分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展

1、分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展摘要分子生物學(xué)技術(shù)是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的重要診療手段。本文概述醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)，列舉其在臨床病原微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷中的具體生曳，分析分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問(wèn)題,并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行預(yù)測(cè)。關(guān)鍵詞分子生物學(xué)技術(shù)；醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)；應(yīng)用；進(jìn)展分子生物學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為也定對(duì)象的學(xué)科，分子生物學(xué)技術(shù)即建立在核酸生化基礎(chǔ)上的一類研究手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中。研究?jī)?nèi)容也從DNA鑒定、擴(kuò)展到核酸及表達(dá)產(chǎn)物分析，技術(shù)不斷進(jìn)步為原微生物檢驗(yàn)、腫瘤診斷及評(píng)估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路?，F(xiàn)就分子生物

2、學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，試分析應(yīng)注意的問(wèn)題及預(yù)測(cè)發(fā)展趨勢(shì)。1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的分子生物學(xué)技術(shù)概述分子生物學(xué)技術(shù)的核心是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,能在最短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增。由此衍生出新PCR技術(shù)，如原位PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技術(shù)、核酸探針技術(shù)、生物傳感器、SELEX技術(shù)、循環(huán)核酸分析技術(shù)都極大的完善了檢驗(yàn)技術(shù)，直接解釋生命規(guī)律，在臨床診斷和治療中意義重大。2分子生物學(xué)技術(shù)在臨床中的具體應(yīng)用2.1病原微生物檢驗(yàn)PCR和生物芯片技術(shù)用于病原微生物檢驗(yàn)術(shù)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、免疫測(cè)定相比，其具有高的敏感性，較短的耗時(shí)和更廣的適用范圍1

3、。PCR通過(guò)向反應(yīng)管中加入特異性引物可同時(shí)鑒定出單種或多種病原體，即便存在大量死菌也能得到準(zhǔn)確結(jié)果，不受混合標(biāo)本和微生物生長(zhǎng)時(shí)間的限制。生物芯片技術(shù)則以其更高的靈敏性和高效率，同時(shí)檢測(cè)出上百種病原微生物，可用于快速查找樣本的耐藥基因指導(dǎo)臨床用藥。2.2腫瘤及遺傳病診斷研究證實(shí)腫瘤及遺傳病幾乎都存在著一定的基因缺陷，只要找到人體中與基因相互作用的結(jié)合點(diǎn)，從基因水平診斷就能準(zhǔn)確診斷。通過(guò)基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突變，通過(guò)分子蛋白質(zhì)組學(xué)、生物傳感器和流式細(xì)胞術(shù)診斷腫瘤特異性標(biāo)志物。在遺傳病中，分子生物技術(shù)能識(shí)別患病家族基因存在的特定多態(tài)性，常用技術(shù)有DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，單鏈構(gòu)象

4、多態(tài)性分析，熒光原位雜交染色體分析，酶基因調(diào)控和微陣列技術(shù)。2.3免疫系統(tǒng)疾病診斷免疫系統(tǒng)疾病診斷關(guān)鍵是確定基因水平上的調(diào)控表達(dá)。如在人類免疫缺陷病毒的研究中，分子生物納米技術(shù)即以抗體為基礎(chǔ)，用免疫分析和磁性修飾的方法來(lái)檢測(cè)免疫物質(zhì)，通過(guò)酶、熒光劑、同位素把特異的抗體抗原與納米磁性微球固定，既能自動(dòng)檢測(cè)人免疫缺陷病毒1型和2型抗體，為人類防治病毒性疾病提供了有力的武器。3分子生物學(xué)技術(shù)在檢驗(yàn)應(yīng)用的新進(jìn)展現(xiàn)階段分子生物學(xué)新技術(shù)的發(fā)展方興未艾，給人們提供了探索人類生命科學(xué)的工具，推動(dòng)了檢驗(yàn)學(xué)發(fā)展。分子生物技術(shù)最顯著的醫(yī)學(xué)成就是對(duì)遺產(chǎn)病中的致病基因的準(zhǔn)確定位及克隆，早在1998年就完成了遺傳性耳聾的

