微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用

1、生物工程學(xué)報(bào) Chin J Biotech 2010, November 25; 26(11): 14731481 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb ©2010 CJB, All rights reserved.微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用 張東旭1，堵國成1,2，陳堅(jiān)21 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 2141222 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122摘 要: 微生物過氧化氫酶是一種重要的工業(yè)酶制劑，可以催化分解過氧化氫生成水和氧氣。這一酶制劑在食品、紡織

2、、醫(yī)藥等領(lǐng)域表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力。生物工程和基因工程技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)。以下綜述了微生物過氧化氫酶發(fā)酵生產(chǎn)的進(jìn)展及其在紡織工業(yè)中的應(yīng)用，同時(shí)討論了微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)和紡織工業(yè)應(yīng)用的未來趨勢(shì)。關(guān)鍵詞: 微生物過氧化氫酶，發(fā)酵，紡織，應(yīng)用Fermentation production of microbial catalase and itsapplication in textile industryDongxu Zhang1, Guocheng Du1,2, and Jian Chen21 Key Laboratory of Industrial Biotech

3、nology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China2 State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, ChinaAbstract: Microbial catalase is an important industrial enzyme that catalyzes the decomposition of hydrogen peroxide to water and oxygen

4、. This enzyme has great potential of application in food, textile and pharmaceutical industries. The production of microbial catalase has been significantly improved thanks to advances in bioprocess engineering and genetic engineering. In this paper, we review the progresses in fermentation producti

5、on of microbial catalase and its application in textile industry. Among these progresses, we will highlight strain isolation, substrate and environment optimization, enzyme induction, construction of engineering strains and application process optimization. Meanwhile, we also address future research

6、 trends for microbial catalase production and its application in textile industry. Molecular modification (site-directed mutagenesis and directed revolution) will endue catalase with high pH and temperature stabilities. Improvement of catalase production, based on the understanding of induction mech

7、anism and the process control of recombinant stain fermentation, will further accelerate the application of catalase in textile industry.Keywords: microbial catalase, fermentation, textile, applicationReceived: March 22, 2010; Accepted: May 6, 2010Supported by: Program for New Century Excellent Tale

8、nts in University (No. NCET-07-0378), Key Technologies Research and Development Program of Jiangsu Province, China (No. SBE200900022), National Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 20625619), National Basic Research Prgram of China (973 Program) (No. 2007CB714306).Corresponding author:

9、 Jian Chen. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: jchen教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃 (No. NCET-07-0378)，江蘇省科技支撐計(jì)劃 (No. SBE200900022)，國家杰出青年基金 (No. 20625619)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB714306) 資助。1474 ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J Biotech November 25, 2010 Vol.26 No.111 過氧化氫酶簡(jiǎn)介過氧化氫酶 (Hydrogen

10、 peroxide oxidoreductase，catalase EC .) 是一類以過氧化氫為專一底物，通過催化一對(duì)電子的轉(zhuǎn)移而最終將其降解為水和氧氣的酶。研究表明幾乎所有的需氧微生物中都存在過氧化氫酶，只有少數(shù)好氧菌如過氧化醋桿菌Acetobacter peroxydas不存在過氧化氫酶1-4。除謝氏丙酸桿菌Propionibacterium shermanji和巨大脫硫弧菌Desulfovibrio gigas等微生物外，絕大多數(shù)厭氧微生物體內(nèi)不存在過氧化氫酶5。根據(jù)過氧化氫酶在結(jié)構(gòu)和序列水平上的異同將其劃分為3個(gè)亞群，即單功能過氧化氫酶 (Monofunctional

11、 catalase or Typical catalase)、雙功能過氧化氫酶 (Catalase-peroxidase) 和假過氧化氫酶 (Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多數(shù)的過氧化氫酶由4個(gè)相同的亞單位組成，分子量在240 kDa左右，在亞基的活性部位各含一個(gè)血紅素基團(tuán)6。來自哺乳動(dòng)物以及某些真菌和細(xì)菌的過氧化氫酶還含有4個(gè)緊密結(jié)合的NADPH分子。過氧化氫酶可被氰化合物、苯酚類、疊氮化物、過氧化氫、尿素及堿等物質(zhì)所阻抑。過氧化氫酶主要集中存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，另外線粒體和細(xì)胞質(zhì)中也含有少量的過氧化氫酶。過氧化氫酶能及時(shí)分解細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生 (主要為SO

