免疫學(xué)檢驗(yàn)-知識(shí)點(diǎn)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第一章 概 論1. 免疫學(xué)(Immunology)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，并通過對(duì)其在免疫應(yīng)答過程中所產(chǎn)生的免疫保護(hù)與免疫損傷機(jī)制的研究，探討有效的免疫措施，實(shí)現(xiàn)以防病、治病為目的的一門現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。免疫學(xué)技術(shù)對(duì)推動(dòng)免疫學(xué)的發(fā)展及基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)的結(jié)合起了重要作用。學(xué)習(xí)免疫學(xué)的基本概念，了解臨床免疫學(xué)的理論基礎(chǔ)，掌握免疫技術(shù)的檢測(cè)原理是學(xué)習(xí)和研究臨床免疫學(xué)與免疫技術(shù)的重要保障。第一節(jié) 免疫學(xué)簡介1. 免疫（immunity）是機(jī)體識(shí)別和排斥抗原性異物的一種生理功能。免疫系統(tǒng)與機(jī)體的其他系統(tǒng)相互配合，相互制約，共同維持機(jī)體在生命過程中的生理平衡。1、 免疫學(xué)概念與免

2、疫應(yīng)答1. 宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)能識(shí)別并清除從外環(huán)境中侵入的病原生物及其產(chǎn)生的毒素、內(nèi)環(huán)境中因基因突變產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞、自身衰老殘損的組織細(xì)胞或自身變性抗原，實(shí)現(xiàn)免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視。 免疫防御指機(jī)體排斥外源性異物的能力。 免疫自穩(wěn)指機(jī)體識(shí)別和清除自身衰變殘損的組 織細(xì)胞的能力，以維持正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。 免疫監(jiān)視指機(jī)體殺傷和清除異常突變細(xì)胞的能力，以監(jiān)視和抑制惡性腫瘤在體內(nèi)生長。2. 免疫應(yīng)答反應(yīng)（immune response）：是指機(jī)體免疫系統(tǒng)接受抗原刺激發(fā)生一系列反應(yīng)，并以排出或分解該抗原為目的的反應(yīng)過程。 免疫應(yīng)答的過程主要分為：識(shí)別階段（recognition phase）抗原識(shí)別

3、處理傳遞信息活化階段（activation phase） 免疫細(xì)胞活化增殖產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞、分子效應(yīng)階段（response phase） 執(zhí)行效應(yīng)功能3. 免疫應(yīng)答效應(yīng)大多為生理性，是機(jī)體對(duì)外來抗原或自身變性抗原的清除效應(yīng)。免疫應(yīng)答反應(yīng)過強(qiáng)時(shí)，可致機(jī)體組織或器官發(fā)生病理損傷，出現(xiàn)臨床疾病。 2、 免疫組織與器官1. 免疫系統(tǒng)(immune system)由免疫器官、免疫細(xì)胞和免疫分子構(gòu)成。淋巴組織及免疫細(xì)胞分布于機(jī)體全身，執(zhí)行免疫防衛(wèi)功能，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境正常的生理功能及動(dòng)態(tài)平衡。免疫器官按功能不同，分為中樞免疫器官和外周免疫器官。 中樞免疫器官是免疫細(xì)胞產(chǎn)生、分化和成熟的場(chǎng)所。 外周免疫器官是免疫

4、應(yīng)答的場(chǎng)所。2. 單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞經(jīng)血液循環(huán)及淋巴循環(huán)，進(jìn)出于外周淋巴組織及淋巴器官，形成機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫網(wǎng)絡(luò)。3. 通過免疫網(wǎng)絡(luò)，免疫細(xì)胞能及時(shí)到達(dá)機(jī)體各臟器及皮膚粘膜的病原微生物入侵部位，又能將機(jī)體各部位的抗原成分經(jīng)抗原遞呈細(xì)胞攜帶至相應(yīng)淋巴組織及淋巴器官，活化T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞，執(zhí)行特異性免疫應(yīng)答功能。 4. （一）中樞淋巴器官：骨髓: （1）是造血干細(xì)胞生成、分化發(fā)育的場(chǎng)所； （2）是功能性B細(xì)胞分化成熟的唯一場(chǎng)所； （3）提供各種免疫細(xì)胞的前體細(xì)胞； T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所 胸腺: T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所 （二）外周淋巴器官：淋巴結(jié)、脾臟、粘膜相關(guān)淋巴組織（扁桃體、闌尾等） （三