5、基因克??；2003年SARS肆虐時(shí)，科學(xué)家就研制出專門診斷該病的基因芯片；2004年后實(shí)現(xiàn)了用多重PCR技術(shù)對(duì)我國(guó)新生兒多發(fā)的地中海貧血、苯丙酮尿癥、G6DP缺乏癥的產(chǎn)前和病例診斷；近年來(lái)，遺傳標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)合現(xiàn)有分子學(xué)研究技術(shù)，加速了遺傳基因圖譜的制作和相關(guān)疾病的基因檢測(cè)和鑒定，從而為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的加速發(fā)展提供了有效的載體。4存在問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)現(xiàn)階段面臨的問(wèn)題主要是技術(shù)相對(duì)復(fù)雜和儀器要求太高、藥品和反應(yīng)盒昂貴等2,限制了臨床推廣。首先，合理選用檢驗(yàn)項(xiàng)目的問(wèn)題，分子生物學(xué)方法具有高特異性和高靈敏性，但臨床中仍要根據(jù)實(shí)際需要選用經(jīng)濟(jì)合理的檢驗(yàn)項(xiàng)目，如結(jié)核菌培養(yǎng)和涂片鏡檢就能達(dá)到目的，不必舍廉選貴

6、，增加患宣負(fù)擔(dān)。其次，疾病診斷過(guò)度依賴檢驗(yàn)結(jié)果問(wèn)題，應(yīng)將臨床資料綜合考慮，不能僅靠分子生物學(xué)技術(shù)檢驗(yàn)結(jié)果就妄下診斷，忽略標(biāo)本取樣和檢驗(yàn)過(guò)程中的操作不當(dāng)及病程發(fā)展規(guī)律造成的假陽(yáng)性或是假陰性，貽誤病情。再者，上級(jí)部門管理不足問(wèn)題,國(guó)家相關(guān)部門要擔(dān)任監(jiān)管的職責(zé)，參考國(guó)際慣例，制定符合我國(guó)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)現(xiàn)狀的實(shí)驗(yàn)操作管理規(guī)章制度，嚴(yán)格培訓(xùn)檢驗(yàn)人員，規(guī)范試劑的準(zhǔn)入和儀器的管理，最大程度保證檢驗(yàn)結(jié)果的可信度。雖然分子生物技術(shù)在臨床推廣應(yīng)用中存在著許多尚待解決的問(wèn)題，但是它仍然顯現(xiàn)出了快速發(fā)展的趨勢(shì)。未來(lái)其發(fā)展會(huì)傾向于：現(xiàn)有、僅停留在實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)技術(shù)逐步向臨床實(shí)用型改進(jìn)，降低實(shí)驗(yàn)投入、簡(jiǎn)化操作步驟，推進(jìn)實(shí)驗(yàn)

7、過(guò)程全自動(dòng)化的實(shí)施降低人為因素對(duì)結(jié)果的影響，根據(jù)臨床實(shí)際修正技術(shù)，提高檢驗(yàn)的特異性和敏感性。積極推進(jìn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，加大儀器和檢驗(yàn)人員的培訓(xùn)投入，為分子生物學(xué)的臨床應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)保障，以先進(jìn)的、可持續(xù)性的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)手段為臨床提供可靠的依據(jù)。參考文獻(xiàn)YuregirOO,SahinFI,YilmazZ,etal.Fluorescentinsituhybrid-izationstudiesinmultiplemyelomaJ.Hematology,2009,14(2):90-94.2李鵬.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用J.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,3(6):161.PCR在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)

8、用關(guān)鍵詞：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用PCR現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)王耿新劉德亮王志群陳獻(xiàn)業(yè)山東省青島市腫瘤醫(yī)院青島266042聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction,PCR）又稱體外基因擴(kuò)增技術(shù)或DNA擴(kuò)增技術(shù)。 自1985年美國(guó)PE-Cetus公司的K.BMullis等人首創(chuàng)了PCR技術(shù)之后， 它以相當(dāng)驚人的速度被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域?，F(xiàn)今，PCR技術(shù)已成為一種對(duì)標(biāo)本中特定的DNA片段進(jìn)行分析研究和檢測(cè)鑒定的重要方法。近20年來(lái)PCR技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用中發(fā)揮了重大的作用，在病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學(xué)研究、癌基因探索及治療等方面都作出了相應(yīng)的貢獻(xiàn)。PCR技