12、D歧化產(chǎn)物) 或由胞外進(jìn)入細(xì)胞的過氧化氫。避免了過氧化氫通過Fenton和Harber-weiss反應(yīng)產(chǎn)生·OH。同時(shí)過氧化氫酶還能對(duì)血紅蛋白及其他含巰基蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用，使它們不被氧化7。人們研究過氧化氫酶的歷史可追溯到100多年前，早在1811年就已發(fā)現(xiàn)動(dòng)植物組織可以分解過氧化氫產(chǎn)生氧氣，到1892年Jacobson證明了在動(dòng)植物組織內(nèi)有專一分解過氧化氫的酶，即過氧化氫酶的存在。1901年Loew第一次報(bào)道了過氧化氫酶的生物化學(xué)特性8。到1937年，Sumner和Dounce首次從牛的肝臟中分離得到過氧化氫酶的結(jié)晶，這是最早分離得到的高純度酶之一9。隨后相繼報(bào)道了哺乳動(dòng)物的肝臟

13、、紅細(xì)胞及大多數(shù)微生物體內(nèi)均含有此酶，其中哺乳動(dòng)物組織中過氧化氫酶的含量差異很大，肝臟中含量最高，結(jié)締組織中含量最低，在J上述組織細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶主要與細(xì)胞器如線粒體和過氧化物酶體結(jié)合的形式存在，而在紅細(xì)胞中則以可溶的狀態(tài)存在10。過氧化氫酶來源豐富，存在于幾乎所有好氧生物中和一部分厭氧生物中。動(dòng)物過氧化氫酶存在于動(dòng)物的主要組織中，尤以肝與紅細(xì)胞為最多，腦、心臟與骨骼肌為最少，動(dòng)物肝臟是過氧化氫酶的一個(gè)很大來源，國內(nèi)外均已實(shí)現(xiàn)這一工藝的工業(yè)化生產(chǎn)。另外，巴西研究者開發(fā)了從人胎盤中提取醫(yī)用過氧化氫酶的技術(shù)。植物方面，主要集中在過氧化氫酶保護(hù)植物抗氧化機(jī)理方面的研究10。不同來源的過氧化氫酶在細(xì)胞

14、中的位置有所不同。動(dòng)物紅細(xì)胞、肝臟以及細(xì)菌的過氧化氫酶存在于細(xì)胞質(zhì)中，必須將細(xì)胞破碎才能提取到過氧化氫酶，因此酶的分離、提純較為復(fù)雜。細(xì)菌過氧化氫酶的熱、堿穩(wěn)定性雖然可隨來源不同而不同，但因?yàn)槭前麅?nèi)酶，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)和提取均不方便。酵母的過氧化氫酶主要積累于胞內(nèi)，而一些絲狀真菌的過氧化氫酶則主要分泌于胞外，胞內(nèi)也含有一定量的過氧化氫酶11-12。因此選用嗜熱絲狀真菌來生產(chǎn)過氧化氫酶在應(yīng)用和產(chǎn)品提取方面具有較大優(yōu)勢(shì)。此外也有研究通過構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)過氧化氫酶13。目前商業(yè)化的過氧化氫酶以動(dòng)植物提取和微生物發(fā)酵生產(chǎn)為主，本文將重點(diǎn)討論微生物來源的過氧化氫酶的生產(chǎn)。自20世紀(jì)80年代以來，織物和紙張的

15、生產(chǎn)者以及其他工業(yè)就已經(jīng)開始使用過氧化氫代替有毒的氯氣來漂白和消毒產(chǎn)品。過氧化氫可用于消除新鮮水果和蔬菜上有害的細(xì)菌，如沙門氏菌和大腸桿菌，還可用于消毒奶制品，為食品的紙包裝如果汁盒消毒也不必冷藏儲(chǔ)存等。在去除生產(chǎn)過程中剩余的過氧化氫的過程中，人們將注意力轉(zhuǎn)向了具有非常高的催化效率的過氧化氫酶，因此過氧化氫酶在食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè)都有著廣泛的用途。目前過氧化氫酶主要的應(yīng)用領(lǐng)域包括：1) 臨床。在臨床分析中，過氧化氫酶對(duì)研究自由基代謝失衡、抗衰老和腫瘤發(fā)病機(jī)理具有一定價(jià)值，對(duì)某些疾病的診斷、鑒別診斷亦具有重要意義12,14。過氧化氫酶可消除過氧化氫，對(duì)超氧化物歧化酶起保護(hù)作用，因而具有抗衰老作