5、） 淋巴細(xì)胞再循環(huán)與歸巢 淋巴細(xì)胞在全身器官組織及體液中的循環(huán)，可擴(kuò)大與病原異物抗原接觸的機(jī)遇，并將被抗原激活的淋巴細(xì)胞引流入局部淋巴組織及器官，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APC)間發(fā)揮協(xié)同的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的效應(yīng)淋巴細(xì)胞定向地遷移于病原異物部位，發(fā)揮免疫效應(yīng)功能。 5. 外周免疫器官及外周淋巴組織既是淋巴細(xì)胞再循環(huán)的起點(diǎn)和中途站，也是淋巴細(xì)胞歸巢的終點(diǎn)。淋巴細(xì)胞在發(fā)揮免疫效應(yīng)的同時(shí)，被歸巢受體引導(dǎo)回該類細(xì)胞的原定居處，進(jìn)行修整、增殖和發(fā)育，以提高該類淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能，這是保證淋巴細(xì)胞功能健全的重要環(huán)節(jié)。 3、 免疫細(xì)胞1. 免疫細(xì)胞

6、：凡參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞統(tǒng)稱為免疫細(xì)胞，按免疫細(xì)胞在體內(nèi)的作用不同分為三大類。 淋巴細(xì)胞 T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞 （能增殖分化并產(chǎn)生免疫效應(yīng)） 免疫輔助細(xì)胞吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC） （參與輔助淋巴細(xì)胞的活化） 免疫應(yīng)答細(xì)胞中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞（參與免疫應(yīng)答的某一環(huán)節(jié)） 四、 免疫分子 1. 免疫分子是由一些免疫活性細(xì)胞或相關(guān)細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)及小分子多肽物質(zhì)組成，它們參與機(jī)體的免疫反應(yīng)或免疫調(diào)節(jié)。主要的免疫分子：免疫球蛋白（Ig）、補(bǔ)體系統(tǒng) （C）、細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子（CAM）、白細(xì)胞分化抗原（CD）第二節(jié) 臨床免疫學(xué)1. 臨床免疫學(xué)(clin

7、ical immunology)是將免疫學(xué)基礎(chǔ)理論、臨床醫(yī)學(xué)疾病與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，用于研究疾病的免疫病理機(jī)制、診斷與鑒別診斷、評(píng)價(jià)治療效果和判斷愈后的多個(gè)分支學(xué)科的總稱。 第三節(jié) 臨床免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)1. 免疫學(xué)檢驗(yàn)（laboratory immunology）是研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的重要學(xué)科。2. 第二章 抗原抗體反應(yīng)1. 抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。物質(zhì)基礎(chǔ): 抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合 抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合 抗原抗體之間的結(jié)合力 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體2. 抗原抗體結(jié)合力：靜電引力、范德華引力:作用最小、氫鍵:最具特異

8、性、疏水作用力:作用最大 。3. 親和力(affinity)：抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引力，是抗原抗體間固有的結(jié)合力。 親合力(avidity)：抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合的強(qiáng)度。4. 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體： 5. 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)： 特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性，分子基礎(chǔ)抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性 可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性，影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離； 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度。 比例性：抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵

9、循一定的量比關(guān)系， 前帶(prezone)：抗體過量 后帶(postzone)：抗原過量 等價(jià)帶(equivalence zone)： 抗原抗體比例合適 階段性：第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見; 第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象。6. 交叉反應(yīng)（cross reactions）：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)。7. 影響抗原抗體反應(yīng)的因素： 抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素：抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目 抗體:來源、特異性、親和性、效價(jià) 環(huán)境因素：電解質(zhì): 生理鹽水或緩沖液 酸堿度: pH6pH9 溫 度:

10、1540，37最適8. 標(biāo)記免疫技術(shù)：用熒光物質(zhì)、放射性核素、酶或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記抗原或抗體，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后，通過檢測(cè)標(biāo)記物對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量分析 按實(shí)際用途分為: 免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry technique,IHCT) 免疫測(cè)定(immunoassay) 按測(cè)定反應(yīng)體系的物理狀態(tài)分為: 均相免疫測(cè)定(homogenous immunoassay） 非均相免疫測(cè)定(heterogenous immunoassay) 按檢測(cè)現(xiàn)象分為: 放射免疫技術(shù) 熒光免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) 金免疫技術(shù)9. 第三章 免疫原和抗血清的制備第一

11、節(jié) 免疫原的制備1. 免疫原(immunogen)是能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與抗體發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)。類型： 顆粒性抗原細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲 可溶性抗原蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、核酸2. 顆粒性抗原的制備 細(xì)胞抗原：綿羊紅細(xì)胞 細(xì)菌抗原：菌體抗原、鞭毛抗原 寄生蟲體抗原：蟲卵3. 可溶性抗原的制備和純化 可溶性抗原的制備 組織細(xì)胞抗原的制備： 高速搗碎法組織搗碎機(jī)搗碎 研磨法用玻璃勻漿器或乳缽研磨 組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞可溶性抗原的制備： 反復(fù)凍融法-20凍結(jié)，然后室溫融化 超聲破碎法超聲波（120kHz） 自溶法自身酶系 酶處理法溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶 表面活性劑處理法SDS、去氧膽酸鈉、二乙基十六烷基

12、溴 免疫球蛋白片段的制備： 非共價(jià)鍵解離法改變pH 、利用強(qiáng)變性劑 共價(jià)鍵解離法氧化法和還原法 溴化氰裂解法 酶解法木瓜酶 、胃蛋白酶 4. 可溶性抗原的純化 超速離心法： 差速離心法低速和高速離心交替進(jìn)行 密度梯度離心法區(qū)帶離心法 選擇性沉淀法： 核酸去除法氯化錳、硫酸魚精蛋、鏈霉素 鹽析法硫酸銨、硫酸鈉 有機(jī)溶劑沉淀法乙醇、丙酮 聚合物沉淀法聚乙二醇 凝膠過濾法：利用凝膠的分子篩作用，對(duì)分子量不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離 離子交換層析法：利用蛋白質(zhì)帶電荷不同進(jìn)行分離 離子交換劑：離子交換纖維素、離子交換凝膠、離子交換樹脂 親和層析法：利用生物大分子之間具有的專一性親和力 (1)親和層析支持物的選擇

13、：非特異性吸附低；液體流速快；在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；有合適豐富的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié) 合；有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。最常用的支持物是Separose4B (2)配體的選擇條件：抗原或抗體必須單一特異性；抗原與抗體必須具有較高的親和力；配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)。(3)抗原或抗體與支持物的結(jié)合：活化：溴化氰；接“手臂”：帶“手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖、羧基瓊脂糖、溴乙酰瓊脂糖、重氮鹽衍生物瓊脂糖、疏基瓊脂糖。(4)親和層析條件的選擇： 封閉活性基團(tuán)：用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過柱；除去未結(jié)合和結(jié)合不牢的蛋白：先用NaHCO3洗脫，再用解脫劑處理；解脫劑：3mol/L 硫氰酸

