zhuǎn)入無菌塑料管，封好蓋。標(biāo)上號(hào)，纏上封口膜，20 或70 保存。異硫氰酸胍/苯酚法Ø原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利于RNase的變性、水解與滅活異硫氰酸胍結(jié)合氯仿-酚提取法Ø步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸

35、酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70乙醇。沉淀：異丙醇、無水乙醇。乙酸鈉（）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。影響RNA提取的因素q材料：ü新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料ü如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在TRIzol或樣品貯存液中，于70或20保存ü如要多次提取，請分成多份保存ü液氮長期保存，70短期保存q樣品破碎及裂解：Ø根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材

36、料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍Ø樣品量適當(dāng)，保證充分裂解Ø為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量q純化：ü在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；ü經(jīng)典的純化方法，如LiCl 沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長，易造成RNA 降解；ü柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。RNA提取常見問題OD260/OD280比值偏低q蛋白質(zhì)污染：ü不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足

37、夠。ü減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底ü解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。q苯酚殘留：ü不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。ü解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。q抽提試劑殘留：ü確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75% 乙醇。ü解決辦法:再沉淀一次后，溶解。q設(shè)備限制：ü測定OD260 及OD280 數(shù)值時(shí)，要使OD260 讀數(shù)在0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。q用水稀釋樣品：ü測OD 時(shí)，對照及樣品稀釋液請使用10 mM Tris，。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。qRNA的降解qOD260/OD280比值偏低q電泳帶型異常q下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解q新鮮細(xì)胞或組織：Ø