16、用15。2) 醫(yī)藥。由于過氧化氫具殺菌、清潔、張東旭等: 微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用1475漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。如在隱形眼鏡消毒過程中添加過氧化氫酶可分解消毒液中殘留的過氧化氫。國內(nèi)、外均有研究的專利發(fā)表16-18。3) 食品加工。過氧化氫酶可使食品保鮮，并作為消除啤酒、飲料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化劑。此外過氧化氫酶可與葡萄糖氧化酶并用作為氧的去除劑，還可用于牛乳殺菌及干酪原料乳的殺菌19。4) 其他工業(yè)。與過氧化氫同時(shí)使用，用于橡膠成型、塑料及多泡性粘合劑。紙漿、纖維、毛漂白工藝中除殘留的過氧化氫。加入化妝品中可防止皮膚衰老，還可處理半導(dǎo)體廢水。近年

17、來隨著過氧化氫在紡織、造紙、制漿等行業(yè)的普遍應(yīng)用，市場(chǎng)對(duì)過氧化氫酶的需求也呈大幅增長趨勢(shì)。本文將重點(diǎn)討論過氧化氫酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用。氧化氫酶基本由諾維信、有田酵素、杰能科等大公司控制。2.1 微生物過氧化氫酶的野生菌株生產(chǎn)微生物過氧化氫酶發(fā)酵研究最早可追溯到1951年，Brizuela等首次報(bào)道了用桿菌Bacillus發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶20。后來，研究者不斷篩選出新的過氧化氫酶生產(chǎn)菌株，同時(shí)發(fā)展出各種優(yōu)化發(fā)酵過程的方法。表1列舉了近年來在微生物過氧化氫酶方面取得的進(jìn)展。由于過氧化氫酶在微生物中普遍存在，生物多樣性賦予了微生物多種可能的過氧化氫酶合成、分泌和調(diào)控機(jī)制，因此通過菌種篩選提高發(fā)酵水

18、平是一種十分有效手段。到目前為止，至少篩選出8種產(chǎn)過氧化氫酶的微生物，如變幻青霉Penicillum variabile、黑曲霉Aspergillus niger、釀酒酵母Saccharomyces cereisiae、葡萄球菌Staphylococcus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeiktious、嗜熱囊菌Thermoascus aurantiacus、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacte等 (表1)。目前最高的過氧化氫酶發(fā)酵水平是在枯草桿菌中獲得的，最高產(chǎn)量達(dá)到18 000 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度可以達(dá)到1 00

19、0 U/(mL·h)21。除菌種篩選外，培養(yǎng)條件優(yōu)化 (pH、溫度、溶氧等) 和培養(yǎng)基優(yōu)化等手段也運(yùn)用到微生物過氧化氫酶的發(fā)酵中，過氧化氫酶的發(fā)酵水平不斷提高2 微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)和性質(zhì)微生物過氧化氫酶是目前研究的熱點(diǎn)。除生理機(jī)理研究外，工業(yè)開發(fā)方面也進(jìn)行了更深入的研究，國外繼黑曲霉和微溶壁球菌產(chǎn)過氧化氫酶分別實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)之后，又開發(fā)了產(chǎn)酶性能更佳的嗜熱子囊菌、芽胞桿菌、重組大腸桿菌等微生物菌種。國內(nèi)用微生物生產(chǎn)過氧化氫酶仍停留在研究開發(fā)階段?，F(xiàn)在市售商品過氧化氫酶基本為牛肝過氧化氫酶和微生物產(chǎn)過氧化氫酶共存，微生物產(chǎn)過表1 提高微生物過氧化氫酶產(chǎn)量的不同方法比較Table

20、 1 Comparison of different methods to improve the production of microbial catalaseYear Strains 2008 2008 2007 2007 2006 2004 2001 1999 1999 1998 1994 1951aYield (U/mL) 18 000 11 000 3 258 29.9 4 505 1 100 292aProductivity (U/(mL·h) 1 000 366.7 651 1.5 39.2 91.7 146 n/a 0.2Strain screenMethod Re

21、ferences21 22 23 24 25 26 27 28 10 29 30 20Rhizobium radiobacter Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacillus subtilisThermoascus aurantiacus Micrococcus lysodeiktious Micrococcus lysodeiktious StaphylococcusSaccharomyces cereisiaeCulture medium optimizationStrain screen, culture medium and conditio

22、n optimizationCulture medium and condition optimization Fermentation conditions optimization Culture medium optimization Fermentation conditions optimization Effect of nitrate and incubation conditions Culture medium optimizationn/a16Biochemical mutants and fermentation conditionsAspergillus niger 7