9、術(shù)的基本原理與特點(diǎn)1-2PCR技術(shù)的基本原理是模仿DNA體內(nèi)復(fù)制的機(jī)制，在體外進(jìn)行擴(kuò)增特異的DNA片段。它主要是由三個(gè)基本步驟組成的循環(huán)反應(yīng)。首先是變性，用加熱的方法使雙鏈DNA解鏈成兩股單鏈；其次是復(fù)性，用降溫的辦法使這兩股單鏈按堿基互補(bǔ)的原則分別與加入的兩條人工合成的寡聚核甘酸鏈（引物）結(jié)合成雙鏈；最后是延伸，在合適的緩沖液、鎂離子及脫氧核甘酸存在的條件下， 用DNA聚合酶進(jìn)行催化， 按堿基配對(duì)的原則合成互補(bǔ)鏈。 引物從3端進(jìn)行延伸，合成的方向?yàn)?端（一條人工合成的引物）至3端，從而合成與模板DNA結(jié)構(gòu)相同的片段。重復(fù)上述三步驟，變性一復(fù)性一引物延伸的過(guò)程，經(jīng)過(guò)約30個(gè)周期的循環(huán)（每三個(gè)步

10、驟為一周期，約需2-3分鐘），1-2小時(shí)就能將所需基因擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍，使極微量的所需DNA達(dá)到極易檢測(cè)的水平。其擴(kuò)增效率公式為：Y=（1+X）n,式中丫為擴(kuò)增數(shù)目，X為放大效率，n為循環(huán)次數(shù)。PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、快速省時(shí)等特點(diǎn)。其靈敏度可達(dá)到Pg級(jí)，甚至達(dá)到fg級(jí)3水平，而被擴(kuò)增的基因片段能與原基因片段保持不變。PCR技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速而易掌握，并且對(duì)標(biāo)本要求不高。用過(guò)去的方法完成一項(xiàng)試驗(yàn)少則幾周,多則幾個(gè)月。應(yīng)用全自動(dòng)DNA擴(kuò)增儀，整個(gè)PCR過(guò)程均由電腦控制，只需數(shù)小時(shí)即可完成整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程，用極微量的粗制標(biāo)本就可獲取目的產(chǎn)物。常用的幾種PCR及主要用途4-5ered_7

11、fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$定量PCR:用于mRNA定量及轉(zhuǎn)錄水平的研究。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$抗原捕獲PCR(AC-PCR):用于病毒感染的檢測(cè)。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$不對(duì)稱PCR(AsymmetricPCR):用于制備探針或測(cè)序。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$彩色PCR(CCA-PCR)用于檢測(cè)某些多型別病毒的混合感染。ered_7fc99c46-f88e-4744-82

12、5c-061b591dded3$原位逆轉(zhuǎn)錄PCR(InSituRT-PCR):定位檢測(cè)細(xì)胞中RNA病毒感染。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):用于克隆cDNA、 檢測(cè)RNA病毒、cDNA探針。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$反向PCR(invertedPCR):用于擴(kuò)增已知基因片段兩側(cè)的未知序列。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$膜PCR(membrane-boundPCR):可去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留，檢測(cè)

13、低豐度靶DNA。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$間接原位PCR(IndirectInSituPCR):定位檢測(cè)細(xì)胞中DNA病毒感染，是目前應(yīng)用較廣泛的一種原位PCR技術(shù)，其特異性比直接PCR強(qiáng)。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，人類疾病多數(shù)是直接或間接與基因有關(guān)6,如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷中我們經(jīng)歷了生化和免疫診斷的發(fā)展過(guò)程，由于各類擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)使我們進(jìn)入了基因診斷的新時(shí)代并成就了現(xiàn)代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對(duì)疾病的表型認(rèn)識(shí)和表型診斷，從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)疾病和診斷疾病。在各類擴(kuò)增技術(shù)中，PCR的地位尤為突出

