第2章-色譜基本理論a-塔板理論

1、2-1 2-1 概述概述 色譜法早在色譜法早在19031903年由俄國(guó)植物學(xué)家年由俄國(guó)植物學(xué)家M.TswettM.Tswett（茨維特）提（茨維特）提出，成為十分重要的分離分析手段。出，成為十分重要的分離分析手段。實(shí)驗(yàn)：葉綠素分離：石油醚浸提葉片實(shí)驗(yàn)：葉綠素分離：石油醚浸提葉片碳酸鈣填充拄碳酸鈣填充拄純凈石油醚淋洗純凈石油醚淋洗葉綠素分離（葉綠素分離（a a，b b，葉黃素，胡，葉黃素，胡蘿卜素）蘿卜素）色譜法共同的基本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：色譜法共同的基本特點(diǎn)是具備兩個(gè)相：不動(dòng)的一相，稱為不動(dòng)的一相，稱為固定相；另一相是攜帶樣品流過固定相的流動(dòng)體，稱為流固定相；另一相是攜帶樣品流過固定相的流動(dòng)體

2、，稱為流動(dòng)相動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定。當(dāng)流動(dòng)相中樣品混合物經(jīng)過固定相時(shí)，就會(huì)與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相發(fā)生作用，由于各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的相相互作用的類型、強(qiáng)弱也有差異，因此在同一推動(dòng)力的作用下，不同組分在固定相作用下，不同組分在固定相滯留滯留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而按先后不同的次序從固定相中流出（后不同的次序從固定相中流出（洗脫洗脫）。）。n 氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（氣體為流動(dòng)相的色譜稱為氣相色譜（GCGC），根據(jù)固定相是固），根據(jù)固定相是固體吸附劑

3、還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物體吸附劑還是固定液（附著在惰性載體上的一薄層有機(jī)化合物液體），又可分為氣固色譜（液體），又可分為氣固色譜（GSCGSC）和氣液色譜（）和氣液色譜（GLCGLC）n液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（液體為流動(dòng)相的色譜稱液相色譜（LCLC）。同理，液相色譜亦可）。同理，液相色譜亦可分為液固色譜（分為液固色譜（LSCLSC）和液液色譜）和液液色譜LLCLLC）n超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜（超臨界流體為流動(dòng)相的色譜稱為超臨界流體色譜（SFCSFC）。）。n通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，這種化學(xué)鍵合固定相通過化學(xué)反應(yīng)將固定液鍵合到載體表面，

4、這種化學(xué)鍵合固定相的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（的色譜又稱化學(xué)鍵合相色譜（CBPCCBPC）。）。 利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分利用組分在吸附劑（固定相）上的吸附能力強(qiáng)弱不同而得以分離的方法，稱為離的方法，稱為吸附色譜法吸附色譜法。利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同而達(dá)到分離的方法稱為稱為分配色譜法分配色譜法。利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到利用組分在離子交換劑（固定相）上的親和力大小不同而達(dá)到分離的方法，稱為分離的方法，稱為離子交換色譜法離子交換色譜法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇

5、滲透而達(dá)到分離的利用大小不同的分子在多孔固定相中的選擇滲透而達(dá)到分離的方法，稱為方法，稱為凝膠色譜法凝膠色譜法或或排阻色譜法排阻色譜法。利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行利用不同組分與固定相（固定化分子）的高專屬性親和力進(jìn)行分離的技術(shù)稱為分離的技術(shù)稱為親和色譜法親和色譜法，常用于蛋白質(zhì)的分離。，常用于蛋白質(zhì)的分離。 。2-12-1基線基線(Baseline) 、基線噪聲基線噪聲(Baseline noise)基線漂移基線漂移(Baseline drift)死時(shí)間死時(shí)間(Dead time)、死體積、死體積(Dead volume)保留值保留值(Retention value

6、): Retention time & Retention volume調(diào)整保留值調(diào)整保留值(Adjusted retention value)：Adjusted retention time & Adjusted retention volume相對(duì)保留值相對(duì)保留值(Relative retention value)區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾?Peak width) 標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation) 半峰寬度半峰寬度(Peak width at half-height) 峰底寬度峰底寬度(Peak width at peak base) 峰高峰高（Peak he