23、8 n/aoptimization Penicillum variabile Bacillusn/a n/a0.1 n/aCulture medium optimizationCulture medium and conditions optimizationn/a = not applicable.J1476 ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J Biotech November 25, 2010 Vol.26 No.11(表1)。例如，趙志軍等通過培養(yǎng)基優(yōu)化，使過氧化氫酶產(chǎn)量從30 U/mL提高到3 258 U/mL23。鄧宇等通過氮源優(yōu)化，使酶活從3 000 U

24、/mL提高到11 000 U/mL22。經(jīng)過50多年的努力，研究者將過氧化氫酶的發(fā)酵水平從78 U/mL提高到18 000 U/(mL·h)，生產(chǎn)強(qiáng)度從0.1 U/(mL·h) 提高到1 000 U/(mL·h)。但隨著菌種篩選工作的不斷開展，從自然界直接篩選獲得產(chǎn)酶水平大幅提升的微生物的幾率越來越小，這就要求研究者通過基因工程手段定向的構(gòu)建能夠高產(chǎn)過氧化氫酶的微生物。Furuta等在1990年首次報(bào)道了以大腸桿菌為宿主構(gòu)建產(chǎn)過氧化氫酶的基因工程菌，基因來源是小鼠肝臟細(xì)胞，但獲得的產(chǎn)量不高31。接下來科學(xué)家嘗試了各種來源的過氧化氫酶基因和表達(dá)宿主 (表2)。到目前

25、為止，畢赤酵母Pichia pastoris、結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis、多形漢遜酵母Hansenula polymorpha、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis等已作為生產(chǎn)基因工程過氧化氫酶的宿主，過氧化氫酶基因的來源也拓展到稻瘟病菌Magnaporthe grisea、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、嗜冷桿菌Psychrobacte、人體細(xì)胞、嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillus stearothermophilus、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae等來源 (表2)。2.2 基因工程菌構(gòu)建為了進(jìn)一步提高微

26、生物過氧化氫酶的產(chǎn)量，研究者嘗試構(gòu)建基因工程菌來高效生產(chǎn)過氧化氫酶。表2 采用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶情況Table 2 Milestones in microbial catalase production by genetically modified strainsYear 2009 2008 2008Catalase gene resource Magnaporthe grisea Bacillus subtilisHostsEscherichia coli Bacillus subtilisYield (U/mL) Productivity (U/(mL·h) Refe

27、rencesan/a n/a 32117 458 2333 34 353 500Psychrobacter sp. Escherichia coli 11 000Pichia pastoris Escherichia coli Escherichia coli1 3802007 Human 2006 1997 1996Bacillus stearothermophilus Mycobacterium tuberculosis131 14.5 1320.6 n/a 3615637Saccharomyces cerevisiae Hansenula polymorpha 11 200Escheri

28、chia coli1990 Rat liver cellsan/a n/a 31n/a = not applicable.目前獲得最高發(fā)酵水平的基因工程菌是以大腸桿菌為宿主，最高產(chǎn)量11 000 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度為458 U/(mL·h)，發(fā)酵水平與使用野生菌生產(chǎn)過氧化氫酶相比仍有一定的差距34。目前基因工程過氧化氫酶的研究主要集中在工程菌的構(gòu)建，缺乏發(fā)酵過程控制和優(yōu)化的研究，如前期生長階段的高密度培養(yǎng)和后期產(chǎn)酶階段的持續(xù)穩(wěn)定誘導(dǎo)策略的研究。過程控制和優(yōu)化方面的研究，將進(jìn)一步推動(dòng)基因工程過氧化氫酶生產(chǎn)水平的提高。此外，微生物過氧化氫酶是一種誘導(dǎo)酶，通過對(duì)高產(chǎn)過氧化氫酶微生物中酶的誘

29、導(dǎo)、合成、分泌機(jī)制的研究，將有助于提高過氧化氫酶基因工程菌的構(gòu)建水平。表3 過氧化氫和O2脅迫下不同微生物的抗氧化酶合成情況Table 3 Synthesis of antioxidative enzymes in differentmicrobe under H2O2 and O2 stressStrains Escherichia coliSalmonella typhimurium Bacillus subtilisSaccharomyces cerevisiaeTranscript factorAntioxidative enzymes ReferencesH2O2: OxyR CAT

30、 (HPI), GR, AhpR O2: SoxRS SOD, CAT, G6PD, GR H2O2: OxyR H2O2: OxyRCAT, SOD, NADPH-AhpR CAT, AhpC, AhpF DNA repair enzyme41 42 43 4445H2O2, O2: CAT, SOD, GSH, b-ZIP, Ace1 TPX GPXCAT: Catlase; GR: Glutathione reductase; Ahp: Alkyl hydroperoxide reductase; SOD: Super oxide dismutase; G6PD: Glucose-6-p