14、。目前，全世界利用PCR技術(shù)診斷感染性疾病每年達(dá)幾千萬(wàn)人次，其費(fèi)用早已大幅下降，說(shuō)明PCR有著巨大的潛在市場(chǎng)。美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)于頒布了關(guān)于感染性疾病分子診斷應(yīng)用范圍、條件和質(zhì)量控制細(xì)則等準(zhǔn)則文件7。而國(guó)際臨床化學(xué)學(xué)會(huì)于1998年又發(fā)布了關(guān)于分子擴(kuò)增在臨床診斷中應(yīng)用的質(zhì)量評(píng)估基礎(chǔ)的文件并對(duì)PCR操作的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)彳T了詳細(xì)論述8。由此可見(jiàn)，兩個(gè)權(quán)威性文件也都肯定了PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面的重要性。基因診斷可能將是以后的發(fā)展方向并作為疾病的常規(guī)診斷技術(shù)。PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$PCR技術(shù)在腫瘤方面的應(yīng)用目

15、前，腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，人類許多常見(jiàn)的腫瘤疾病與某些病毒病因及腫瘤相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變有著密切的關(guān)系。PCR技術(shù)的腫瘤病毒病因、腫瘤相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。據(jù)有關(guān)資料表明1,4前列腺癌、結(jié)腸癌和Kaposi肉瘤等與人巨細(xì)胞病毒（CMV）有關(guān)；鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤與EB病毒有關(guān)；原發(fā)性肝癌與乙型肝炎病毒（HBV）有關(guān)；泌尿道腫瘤和食道腫瘤等與人乳頭瘤病毒（HPV）有關(guān)。人類腫瘤病毒病因中較為重要的一類病毒是HPV,其中大部分只與良性增生有關(guān)，只有16、18、31、339等十余型與惡性腫瘤關(guān)系密切。PCR在檢測(cè)HPV,尤其是第16、18型有

16、無(wú)感染，對(duì)子宮頸癌的早期診斷及預(yù)防有著顯著的意義。目前，已知腫瘤相關(guān)基因有上百多種，但較常見(jiàn)的是ras家族的H-ras、K-ras和N-ras三種癌基因。它們的結(jié)構(gòu)相似，其表達(dá)產(chǎn)物是P21蛋白。在不同腫瘤中ras家族癌基因的H-ras、K-ras點(diǎn)突變多集中在第12和61號(hào)密碼子上，而N-ras在第13號(hào)密碼子上多發(fā)生突變。PCR在癌基因的研究方面主要是ras基因與腫瘤的關(guān)系?，F(xiàn)已查明與ras基因突變有關(guān)1,2,4,9,10的腫瘤有幾十種。如：各種急性慢性白血病、精原細(xì)胞癌、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸1995年癌、子宮瘤等。Rb基因11是人類最早（1986年

17、）發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其后又相繼發(fā)遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)位于13號(hào)染色體上Rb基因的缺失與癌變有關(guān)。在許多常見(jiàn)腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，常發(fā)現(xiàn)該基因失活11。在P53基因的研究中12-14發(fā)現(xiàn)該基因的突變和缺失是許多腫瘤發(fā)生的原因，這些腫瘤主要有子宮頸癌、肝癌、成骨肉瘤等。遺傳學(xué)改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變。PCR不但能有效地檢測(cè)基因的突變、重排、易位等，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預(yù)后評(píng)估等。近年，剛興起的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR10在腫瘤診斷、治

18、療和微轉(zhuǎn)移以及微小殘留病灶檢測(cè)等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，癌細(xì)胞或癌前期細(xì)胞在進(jìn)入血液循環(huán)以后，通過(guò)定量RT-PCR檢測(cè)外周血腫瘤特異性標(biāo)志物mRNA，可進(jìn)行實(shí)體腫瘤的篩查，檢測(cè)腫瘤術(shù)后及淋巴轉(zhuǎn)移陰性的病人外周血腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，以便估計(jì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，制訂合理的治療方案。另外，定量RT-PCR還可用于腫瘤耐藥基因（MDR1）10表達(dá)水平檢測(cè)，為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據(jù)。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$PCR技術(shù)在遺傳病方面的應(yīng)用PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用10就是從檢測(cè)鐮狀細(xì)胞和3-地中海貧血的基因突變開(kāi)始的。十幾年來(lái)，該技術(shù)在