7、ight）l 柱中僅有流動(dòng)相通過時(shí)，檢測(cè)器響應(yīng)訊號(hào)的記錄值，即圖2-1中Ot線理想的基線應(yīng)該是一條水平直線?；€噪聲，基線漂移2-1 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離，以h表示，如圖2-1中BA 1 1死時(shí)間死時(shí)間t tM M 不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，如圖2-1中 OA。 因?yàn)檫@種物質(zhì)不被固定相吸附或溶解，故其流動(dòng)速度將與流動(dòng)相的流動(dòng)速度相近測(cè)定流動(dòng)相平均線速時(shí)，可用柱長(zhǎng)L與tM的比值計(jì)算。mtLu 2 2保留時(shí)間保留時(shí)間t tR R 試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷

8、的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖圖2-1 OB2-1 OB它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端它相應(yīng)于樣品到達(dá)柱末端的檢測(cè)器所需的時(shí)間的檢測(cè)器所需的時(shí)間 圖圖2-1 色譜流出曲線色譜流出曲線 由于組份在色譜柱中的保留時(shí)間由于組份在色譜柱中的保留時(shí)間t tR R包含了組份包含了組份隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，所以滯留所需的時(shí)間，所以t tR R實(shí)際上是組份在固定相實(shí)際上是組份在固定相中停留的總時(shí)間保留時(shí)間可用時(shí)間單位（如中停留的總時(shí)間保留時(shí)間可用時(shí)間單位（如s s）或距離單位（如或距離單位（如cmcm）表示。）表示。 保留時(shí)間是色譜法定性的基本

9、依據(jù)保留時(shí)間是色譜法定性的基本依據(jù)，但同一，但同一組份的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此組份的保留時(shí)間常受到流動(dòng)相流速的影響，因此色譜工作者有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性檢色譜工作者有時(shí)用保留體積等參數(shù)進(jìn)行定性檢定定 V VM M 指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆指色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和當(dāng)頭間的空間以及檢測(cè)器的空間的總和當(dāng)后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由后兩項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速F F0 0（L Lminmin）計(jì)）計(jì)算：算

10、： V VM M = t = tM MFF0 0 6 6調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積V VR R 某組份的保留體積扣除死體積后，稱某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積，即該組份的調(diào)整保留體積，即 VR = VR- VM7相對(duì)保留值2.1 某組份某組份2 2的調(diào)整保留值與組份的調(diào)整保留值與組份1 1的調(diào)整保的調(diào)整保留值之比，稱為相對(duì)保留值：留值之比，稱為相對(duì)保留值：12121.2RRRRVVtt 由于相對(duì)保留值只與柱溫及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是氣相色譜法中，廣泛使用的定性數(shù)據(jù) 必須注意，相對(duì)保留值絕對(duì)不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或

11、保留體積之比 . 式中式中t tR2R2為為后出峰后出峰的調(diào)整保留時(shí)間，所以的調(diào)整保留時(shí)間，所以這時(shí)這時(shí)總是大于總是大于1 1的的 。12RRtt1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差 即0607倍峰高處色譜峰寬的一半，如圖2-1中EF距離的一半。2. 半峰寬Y1/2 即峰高一半處對(duì)應(yīng)的峰寬，如圖2-1中GH間的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： Y1/2 = 2.3542-13. 3. 基線寬度基線寬度W W 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，如圖2-1中IJ的距離它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： Y = 4 2/17.1YY 23 23 色譜法分析的基本原理色譜法分析的基本原理 目的：將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完目的

12、：將樣品中各組分彼此分離，組分要達(dá)到完全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn)全分離，兩峰間的距離必須足夠遠(yuǎn). . 兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定兩峰間的距離是由組分在兩相間的分配系數(shù)決定的，即與色譜過程的的，即與色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。有關(guān)。但是兩峰但是兩峰間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此間雖有一定距離，如果每個(gè)峰都很寬，以致彼此重疊，還是不能分開。重疊，還是不能分開。這些峰的寬或窄是由組分這些峰的寬或窄是由組分在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過在色譜柱中傳質(zhì)和擴(kuò)散行為決定的，即與色譜過程的程的動(dòng)力學(xué)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有關(guān)。性質(zhì)有關(guān)。因此，要從熱力學(xué)和動(dòng)力因此，要從熱

