分子生物學技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應用進展

1、分子生物學技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應用進展摘要分子生物學技術(shù)是醫(yī)學檢驗的重要診療手段。本文概述醫(yī)學檢驗中常用的分子生物學技術(shù)，列舉其在臨床病原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷中的具體生曳，分析分子生物學技術(shù)應用中應注意的問題,并對發(fā)展趨勢進行預測。關(guān)鍵詞分子生物學技術(shù)；醫(yī)學檢驗；應用；進展分子生物學是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子為也定對象的學科，分子生物學技術(shù)即建立在核酸生化基礎上的一類研究手段，現(xiàn)已廣泛應用于醫(yī)學檢驗中。研究內(nèi)容也從DNA鑒定、擴展到核酸及表達產(chǎn)物分析，技術(shù)不斷進步為原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統(tǒng)疾病診斷提供重要依據(jù)和創(chuàng)新思路。現(xiàn)就分子生物

2、學技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應用進展進行綜述，試分析應注意的問題及預測發(fā)展趨勢。1醫(yī)學檢驗中常用的分子生物學技術(shù)概述分子生物學技術(shù)的核心是聚合酶鏈反應（PCR）,能在最短的時間內(nèi)擴增。由此衍生出新PCR技術(shù)，如原位PCR技術(shù)、實時定量PCR、鏈置換擴增技術(shù)、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技術(shù)、核酸探針技術(shù)、生物傳感器、SELEX技術(shù)、循環(huán)核酸分析技術(shù)都極大的完善了檢驗技術(shù)，直接解釋生命規(guī)律，在臨床診斷和治療中意義重大。2分子生物學技術(shù)在臨床中的具體應用2.1病原微生物檢驗PCR和生物芯片技術(shù)用于病原微生物檢驗術(shù)與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定、免疫測定相比，其具有高的敏感性，較短的耗時和更廣的適用范圍1

3、。PCR通過向反應管中加入特異性引物可同時鑒定出單種或多種病原體，即便存在大量死菌也能得到準確結(jié)果，不受混合標本和微生物生長時間的限制。生物芯片技術(shù)則以其更高的靈敏性和高效率，同時檢測出上百種病原微生物，可用于快速查找樣本的耐藥基因指導臨床用藥。2.2腫瘤及遺傳病診斷研究證實腫瘤及遺傳病幾乎都存在著一定的基因缺陷，只要找到人體中與基因相互作用的結(jié)合點，從基因水平診斷就能準確診斷。通過基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突變，通過分子蛋白質(zhì)組學、生物傳感器和流式細胞術(shù)診斷腫瘤特異性標志物。在遺傳病中，分子生物技術(shù)能識別患病家族基因存在的特定多態(tài)性，常用技術(shù)有DNA限制性片段長度多態(tài)性分析，單鏈構(gòu)象

4、多態(tài)性分析，熒光原位雜交染色體分析，酶基因調(diào)控和微陣列技術(shù)。2.3免疫系統(tǒng)疾病診斷免疫系統(tǒng)疾病診斷關(guān)鍵是確定基因水平上的調(diào)控表達。如在人類免疫缺陷病毒的研究中，分子生物納米技術(shù)即以抗體為基礎，用免疫分析和磁性修飾的方法來檢測免疫物質(zhì)，通過酶、熒光劑、同位素把特異的抗體抗原與納米磁性微球固定，既能自動檢測人免疫缺陷病毒1型和2型抗體，為人類防治病毒性疾病提供了有力的武器。3分子生物學技術(shù)在檢驗應用的新進展現(xiàn)階段分子生物學新技術(shù)的發(fā)展方興未艾，給人們提供了探索人類生命科學的工具，推動了檢驗學發(fā)展。分子生物技術(shù)最顯著的醫(yī)學成就是對遺產(chǎn)病中的致病基因的準確定位及克隆，早在1998年就完成了遺傳性耳聾的

5、基因克?。?003年SARS肆虐時，科學家就研制出專門診斷該病的基因芯片；2004年后實現(xiàn)了用多重PCR技術(shù)對我國新生兒多發(fā)的地中海貧血、苯丙酮尿癥、G6DP缺乏癥的產(chǎn)前和病例診斷；近年來，遺傳標記技術(shù)的進步，結(jié)合現(xiàn)有分子學研究技術(shù)，加速了遺傳基因圖譜的制作和相關(guān)疾病的基因檢測和鑒定，從而為醫(yī)學檢驗的加速發(fā)展提供了有效的載體。4存在問題及發(fā)展趨勢現(xiàn)階段面臨的問題主要是技術(shù)相對復雜和儀器要求太高、藥品和反應盒昂貴等2,限制了臨床推廣。首先，合理選用檢驗項目的問題，分子生物學方法具有高特異性和高靈敏性，但臨床中仍要根據(jù)實際需要選用經(jīng)濟合理的檢驗項目，如結(jié)核菌培養(yǎng)和涂片鏡檢就能達到目的，不必舍廉選貴