19、遺傳病診斷的臨床應(yīng)用方面獲得了極大的成功。它能用于檢測(cè)已知基因序列的任何遺傳病基因的突變，如倒位、缺失/插入、動(dòng)態(tài)突變、部分高發(fā)的點(diǎn)突變及表達(dá)量的異常等都可通過(guò)基因分析直接檢測(cè)用于臨床進(jìn)行診斷，像地中海貧血、血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、脆X綜合征、苯丙酮尿癥等這些遺傳性疾病。PCR在遺傳病診斷及遺傳病預(yù)防與產(chǎn)前基因診斷方面具有明顯的應(yīng)用價(jià)值，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序已成為檢測(cè)遺傳病基因突變的常用方法。另外，PCR在鑒定編碼抗生素耐藥性基因10,尤其是在細(xì)菌不攜帶同源性序列且取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，具有較高的特異性和敏感性。現(xiàn)了P53、WT1NF1DCCMCC、APC、P16和P21等抑癌基因。在目

20、前PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中對(duì)感染性疾病的診斷10,15極具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測(cè)到任何有限的病原體。一般實(shí)驗(yàn)室可檢出10-100個(gè)基因拷貝，而目前，病原體抗原檢測(cè)方法一般需要105107個(gè)病原體才能檢測(cè)到。PCR技術(shù)的運(yùn)用解決了免疫學(xué)檢測(cè)的窗口期”問(wèn)題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。再者，抗體檢測(cè)不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染時(shí)，也需要用PCR方法來(lái)確定。另外，病原體感染后的發(fā)病時(shí)間和病情輕重均與病原體數(shù)量有關(guān)。如艾滋?。ˋIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根據(jù)HIV檢測(cè)的含量預(yù)知發(fā)病的時(shí)間。因?yàn)锳IDS潛伏期的長(zhǎng)短和臨床癥狀的輕重與血液中的病毒量呈顯著相關(guān)。在其它病

21、毒性疾病中也多半存在類似情況，這均需PCR來(lái)定量說(shuō)明。PCR在HBV定量研究中表明，HBV載量與肝炎的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后以及與藥物療效有關(guān)，并證明定量PCR是鑒別HBV感染各期的良好工具。該技術(shù)能有效地確定血清HBeAg轉(zhuǎn)陰和非活動(dòng)性攜帶者病人的HBVDNA水平，而常規(guī)雜交法則對(duì)這些低病毒血癥的HBVDNA探測(cè)不到。在抗病毒治療中，通過(guò)定量PCR檢測(cè)HBV的載量，來(lái)觀察拉咪味咤及多種聯(lián)合用藥治療慢性乙型肝炎的療效具有指導(dǎo)意義。PCR對(duì)某些傳染性疾病疫苗接種后感染的鑒別也是極為重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接種后感染的病例時(shí)有發(fā)生，是疫苗引起的還是野生型腮腺炎病毒引起的，這就需要一種行之有效的方法來(lái)

22、進(jìn)行鑒別，以往的血清學(xué)、病毒培養(yǎng)及探針雜交等方法都很難做到。過(guò)去，對(duì)結(jié)核病等其他分支桿菌病的診斷方法雖然很多，但均不夠理想。簡(jiǎn)便易行的方法經(jīng)常查不到抗酸桿菌，也無(wú)法鑒別結(jié)核桿菌與其他分支桿菌。用分支桿菌培養(yǎng)的方法且陽(yáng)性率較低又耗時(shí)，而麻風(fēng)桿菌在體外又不能培養(yǎng)，主要靠感染組織的涂片或切片鏡檢。其他方法，如血清學(xué)、氣相色譜等方法的敏感性及特異性都不夠理想，PCR技術(shù)的運(yùn)用使上述問(wèn)題得到了解決。還有PCR技術(shù)在技術(shù)性病監(jiān)控和性病病原體的檢測(cè)方面也正在擴(kuò)大，并列為監(jiān)控手段和作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。5.1假陽(yáng)性通常PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題之一是擴(kuò)增產(chǎn)物污染帶來(lái)的假陽(yáng)性， 而實(shí)驗(yàn)室污染又是假陽(yáng)性的主要