14、鉀（或鈉）、0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液電泳法：利用分子量和電荷量不同進(jìn)行分離 （2） 純化抗原的鑒定蛋白含量測(cè)定：紫外吸收法、雙縮脲法、酚試劑法分子量測(cè)定：SDS-PAGE、凝膠過濾純度鑒定：醋酸纖維膜電泳、SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳、等電聚焦、高效液相層析免疫活性鑒定：雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳、ELISA3、 半抗原性免疫原的制備半抗原(hapten)：僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)如多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等 。載體(carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)（1） 載體蛋白質(zhì)：牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白 牛甲狀腺球蛋白 血藍(lán)蛋白多肽聚合物：多聚賴氨酸（p

15、olylysine） 大分子聚合物：羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose, CMC) 聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone,PVP）（2） 半抗原與載體的連接方法物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原 吸附的載體有CMC、PVP、硫酸葡聚糖等 化學(xué)方法：利用某些功能基團(tuán)將半抗原連接到載體上 帶有游離氨基或羧基以及兩種基團(tuán)都有的半抗原：碳二亞胺法 戊二醛法 混和酸酐法 過碘酸氧化法 不帶氨基和羧基的半抗原：用化學(xué)方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，再與載體連接 （3） 半抗原性免疫原的鑒定一個(gè)載體分子至少要連接20個(gè)以上的半抗原分子 半抗原與

16、載體的比例測(cè)定： 吸收光譜分析法 放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法第2節(jié) 免疫佐劑免疫佐劑（immunoadjuvant）：預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答的類型的物質(zhì)稱為免疫佐劑,簡稱佐劑（adjuvant）。1、 佐劑的種類 化合物:氫氧化鋁、明礬、礦物油、吐溫-80、弗氏不完全佐劑以及人工合成的多聚肌苷酸 胞苷酸(poly IC)、脂質(zhì)體 生物制劑:處理改造的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗、短小棒狀桿菌、百日咳桿菌及CTB、LPS和類脂A、胞壁酰二肽等；細(xì)胞因子及熱休克蛋白 用于人體的佐劑：氫氧化鋁、明礬、poly IC、胞壁酰二肽、細(xì)胞因子、熱休克蛋白常用于動(dòng)物

17、實(shí)驗(yàn)的佐劑：弗氏佐劑(Freunds adjuvant) 弗氏佐劑(Freund,s adjuvant)：弗氏完全佐劑羊毛脂與液體石蠟的混合物弗氏不完全佐劑弗氏完全佐劑加卡介苗乳化方法： 研磨法和攪拌混合法 2、 佐劑的作用機(jī)制改變抗原物理性狀，延緩其降解和排除，更有效刺激免疫系統(tǒng)。 刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其處理和提呈抗原的能力。 刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化。 第3節(jié) 抗血清的制備抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動(dòng)物，該動(dòng)物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體 。多克隆抗體(polyc

18、lonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多種B淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的多種抗體的混合物 1、 免疫動(dòng)物的選擇 抗原來源與動(dòng)物種屬的關(guān)系 種屬差異越遠(yuǎn)，免疫原性越強(qiáng) 動(dòng)物個(gè)體的選擇 適齡、健康、體重符合要求 抗原的性質(zhì)2、 免疫程序免疫原的劑量 中間劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量增加可獲得高效價(jià)抗體 免疫間隔時(shí)間 第一次和第二次間隔1020天，三次及以后間隔710天免疫途徑 皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、淋巴結(jié) 3、 動(dòng)物采血法頸動(dòng)脈采血法：家兔、綿羊、山羊 心臟采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、雞 靜脈采血法： 家兔、山羊、綿羊 第4節(jié) 抗血清的鑒定和保存1、 抗血清的鑒定抗體特異性的鑒定：雙向免疫擴(kuò)散法抗體效價(jià)的鑒定：凝集試驗(yàn) 、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、ELISA 抗體純度的鑒定：SDS-PAGE 、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳 抗體親合力的鑒定：平衡透析法、ELISA、RIA競(jìng)爭結(jié)合試驗(yàn)2、 抗血清的保存28保存：短期保存冰凍保存：保存5年真空干燥