31、hosphate dehydrogenase; GSH: Glutathione; TPX: Thioredoxin peroxidase.O2脅迫下抗氧化物酶的表達(dá)情況。可以看出，過氧化氫酶是各種微生物細(xì)胞 (特別是對(duì)于Bacillus 屬的微生物) 抵抗活性氧脅迫最主要的抗氧化物酶。2.3 過氧化氫酶與脅迫物的關(guān)系及誘導(dǎo)產(chǎn)酶過氧化氫酶可由過氧化氫等誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表表3列出了幾種典型微生物在過氧化氫和 達(dá)1,38-40。J張東旭等: 微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用1477由于活性氧消耗了胞內(nèi)的還原力，因此在活性氧脅迫下六磷酸葡萄糖脫氫酶 (Glucose-6-phosphate-

32、 dehydrogenase，G6PD) 的活性也得到了提高，G6PD的作用是提供維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境平衡的還原力NADPH。在微生物氧化應(yīng)激研究中，還發(fā)現(xiàn)一些新表達(dá)的蛋白，其生理作用目前還不是很清楚，但從已經(jīng)確定的來看，大多是一些控制抗氧化酶轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的調(diào)控因子21,42。過氧化氫酶作為微生物體內(nèi)專一清除過氧化氫的抗氧化物酶，其合成受到底物 (過氧化氫) 的直接誘導(dǎo)。已有的研究表明，過氧化氫對(duì)過氧化氫酶誘導(dǎo)作用主要取決于其濃度，一般來說，低濃度過氧化氫誘導(dǎo)過氧化氫酶合成，過氧化氫酶立即分解過氧化氫，以消除過氧化氫對(duì)細(xì)胞的繼續(xù)毒害，同時(shí)提高了細(xì)胞對(duì)過氧化氫脅迫的抵抗能力46。但當(dāng)過氧化氫濃度

33、超過過氧化氫酶的分解能力或過氧化氫酶來不及分解過氧化氫時(shí)，過氧化氫及其產(chǎn)物OH·會(huì)不加選擇地攻擊細(xì)胞成分，引起細(xì)胞代謝紊亂，抑制細(xì)胞生長，導(dǎo)致過氧化氫酶合成水平降低。更為重要的是OH·本身會(huì)直接攻擊過氧化氫酶活性中心導(dǎo)致過氧化氫酶失活，破壞細(xì)胞的防御系統(tǒng)，加劇氧自由基對(duì)細(xì)胞的氧化損傷47。另外，過氧化氫對(duì)過氧化氫酶合成的誘導(dǎo)作用還取決于脅迫方式，Janero等發(fā)現(xiàn)連續(xù)添加非致死濃度的過氧化氫能夠刺激肌原細(xì)胞 (Cardiacmyocytes) 過氧化氫酶的合成，而一次性添加較高濃度 (25 µmol/L) 的過氧化氫卻不能誘導(dǎo)過氧化氫酶合成48。由于O2誘導(dǎo)超氧化

34、物歧化酶合成的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生過氧化氫，因此在O2脅迫下過氧化氫酶也會(huì)有不表4 誘導(dǎo)和脅迫提高微生物過氧化氫酶產(chǎn)量同程度的提高4,40。另有研究表明，一些環(huán)境因素如溫度、鹽脅迫也能夠誘發(fā)胞內(nèi)O2的產(chǎn)生從而提高過氧化氫酶合成水平。Bai等發(fā)現(xiàn)在黑曲霉Aspergillus niger生長的對(duì)數(shù)期或穩(wěn)定期提高培養(yǎng)溫度 (25 35)，胞內(nèi)活性氧濃度增加了1.3倍和2.8倍，從而誘導(dǎo)了過氧化氫酶合成49。過氧化氫脅迫對(duì)過氧化氫酶合成的影響除了與微生物種類、過氧化氫濃度和脅迫方式有關(guān)外，還與細(xì)胞生理狀態(tài) (不同生長時(shí)期)、營養(yǎng)環(huán)境條件等因素相關(guān)50。表4列舉了通過誘導(dǎo)或脅迫促進(jìn)野生菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法