6、，增加患宣負擔。其次，疾病診斷過度依賴檢驗結(jié)果問題，應將臨床資料綜合考慮，不能僅靠分子生物學技術(shù)檢驗結(jié)果就妄下診斷，忽略標本取樣和檢驗過程中的操作不當及病程發(fā)展規(guī)律造成的假陽性或是假陰性，貽誤病情。再者，上級部門管理不足問題,國家相關(guān)部門要擔任監(jiān)管的職責，參考國際慣例，制定符合我國醫(yī)學檢驗現(xiàn)狀的實驗操作管理規(guī)章制度，嚴格培訓檢驗人員，規(guī)范試劑的準入和儀器的管理，最大程度保證檢驗結(jié)果的可信度。雖然分子生物技術(shù)在臨床推廣應用中存在著許多尚待解決的問題，但是它仍然顯現(xiàn)出了快速發(fā)展的趨勢。未來其發(fā)展會傾向于：現(xiàn)有、僅停留在實驗室的分子生物學技術(shù)逐步向臨床實用型改進，降低實驗投入、簡化操作步驟，推進實驗

7、過程全自動化的實施降低人為因素對結(jié)果的影響，根據(jù)臨床實際修正技術(shù)，提高檢驗的特異性和敏感性。積極推進實驗室建設，加大儀器和檢驗人員的培訓投入，為分子生物學的臨床應用提供必要的基礎保障，以先進的、可持續(xù)性的實驗檢驗手段為臨床提供可靠的依據(jù)。參考文獻YuregirOO,SahinFI,YilmazZ,etal.Fluorescentinsituhybrid-izationstudiesinmultiplemyelomaJ.Hematology,2009,14(2):90-94.2李鵬.現(xiàn)代分子生物學技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應用J.臨床和實驗醫(yī)學雜志,2007,3(6):161.PCR在現(xiàn)代醫(yī)學檢驗中的應

8、用關(guān)鍵詞：醫(yī)學檢驗應用PCR現(xiàn)代醫(yī)學檢驗王耿新劉德亮王志群陳獻業(yè)山東省青島市腫瘤醫(yī)院青島266042聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction,PCR）又稱體外基因擴增技術(shù)或DNA擴增技術(shù)。 自1985年美國PE-Cetus公司的K.BMullis等人首創(chuàng)了PCR技術(shù)之后， 它以相當驚人的速度被廣泛地應用于醫(yī)學及分子生物學等各個領域?，F(xiàn)今，PCR技術(shù)已成為一種對標本中特定的DNA片段進行分析研究和檢測鑒定的重要方法。近20年來PCR技術(shù)在生物醫(yī)學等各個研究領域和臨床應用中發(fā)揮了重大的作用，在病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學研究、癌基因探索及治療等方面都作出了相應的貢獻。PCR技

9、術(shù)的基本原理與特點1-2PCR技術(shù)的基本原理是模仿DNA體內(nèi)復制的機制，在體外進行擴增特異的DNA片段。它主要是由三個基本步驟組成的循環(huán)反應。首先是變性，用加熱的方法使雙鏈DNA解鏈成兩股單鏈；其次是復性，用降溫的辦法使這兩股單鏈按堿基互補的原則分別與加入的兩條人工合成的寡聚核甘酸鏈（引物）結(jié)合成雙鏈；最后是延伸，在合適的緩沖液、鎂離子及脫氧核甘酸存在的條件下， 用DNA聚合酶進行催化， 按堿基配對的原則合成互補鏈。 引物從3端進行延伸，合成的方向為5端（一條人工合成的引物）至3端，從而合成與模板DNA結(jié)構(gòu)相同的片段。重復上述三步驟，變性一復性一引物延伸的過程，經(jīng)過約30個周期的循環(huán)（每三個步