23、因素。只要實(shí)驗(yàn)室被擴(kuò)增產(chǎn)物污染，擴(kuò)增片段隨時(shí)都可能污染新的樣本并又被同一PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增出來(lái)而產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的根本措施就是在封閉狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。近年發(fā)展了一種熒光定量PCR技術(shù)，從根本上解決了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染和不能定量的問(wèn)題。該技術(shù)把基因擴(kuò)增PCR、分子雜交和光化學(xué)融為一體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行全過(guò)程的封閉， 并進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和自動(dòng)分析結(jié)果， 進(jìn)一步提高了其特異性。由于造成假陽(yáng)性的因素相對(duì)單一，因此假陽(yáng)性并不是困惑檢驗(yàn)工作的主要原因。5.2假陰性PCR假陰性的原因相對(duì)較為復(fù)雜，主要包括有儀器設(shè)備的質(zhì)量、試劑開(kāi)殼劑和操作問(wèn)題、PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間及有關(guān)PCR反應(yīng)的關(guān)鍵

24、環(huán)節(jié)等。PCR儀本身的質(zhì)量問(wèn)題能使擴(kuò)增效率下降或造成非特異性擴(kuò)增而出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性。離心機(jī)的質(zhì)量問(wèn)題或使用不正確，可造成離心標(biāo)本模板不能分離而產(chǎn)生假陰性。試劑開(kāi)殼劑和操作問(wèn)題造成標(biāo)本DNA沒(méi)有暴露出來(lái)，致使擴(kuò)增無(wú)法進(jìn)行而導(dǎo)致假陰性。PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶而程現(xiàn)假陰性。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量及PCR循環(huán)條件等，在這些環(huán)節(jié)中操作不當(dāng)都可引起假陰性。另外，Mg2+濃度和物理因素變性等對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響也很大。Mg2+濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量。而變性溫度

25、低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低異性擴(kuò)增效率；退火溫度過(guò)高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率，最終都可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。還有靶序列變異使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增也不會(huì)成功。自從PCR技術(shù)誕生以來(lái)，隨著其深入不斷的發(fā)展與完善，許多與其相關(guān)的新類型及改良的新方法在不斷的涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法解決了以往傳統(tǒng)PCR的瓶頸問(wèn)題。雖然，PCR可對(duì)基因分析直接檢測(cè)用于臨床進(jìn)行診斷，但大部分基因突變還是難以直接檢測(cè)。近年來(lái)，分子診斷技術(shù)最大突破就是集擴(kuò)增、檢測(cè)和靶定量于一體的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的問(wèn)世。該技術(shù)的出現(xiàn)，對(duì)基因檢測(cè)和基因分型的應(yīng)

26、用范圍將進(jìn)一步擴(kuò)大，為PCR的臨床應(yīng)用帶來(lái)曙光。因此，PCR技術(shù)將有極大的發(fā)展空間和廣泛的應(yīng)用前景，它將對(duì)腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)和基因治療等進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用起著積極重要的作用。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中，PCR的應(yīng)用將更加廣泛和深入。相信在不久的將來(lái)，隨著PCR技術(shù)的更進(jìn)一步完善，它將作為常規(guī)檢驗(yàn)方法進(jìn)行全面普及，發(fā)揮更大的作用，為全人類健康做出更大的貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)1,楊道理，王寶成主編.DNA擴(kuò)增技術(shù)與醫(yī)學(xué)應(yīng)用.濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社.1992,51-54,283,396.2,郭永軍,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在腫瘤研究中的應(yīng)用,國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤分冊(cè).1991,18(1):1-3,.陳志杰主編,醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù),濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社,1993:544.陳意生，史景泉主編,