35、。例如，姚丹丹等使用枯草芽胞桿菌作為生產(chǎn)菌株，通過過氧化氫和乙醇誘導(dǎo)，使過氧化氫酶產(chǎn)量從11 000 U/mL提高到23 000 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度從360 U/(mL·h) 提高到640 U/(mL·h)51?？梢?，通過添加活性氧、過氧化氫、甲醇等物質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)或脅迫產(chǎn)酶，對(duì)過氧化氫酶野生菌而言是一種十分有效的提高微生物產(chǎn)量的方法。此外，過氧化氫酶的脅迫機(jī)制也提醒我們，基因工程菌中過量表達(dá)的過氧化氫酶可能會(huì)影響到宿主菌自身對(duì)環(huán)境氧脅迫的響應(yīng)。例如過量合成的過氧化氫酶會(huì)降低宿主細(xì)胞的氧脅迫水平，這時(shí)如果通過發(fā)酵控制提高環(huán)境的溶氧水平，將在不傷害細(xì)胞的前提下促進(jìn)生長和代謝速率。

36、2.4 不同微生物來源的過氧化氫酶的性質(zhì)比較不同來源的過氧化氫酶的熱、堿穩(wěn)定性往往不同。在紡織熱漂去除過氧化氫時(shí)，溫度和pH均較高 (60左右，pH約為11)，要求使用的過氧化氫酶必須有較高的耐熱和耐堿特性55。表5比較了不同來源的過氧化氫酶的pH和溫度穩(wěn)定范圍，其中堿性Table 4 Improvement of Catalase production by Induction and stressYear Strains Yield (U/mL) Productivity (U/(mL·h)2009 2005 2000 1999 2005 1974aMethod Referenc

37、es51 52 11 10 53Bacillus subtilis 23 000 640 Oxidative stress Thermoascus aurantiacus Aspergillus niger1 72529.20.2Addition of menadione H2O2 induction65.4 0.9 O2 and H2O2 inductionSaccharomyces cereisiae 16Hydroxyl radical inductionBacillus subtilis 18.5 1.0(photocatalytic reactor) Candida boidinii

38、an/a n/a Methanol induction 54n/a = not applicable.J1478 ISSN1000-3061 CN11-1998/QChin J Biotech November 25, 2010 Vol.26 No.11芽胞桿菌Alkaliphilic Bacillus、枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacter和嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus來源的過氧化氫酶，pH穩(wěn)定范圍在堿性范圍 (pH8.0)，枯草芽孢桿菌、放射型根瘤菌、嗜熱子囊菌來源的過氧化氫酶溫度穩(wěn)定范圍較高 (5

39、0)，較適合在紡織工業(yè)中應(yīng)用23,56-58。目前市場(chǎng)上商品化過氧化氫酶中，動(dòng)物肝臟提取的過氧化氫酶的pH應(yīng)用范圍一般在6.08.0，溫度應(yīng)用范圍在3050；微生物發(fā)酵的過氧化氫酶的pH應(yīng)用范圍在6.09.0，溫度應(yīng)用范圍在3065。市場(chǎng)上過氧化氫酶的pH和溫度穩(wěn)定范圍仍有進(jìn)一步提升的需要。一方面，可通過菌種篩選，進(jìn)一步獲得耐高溫、高堿的過氧化氫酶；另一方面，可通過分子生物學(xué)手段對(duì)過氧化氫酶分子進(jìn)行改造，如通過定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等方法，提高過氧化氫酶的溫度穩(wěn)定性和高pH耐受性。表5 不同來源過氧化氫酶的性質(zhì)比較Table 5 Characteristics of catalases from

40、different resourcesResources Alkaliphilic Bacillus Bacillus subtilis Rhizobium radiobacter Recombinant Magnaporthe griseaRecombinant Bacillus subtilis Thermoascus aurantiacus Thermoascus aurantiacusStable and active range of pHStable and activerange of Referencestemperature (°C)水排放的節(jié)約潛力。要從根本上改變

41、紡織工業(yè)高消耗、高污染的傳統(tǒng)粗放型經(jīng)濟(jì)增長方式，必須大力推動(dòng)和發(fā)展紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)紡織工業(yè)污染防治由“末端治理”向“源頭預(yù)防”的轉(zhuǎn)變。紡織品染整加工中，經(jīng)過氧化氫漂白后進(jìn)入染色步驟，染浴中若存在過氧化氫，會(huì)造成對(duì)氧化敏感的活性染料褪色，即使染料分子較小的改變都會(huì)導(dǎo)致色澤的消失。由于嚴(yán)格的質(zhì)量要求，染色織物上有微小的色澤改變，在商業(yè)上都不能接受。因此漂白過程一旦結(jié)束，為保證后道染色的安全性，必須將氧漂后殘留的過氧化氫去除干凈，以避免在其后的染色過程發(fā)生問題。傳統(tǒng)工藝采用水洗或化學(xué)還原劑去除過氧化氫，需多次升溫、洗滌，并可能帶入有毒和難降解的物質(zhì)。使用過氧化氫酶去除過氧化氫反應(yīng)速率非常快