10、驟為一周期，約需2-3分鐘），1-2小時就能將所需基因擴增幾百萬倍，使極微量的所需DNA達到極易檢測的水平。其擴增效率公式為：Y=（1+X）n,式中丫為擴增數(shù)目，X為放大效率，n為循環(huán)次數(shù)。PCR技術(shù)具有敏感性高、特異性強、操作簡便、快速省時等特點。其靈敏度可達到Pg級，甚至達到fg級3水平，而被擴增的基因片段能與原基因片段保持不變。PCR技術(shù)操作簡便、快速而易掌握，并且對標本要求不高。用過去的方法完成一項試驗少則幾周,多則幾個月。應用全自動DNA擴增儀，整個PCR過程均由電腦控制，只需數(shù)小時即可完成整個試驗過程，用極微量的粗制標本就可獲取目的產(chǎn)物。常用的幾種PCR及主要用途4-5ered_7

11、fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$定量PCR:用于mRNA定量及轉(zhuǎn)錄水平的研究。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$抗原捕獲PCR(AC-PCR):用于病毒感染的檢測。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$不對稱PCR(AsymmetricPCR):用于制備探針或測序。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$彩色PCR(CCA-PCR)用于檢測某些多型別病毒的混合感染。ered_7fc99c46-f88e-4744-82

12、5c-061b591dded3$原位逆轉(zhuǎn)錄PCR(InSituRT-PCR):定位檢測細胞中RNA病毒感染。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR):用于克隆cDNA、 檢測RNA病毒、cDNA探針。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$反向PCR(invertedPCR):用于擴增已知基因片段兩側(cè)的未知序列。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$膜PCR(membrane-boundPCR):可去除污染的雜質(zhì)或PCR產(chǎn)物殘留，檢測

13、低豐度靶DNA。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$間接原位PCR(IndirectInSituPCR):定位檢測細胞中DNA病毒感染，是目前應用較廣泛的一種原位PCR技術(shù)，其特異性比直接PCR強。PCR技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的地位現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，人類疾病多數(shù)是直接或間接與基因有關(guān)6,如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。在醫(yī)學實驗診斷中我們經(jīng)歷了生化和免疫診斷的發(fā)展過程，由于各類擴增技術(shù)的出現(xiàn)使我們進入了基因診斷的新時代并成就了現(xiàn)代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對疾病的表型認識和表型診斷，從本質(zhì)上認識疾病和診斷疾病。在各類擴增技術(shù)中，PCR的地位尤為突出

14、。目前，全世界利用PCR技術(shù)診斷感染性疾病每年達幾千萬人次，其費用早已大幅下降，說明PCR有著巨大的潛在市場。美國臨床檢驗標準化委員會于頒布了關(guān)于感染性疾病分子診斷應用范圍、條件和質(zhì)量控制細則等準則文件7。而國際臨床化學學會于1998年又發(fā)布了關(guān)于分子擴增在臨床診斷中應用的質(zhì)量評估基礎的文件并對PCR操作的各個環(huán)節(jié)進彳T了詳細論述8。由此可見，兩個權(quán)威性文件也都肯定了PCR技術(shù)在醫(yī)學檢驗方面的重要性。基因診斷可能將是以后的發(fā)展方向并作為疾病的常規(guī)診斷技術(shù)。PCR技術(shù)在醫(yī)學檢驗中的應用ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$PCR技術(shù)在腫瘤方面的應用目

15、前，腫瘤發(fā)病的分子機制尚不完全清楚。研究表明，人類許多常見的腫瘤疾病與某些病毒病因及腫瘤相關(guān)基因的遺傳學改變有著密切的關(guān)系。PCR技術(shù)的腫瘤病毒病因、腫瘤相關(guān)基因、腫瘤相關(guān)抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。據(jù)有關(guān)資料表明1,4前列腺癌、結(jié)腸癌和Kaposi肉瘤等與人巨細胞病毒（CMV）有關(guān)；鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤與EB病毒有關(guān)；原發(fā)性肝癌與乙型肝炎病毒（HBV）有關(guān)；泌尿道腫瘤和食道腫瘤等與人乳頭瘤病毒（HPV）有關(guān)。人類腫瘤病毒病因中較為重要的一類病毒是HPV,其中大部分只與良性增生有關(guān)，只有16、18、31、339等十余型與惡性腫瘤關(guān)系密切。PCR在檢測HPV,尤其是第16、18型有

