第18章 高效液相色譜法

1、第20章 高效液相色譜法20.1 概述20.2 高效液相色譜儀20.3 液相色譜分離分析法20.4 高效液相色譜固定相和流動(dòng)相20.1 概述一、高效液相色譜的特點(diǎn)二、高效液相色譜的分類分析對(duì)象分析對(duì)象氣相色譜：氣相色譜：氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，占有機(jī)物總數(shù)20%高效液相色譜：高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、分子量大的物質(zhì)，占有機(jī)物總數(shù)80%流動(dòng)相流動(dòng)相氣相色譜：氣相色譜：對(duì)組分沒有親和力的惰性氣體，對(duì)分離選擇性幾乎無影響高效液相色譜：高效液相色譜：可選用不同極性的液體；選擇余地大；對(duì)分離影響大（與組分或固定相均作用）色譜柱溫色譜柱溫氣相色譜：氣相色譜：一般較高高效液相色譜：高效液相色譜：通常為室溫高效液相

2、色譜 vs 氣相色譜一、高效液相色譜的特點(diǎn)一、高效液相色譜的特點(diǎn)n高壓： 150 - 350 105 Pa n高速： 一般 1 h, 10mmn半制備色譜 柱內(nèi)徑5-10mmn分析型色譜 柱內(nèi)徑 5 mm按分離規(guī)模20.2 高效液相色譜儀1.1.流程流程一、流程及主要部件一、流程及主要部件n高壓輸液系統(tǒng)n進(jìn)樣系統(tǒng)n分離系統(tǒng)n檢測(cè)系統(tǒng)n附屬系統(tǒng)2.2.主要部件主要部件(1) 高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa； 為獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一； 具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)

3、、耐腐蝕等特性。柱塞式往復(fù)泵 (2) 梯度淋洗裝置外梯度外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。(3) 進(jìn)樣裝置 流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：(4) 高效分離柱 柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。勻漿法裝柱示意圖高效液相色譜填料n填料的熱力學(xué)特性熱力學(xué)特性影響色譜

4、柱的選擇性色譜柱的選擇性n填料的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)影響色譜柱的效率色譜柱的效率（顆粒的大小、形狀、均勻性、比表面積；孔徑、孔體積等）?；|(zhì)基質(zhì)n無機(jī)基質(zhì)材料硅膠(silica)、氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、羥基磷灰石、多孔玻璃、多孔石墨碳等n有機(jī)基質(zhì)材料：天然多糖凝膠（如葡聚糖系、瓊脂糖系等）高聚物樹脂（如交聯(lián)苯乙烯樹脂、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂等）特點(diǎn)特點(diǎn)顆粒狀顆粒狀整體柱整體柱n微孔微孔-孔徑孔徑 2 nm；中孔；中孔-孔徑孔徑2 nm；大孔大孔-孔徑孔徑50 nmn使用中孔和大孔填料；微孔易造成色譜峰拖尾使用中孔和大孔填料；微孔易造成色譜峰拖尾物理形態(tài)物理形態(tài)(5) 液相色譜檢測(cè)器

5、n溶質(zhì)性質(zhì)檢測(cè)器：對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等n總體檢測(cè)器：對(duì)試樣和流動(dòng)相總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)示差折光檢測(cè)器、電導(dǎo)檢測(cè)器等分類分類n紫外光度檢測(cè)器(ultraviolet photometric detector)n光電二極管陣列檢測(cè)器(photo-diode array detector)n熒光檢測(cè)器(fluorescence detector)n示差折光檢測(cè)器(differential refractive index detector)n蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector)n電導(dǎo)檢測(cè)器(elec

6、trical conductivity detector)常用檢測(cè)器常用檢測(cè)器 a. 紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 靈敏度高、線性范圍寬； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 它與固定波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器的主要差別在于使用一個(gè)連續(xù)光源（如氘燈），以光柵（或棱鏡）分光。光源發(fā)出的復(fù)合光（從190nm至600nm附近），光柵分光能夠隨意選擇定的檢測(cè)波長(zhǎng)以匹配被測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)。b. 光電二極管陣列檢測(cè)器 紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；紫外檢測(cè)器的重

7、要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。二極管陣列檢測(cè)器可以記錄190nm-900nm波長(zhǎng)吸收光譜光譜數(shù)據(jù)，可直接貯存色譜圖中每一個(gè)點(diǎn)的吸收光譜。光源發(fā)出的光，通過透鏡把光聚焦在檢測(cè)池上。從檢測(cè)池出來的光，通過透鏡、狹縫到全息光柵上，經(jīng)光柵分光后由一排光電二極管接收并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，貯存于計(jì)算機(jī)中。DAD的最大優(yōu)點(diǎn)在于利用光譜識(shí)別并進(jìn)行純度分析分析，還可以畫出保留時(shí)間、波長(zhǎng)和吸光度的三維立體空間譜圖等，這是目前較先進(jìn)的紫外檢測(cè)器。 光電二極管陣列檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器c. 示差折光檢測(cè)器 除紫外檢測(cè)器