42、：在最適條件下，每摩爾過在氧化氫酶在1 min內(nèi)可分解5×106摩爾過氧化氫。染整工藝中使用過氧化氫酶替代多次清洗及化學(xué)還原劑去除漂白液中殘留的過氧化氫，具有很大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)和環(huán)保優(yōu)勢(shì)10-11,59。冷曬祥等使用過氧化氫酶的酶解工藝代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝，可以使去除過氧化氫的時(shí)間縮短1/3，用水量2/360。Paar等研究了過氧化氫替代傳統(tǒng)工藝的61減少8.012.0 1550 56應(yīng)用條件，發(fā)現(xiàn)使用固定化過氧化氫酶可以顯著提6.011.0 3755 23高織物漂白處理后的染色性能6.011.0 3055 216.08.0 <45 32。張瑞萍等用過氧化氫酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的高溫除過氧化氫工藝，

43、保證了后道染色的色光和染色重現(xiàn)性，并且節(jié)約能源，提高62生產(chǎn)效率5.08.0 <40 336.011.0 1575 57。何照興等采用過氧化氫酶生物除H2O2，達(dá)到了節(jié)省水、電、汽用量，降低成本，提高生產(chǎn)效率，并減少對(duì)環(huán)境的污染效果63。這些研究表明過氧化氫酶處理替代傳統(tǒng)化學(xué)除H2O2，工藝簡(jiǎn)便易盡管過氧化氫酶具有高效、環(huán)保、處理效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，但是其高昂的價(jià)格、在工業(yè)應(yīng)用中容易失活以及pH、溫度適應(yīng)范圍較窄等問題也阻礙著其在紡織工業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。長期來看，隨著人們環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)和排污成本的提高，將會(huì)促進(jìn)過氧化氫酶在紡織業(yè)的應(yīng)用規(guī)模。短期來看，一方面可通過提高發(fā)酵水平降低成本，另一方面可

44、通過分子改造提高過氧化氫酶耐受高溫和強(qiáng)堿的能力和穩(wěn)定行、處理效果顯著，非常適合在紡織工業(yè)推廣。5.013.0 3080 583 過氧化氫酶在紡織工業(yè)的應(yīng)用紡織工業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和支柱產(chǎn)業(yè)，也是污染非常嚴(yán)重的工業(yè)，尤其是在印染加工過程中，傳統(tǒng)工藝耗費(fèi)大量的水和化學(xué)品，不僅耗費(fèi)資源，同時(shí)還造成環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡。這對(duì)實(shí)施可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略是極為不利的。因此隨著世界范圍內(nèi)，水的消耗和廢水處理變得越來越昂貴，大多數(shù)染色和整理工廠正非常密切地關(guān)注著減少水的消耗和廢J張東旭等: 微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用1479性，減少酶的用量來降低成本。此外，研究和開發(fā)新的、更加高效和低消耗的過氧

45、化氫酶應(yīng)用工藝，也將促進(jìn)過氧化氫酶在紡織工業(yè)大規(guī)模推廣應(yīng)用。4 Abbott DA, Suir E, Duong GH, et al. Catalaseoverexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol, 2009, 75(8): 23202325.5 Liu G, Zhao J, Hidaka H. ESR spin-trapping detection ofradical intermediates in the TiO

46、2-assisted photo-oxidation of sulforhodamine B under visible irradiation. J Photochem Photobiol A: Chem, 2000, 133(1/2): 8388. 6 Watts RJ, Washington D, Howsawkeng J, et al.Comparative toxicity of hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and superoxide anion to Escherichia coli. Adv Environ Res, 2003,

47、7(4): 961968.7 Grzelak A, Rychlik E, Bartosz G. Light-dependentgeneration of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biol Med, 2001, 30(12): 14181425. 8 Loew O. Catalase, a new enzyme of general occurrence,with special reference to the tobacco plant. US Dept Agr Rept, 1901, 68: 1