16、無感染，對子宮頸癌的早期診斷及預防有著顯著的意義。目前，已知腫瘤相關(guān)基因有上百多種，但較常見的是ras家族的H-ras、K-ras和N-ras三種癌基因。它們的結(jié)構(gòu)相似，其表達產(chǎn)物是P21蛋白。在不同腫瘤中ras家族癌基因的H-ras、K-ras點突變多集中在第12和61號密碼子上，而N-ras在第13號密碼子上多發(fā)生突變。PCR在癌基因的研究方面主要是ras基因與腫瘤的關(guān)系。現(xiàn)已查明與ras基因突變有關(guān)1,2,4,9,10的腫瘤有幾十種。如：各種急性慢性白血病、精原細胞癌、惡性黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸1995年癌、子宮瘤等。Rb基因11是人類最早（1986年

17、）發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其后又相繼發(fā)遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤研究中發(fā)現(xiàn)位于13號染色體上Rb基因的缺失與癌變有關(guān)。在許多常見腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，常發(fā)現(xiàn)該基因失活11。在P53基因的研究中12-14發(fā)現(xiàn)該基因的突變和缺失是許多腫瘤發(fā)生的原因，這些腫瘤主要有子宮頸癌、肝癌、成骨肉瘤等。遺傳學改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導致了細胞癌變。PCR不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可據(jù)此進行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預后評估等。近年，剛興起的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR10在腫瘤診斷、治

18、療和微轉(zhuǎn)移以及微小殘留病灶檢測等方面具有廣泛的應用價值。研究表明，癌細胞或癌前期細胞在進入血液循環(huán)以后，通過定量RT-PCR檢測外周血腫瘤特異性標志物mRNA，可進行實體腫瘤的篩查，檢測腫瘤術(shù)后及淋巴轉(zhuǎn)移陰性的病人外周血腫瘤細胞的數(shù)量，以便估計腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，制訂合理的治療方案。另外，定量RT-PCR還可用于腫瘤耐藥基因（MDR1）10表達水平檢測，為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據(jù)。ered_7fc99c46-f88e-4744-825c-061b591dded3$PCR技術(shù)在遺傳病方面的應用PCR技術(shù)首次臨床應用10就是從檢測鐮狀細胞和3-地中海貧血的基因突變開始的。十幾年來，該技術(shù)在

19、遺傳病診斷的臨床應用方面獲得了極大的成功。它能用于檢測已知基因序列的任何遺傳病基因的突變，如倒位、缺失/插入、動態(tài)突變、部分高發(fā)的點突變及表達量的異常等都可通過基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，像地中海貧血、血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、脆X綜合征、苯丙酮尿癥等這些遺傳性疾病。PCR在遺傳病診斷及遺傳病預防與產(chǎn)前基因診斷方面具有明顯的應用價值，PCR產(chǎn)物直接測序已成為檢測遺傳病基因突變的常用方法。另外，PCR在鑒定編碼抗生素耐藥性基因10,尤其是在細菌不攜帶同源性序列且取單個菌落進行PCR擴增時，具有較高的特異性和敏感性?，F(xiàn)了P53、WT1NF1DCCMCC、APC、P16和P21等抑癌基因。在目

20、前PCR在醫(yī)學檢驗中對感染性疾病的診斷10,15極具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測到任何有限的病原體。一般實驗室可檢出10-100個基因拷貝，而目前，病原體抗原檢測方法一般需要105107個病原體才能檢測到。PCR技術(shù)的運用解決了免疫學檢測的窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。再者，抗體檢測不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染時，也需要用PCR方法來確定。另外，病原體感染后的發(fā)病時間和病情輕重均與病原體數(shù)量有關(guān)。如艾滋?。ˋIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根據(jù)HIV檢測的含量預知發(fā)病的時間。因為AIDS潛伏期的長短和臨床癥狀的輕重與血液中的病毒量呈顯著相關(guān)。在其它病

21、毒性疾病中也多半存在類似情況，這均需PCR來定量說明。PCR在HBV定量研究中表明，HBV載量與肝炎的發(fā)生、發(fā)展、預后以及與藥物療效有關(guān)，并證明定量PCR是鑒別HBV感染各期的良好工具。該技術(shù)能有效地確定血清HBeAg轉(zhuǎn)陰和非活動性攜帶者病人的HBVDNA水平，而常規(guī)雜交法則對這些低病毒血癥的HBVDNA探測不到。在抗病毒治療中，通過定量PCR檢測HBV的載量，來觀察拉咪味咤及多種聯(lián)合用藥治療慢性乙型肝炎的療效具有指導意義。PCR對某些傳染性疾病疫苗接種后感染的鑒別也是極為重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接種后感染的病例時有發(fā)生，是疫苗引起的還是野生型腮腺炎病毒引起的，這就需要一種行之有效的方法來