8、之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器； 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；d. 熒光檢測(cè)器 高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；20.3 高效液相色譜的主要類型高效液相色譜的主要類型一、液一、液- -固吸附色譜固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph二、液二、液- -液分配色譜液分配色譜liquid- liquid partition chro

9、matograph三、離子交換色譜三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph四、離子對(duì)色譜四、離子對(duì)色譜ion-pair chromatograph五、排阻色譜五、排阻色譜size- exclusion chromatograph六、親和色譜六、親和色譜(AC)(AC)Affinity chromatograph高效液相色譜的主要類型一、一、 液液-固吸附色譜固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相流動(dòng)相：各種不同極性的一元

10、或多元溶劑不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等分子質(zhì)量中等的油溶性試樣油溶性試樣，對(duì)具有具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；硅膠的表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)極性相互作用應(yīng)用實(shí)例硝基苯酚異構(gòu)體硝基苯酚異構(gòu)體的偶極矩：的偶極矩：對(duì)位對(duì)位間位間位鄰位鄰位硅膠固定相分離苯，甲苯，硅膠固定相分離苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯乙苯，丙苯，丁苯流動(dòng)相：流動(dòng)相：干燥正庚烷干燥正庚烷1份水飽和的正庚烷份水飽和的正庚烷2份干燥正庚烷份干燥正庚烷水飽和的正庚烷水飽和的正庚烷改變流動(dòng)相的改變流動(dòng)相的組成可改變分離組成可改變分離的選擇

11、性的選擇性二、二、 液液-液分配色譜液分配色譜liquid- liquid partition chromatography 固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相固定相和流動(dòng)相流動(dòng)相上的分配； 流動(dòng)相流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱

12、）。反相鍵合相色譜法：流動(dòng)相極性大于固定相的色譜法ODS示意圖示意圖疏溶劑作用理論疏溶劑作用理論n組分流出順序?yàn)椋航M分流出順序?yàn)椋菏杷孕≌呦攘鞒鍪杷孕≌呦攘鞒鍪杷源笳吆罅鞒鍪杷源笳吆罅鞒稣嗌V正相色譜低極性流動(dòng)相低極性流動(dòng)相反相色譜反相色譜高極性流動(dòng)相高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：待測(cè)物極性：ABC正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系應(yīng)用實(shí)例（芳香烴）應(yīng)用實(shí)例（芳香烴）三、三、 離子交換色譜離子交換色譜ion-exchange chromatography 固定相固定相：

13、陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動(dòng)相流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應(yīng)用應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。 用離子交換劑作固定相，以具有一定用離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的值的緩沖溶液緩沖溶液作作流

14、動(dòng)相流動(dòng)相，樣品中各離子組分依據(jù)它們與離子交換劑上荷電，樣品中各離子組分依據(jù)它們與離子交換劑上荷電交換基團(tuán)的交換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。交換基團(tuán)的交換能力大小來進(jìn)行分離的色譜方法。離子交換分離原理離子交換分離原理溶液pH值調(diào)控固定相電荷，溶液離子強(qiáng)度調(diào)控靜電作用應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例：稀土離子分離稀土離子分離四、四、 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜 ion pair chromatography定義：把離子對(duì)試劑加入到極性流動(dòng)相中，被測(cè)組分與其中離子對(duì)試劑的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離。適用：可離子化或離子型化合物，如有機(jī)酸、堿、鹽有機(jī)酸、堿、鹽的分離。機(jī)理：試樣在流動(dòng)相中與離子對(duì)試

15、劑離解出的反離子生成不荷電的疏水離子對(duì)，然后溶解或吸附在疏水固定相上，使得中性離子對(duì)在固定相和流動(dòng)相中達(dá)成分配平衡。反相離子對(duì)色譜：固定相一般為烷基烷基鍵合硅膠固定相鍵合硅膠固定相，如ODSn1.1.去甲腎上腺素去甲腎上腺素n2.2.腎上腺素腎上腺素n3.3.多巴胺多巴胺nIS: 3,4-IS: 3,4-二羥基苯甲胺二羥基苯甲胺n固定相：C8n流動(dòng)相：含辛基硫酸鈉的緩沖溶液+甲醇尿中兒茶酚胺類兒茶酚胺類化合物的分析五、五、 排阻色譜排阻色譜size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空

16、隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 分離原理分離原理應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例（苯乙烯寡聚體苯乙烯寡聚體）六、六、 親和色譜親和色譜(AC) Affinity chromatograph 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。吸附色譜吸附色譜分配色譜分配色譜離子色譜離子色譜體積排阻色譜體積排阻色譜親和色譜親和色譜固定相固定相全多孔固全多孔固體吸附劑體吸附劑固定液載固定液載帶在固相帶在固相基體上基體上高效微粒高效微粒離子交換離子交換劑劑具有不同孔徑具有不同孔徑的多孔性凝膠的多孔性凝膠多