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49、charomyces cerevisiae. Process Biochem, 1999, 34(2): 187191.12 Fiedurek J, Gromada A. Production of catalase andglucose oxidase by Aspergillus niger using unconventional oxygenation of culture. J Appl Microbiol, 2000, 89(1): 8589.13 Duan XG, Shen W, Li YL, et al. Construction ofrecombinant thermo-st

50、able catalase engineering strain and optimization of its fermentation condition. J Food Sci Biotech, 2006, 25(2): 7478.段緒果, 沈微, 李艷麗, 等. 耐熱過氧化氫酶基因工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵條件. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2006, 25(2): 7478.14 Feng GJ. Modern Diagnosis and Treatment. Beijing:Peoples Medical Publishing House, 1994.馮國基. 現(xiàn)代診斷與治療. 北京: 人民衛(wèi)

51、生出版社, 1994.15 Mo J. Free Radical Biology Medicine Introduction.Beijing: Peoples Medical Publishing House, 1989. 莫簡(jiǎn). 醫(yī)學(xué)自由基生物學(xué)導(dǎo)論. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1989.16 Berka RM, Fowler T, Rey MW. Production of Aspergillusniger catalase-R: US 5360732. 1994-12-01.17 Berka RM, Fowler T, Rey MW. Gene sequence encodingJ4 結(jié)

52、論與展望綜上所述，過氧化氫酶作為一種新型酶制劑，在棉織物的前處理工藝中起著重要的作用，紡織熱漂步驟使用過氧化氫酶是實(shí)現(xiàn)紡織工業(yè)節(jié)能減排和可持續(xù)發(fā)展的有效方法。目前商品化過氧化氫酶的價(jià)格較高，溫度和pH耐受范圍較低，這些都制約著過氧化氫酶在紡織工業(yè)的大規(guī)模應(yīng)用。過氧化氫酶發(fā)酵生產(chǎn)目前的研究主要集中在菌種篩選、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化、基因工程菌構(gòu)建等方面，發(fā)酵水平仍需進(jìn)一步提高?？紤]到紡織加工處理的條件需要，需要開發(fā)出更加適應(yīng)高溫和堿性條件的過氧化氫酶用于過氧化氫漂白后的酶處理。因此，未來的研究重點(diǎn)將圍繞以下幾個(gè)方面進(jìn)行：1) 通過菌種篩選，獲取高產(chǎn)和能耐受高pH、高溫度的過氧化氫酶的菌株。通過野生

53、菌發(fā)酵過程控制與優(yōu)化，提高發(fā)酵產(chǎn)量。同時(shí)對(duì)編碼耐高溫、高堿過氧化氫酶的基因進(jìn)行鑒定。2) 從耐高溫高堿過氧化氫酶基因出發(fā)構(gòu)建工程菌，結(jié)合現(xiàn)代在線控制與分析技術(shù)，進(jìn)行過氧化氫酶發(fā)酵過程優(yōu)化與控制研究，提高產(chǎn)酶水平。3) 通過定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化等分子改造手段，提高過氧化氫酶的溫度、pH耐受性，提高其應(yīng)用性能。REFERENCES1 Heo YJ, Chung IY, Cho WJ, et al. The major catalase gene(katA) of Pseudomonas aeruginosa PA14 is under both positive and negative contr

54、ol of the global transactivator OxyR in response to hydrogen peroxide. J Bacteriol, 2010, 192(2): 381390.2 Kim JK, Choi HS, Kim E, et al. Comparative effects ofTiO2-immobilized photocatalytic supporters on the bactericidal efficiency of a novel photoreactor. Biotech Lett, 2004, 24: 13971400.3 Sahoo

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56、na M. Scytalidium catalase gene: US 5646025.1997-07-08.19 Huang WT, Hu XZ. Handbood of Enzymatic Apply.Shanghai: Shanghai Science and Technology Press, 1989. 黃文淘, 胡學(xué)智. 酶應(yīng)用手冊(cè). 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1989.20 Brizuela W, Paraje R. Microbial catalase; quantitativedetermination in three species of the Bacillus g

57、enus; influence of temperature, culture media and incubation time. Rev Fac Cienc Med Cordoba, 1951, 9(4/6): 565575. 21 Nakayama M, Nakajima-Kambe T, Katayama H, et al.High catalase production by Rhizobium radiobacter strain 2-1. J Biosci Bioeng, 2008, 106(6): 554558.22 Deng Y, Hua ZZ, Zhao ZJ, et al. Effect of nitrogen sourceson catalase production by Bacillus subtilis WSHDZ-01. Chin J Appl Environ Biol, 2008, 14(4): 544547. 鄧宇, 華兆哲, 趙志軍, 等. 氮