22、進行鑒別，以往的血清學、病毒培養(yǎng)及探針雜交等方法都很難做到。過去，對結(jié)核病等其他分支桿菌病的診斷方法雖然很多，但均不夠理想。簡便易行的方法經(jīng)常查不到抗酸桿菌，也無法鑒別結(jié)核桿菌與其他分支桿菌。用分支桿菌培養(yǎng)的方法且陽性率較低又耗時，而麻風桿菌在體外又不能培養(yǎng)，主要靠感染組織的涂片或切片鏡檢。其他方法，如血清學、氣相色譜等方法的敏感性及特異性都不夠理想，PCR技術(shù)的運用使上述問題得到了解決。還有PCR技術(shù)在技術(shù)性病監(jiān)控和性病病原體的檢測方面也正在擴大，并列為監(jiān)控手段和作為檢測的金標準。5.1假陽性通常PCR在醫(yī)學檢驗應用中所面臨的問題之一是擴增產(chǎn)物污染帶來的假陽性， 而實驗室污染又是假陽性的主要

23、因素。只要實驗室被擴增產(chǎn)物污染，擴增片段隨時都可能污染新的樣本并又被同一PCR反應體系擴增出來而產(chǎn)生假陽性。解決的根本措施就是在封閉狀態(tài)下進行擴增和產(chǎn)物分析。近年發(fā)展了一種熒光定量PCR技術(shù)，從根本上解決了PCR擴增產(chǎn)物污染和不能定量的問題。該技術(shù)把基因擴增PCR、分子雜交和光化學融為一體，實現(xiàn)了對PCR擴增產(chǎn)物進行全過程的封閉， 并進行實時動態(tài)檢測和自動分析結(jié)果， 進一步提高了其特異性。由于造成假陽性的因素相對單一，因此假陽性并不是困惑檢驗工作的主要原因。5.2假陰性PCR假陰性的原因相對較為復雜，主要包括有儀器設備的質(zhì)量、試劑開殼劑和操作問題、PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間及有關(guān)PCR反應的關(guān)鍵

24、環(huán)節(jié)等。PCR儀本身的質(zhì)量問題能使擴增效率下降或造成非特異性擴增而出現(xiàn)假陰性或假陽性。離心機的質(zhì)量問題或使用不正確，可造成離心標本模板不能分離而產(chǎn)生假陰性。試劑開殼劑和操作問題造成標本DNA沒有暴露出來，致使擴增無法進行而導致假陰性。PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失不出現(xiàn)擴增條帶而程現(xiàn)假陰性。PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量及PCR循環(huán)條件等，在這些環(huán)節(jié)中操作不當都可引起假陰性。另外，Mg2+濃度和物理因素變性等對PCR擴增效率影響也很大。Mg2+濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量。而變性溫度

25、低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率，最終都可導致PCR擴增失敗。還有靶序列變異使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增也不會成功。自從PCR技術(shù)誕生以來，隨著其深入不斷的發(fā)展與完善，許多與其相關(guān)的新類型及改良的新方法在不斷的涌現(xiàn)，這些派生出的新類型和新方法解決了以往傳統(tǒng)PCR的瓶頸問題。雖然，PCR可對基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，但大部分基因突變還是難以直接檢測。近年來，分子診斷技術(shù)最大突破就是集擴增、檢測和靶定量于一體的實時熒光PCR技術(shù)的問世。該技術(shù)的出現(xiàn)，對基因檢測和基因分型的應

26、用范圍將進一步擴大，為PCR的臨床應用帶來曙光。因此，PCR技術(shù)將有極大的發(fā)展空間和廣泛的應用前景，它將對腫瘤學、遺傳學、免疫學、微生物學、寄生蟲學和基因治療等進一步研究及臨床應用起著積極重要的作用。在現(xiàn)代醫(yī)學檢驗中，PCR的應用將更加廣泛和深入。相信在不久的將來，隨著PCR技術(shù)的更進一步完善，它將作為常規(guī)檢驗方法進行全面普及，發(fā)揮更大的作用，為全人類健康做出更大的貢獻。參考文獻1,楊道理，王寶成主編.DNA擴增技術(shù)與醫(yī)學應用.濟南：山東科學技術(shù)出版社.1992,51-54,283,396.2,郭永軍,聚合酶鏈式反應在腫瘤研究中的應用,國外醫(yī)學腫瘤分冊.1991,18(1):1-3,.陳志杰主編,醫(yī)學檢驗新技術(shù),濟南：山東科學技術(shù)出版社,1993:544.陳意生，史景泉主編,