13、力學(xué)和動(dòng)力學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。學(xué)兩方面來(lái)研究色譜行為。 1分配系數(shù)分配系數(shù)K K 色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配或吸附反復(fù)多次地分配或吸附-脫附過程。脫附過程。分配系數(shù)是描述分離過程中樣品分子在兩相間分配分配系數(shù)是描述分離過程中樣品分子在兩相間分配的參數(shù)，的參數(shù)，它是指在一定溫度和壓力下，組分在固它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值msCCK溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度溶質(zhì)在固定相中的濃度 分配比又稱容量因子，它是指在一定溫分配比又稱容量因子，它是指

14、在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即即 msMM量組分在流動(dòng)相中物質(zhì)的量組分在固定相中物質(zhì)的 式中式中C CS S，CmCm分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度；分別為組分在固定相和流動(dòng)相的濃度； VmVm為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。為柱中流動(dòng)相的體積，近似等于死體積。VsVs為柱中為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，含義。例如：在分配色譜中，VsVs表示固定液的體積；表示固定液的體積；在尺

15、寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。在尺寸排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。mmssmsVCVCmmk 滯留因子滯留因子( (保留比保留比)Rs)Rs設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度為設(shè)流動(dòng)相在柱內(nèi)的線速度為u u，組分在，組分在柱內(nèi)線速度為柱內(nèi)線速度為u us s，由于固定相對(duì)組，由于固定相對(duì)組分有保留作用，所以分有保留作用，所以u(píng) us su u此兩速此兩速度之比稱為滯留因子度之比稱為滯留因子RsRs。 uuRss 對(duì)組分和流動(dòng)相通過長(zhǎng)度為對(duì)組分和流動(dòng)相通過長(zhǎng)度為L(zhǎng) L的的色譜柱，其所需時(shí)間分別為色譜柱，其所需時(shí)間分別為sruLtuLtmrmssttuuRkmmmmmRmssmms1111)1 (k

16、ttmrmrmrmmrVVtttttk通過色譜流出曲線通過色譜流出曲線, ,就可以求得分配比就可以求得分配比k.k. 其中其中稱為稱為相比率相比率，它是反映各種色譜柱，它是反映各種色譜柱型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對(duì)填充柱，其型特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對(duì)填充柱，其值一般為值一般為6 63535；對(duì)毛細(xì)管柱，其；對(duì)毛細(xì)管柱，其值為值為6060600600。 kVVkVmVmCCKsmmmssms/l分配系數(shù)是組分在兩相中的濃度比分配系數(shù)是組分在兩相中的濃度比, ,分配比是分配比是組分在兩相中分配總量之比組分在兩相中分配總量之比. .熱力學(xué)性質(zhì)熱力學(xué)性質(zhì)( (拄拄溫溫, ,柱壓柱壓) )l分配系數(shù)只

17、取決與組分和兩相性質(zhì)分配系數(shù)只取決與組分和兩相性質(zhì), ,與兩相體與兩相體積無(wú)關(guān)積無(wú)關(guān), ,而分配比不僅取決與組分和兩相性質(zhì)而分配比不僅取決與組分和兩相性質(zhì), ,還與相比有關(guān)還與相比有關(guān). .l一定的色譜體系中一定的色譜體系中, ,組分分離決定于組分在每組分分離決定于組分在每相中的相對(duì)量相中的相對(duì)量, ,而不是相對(duì)濃度而不是相對(duì)濃度, ,因此因此, ,分配比分配比是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的重要參數(shù)是衡量色譜柱對(duì)組分保留能力的重要參數(shù).k.k越大越大, ,保留時(shí)間越長(zhǎng)保留時(shí)間越長(zhǎng),k ,k 為為0,0,保留時(shí)間為死時(shí)保留時(shí)間為死時(shí)間間. .對(duì)A、B兩組分的選擇因子，用下式表示 )()()()()

18、()(AKBKAkBkAtBtrr 上述公式表明：上述公式表明：通過選擇因子通過選擇因子把實(shí)驗(yàn)把實(shí)驗(yàn)測(cè)量值測(cè)量值k k與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)與熱力學(xué)性質(zhì)的分配系數(shù)K K直接直接聯(lián)系起來(lái)，聯(lián)系起來(lái)，對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際對(duì)固定相的選擇具有實(shí)際意義。如果兩組分的意義。如果兩組分的K K或或k k值相等，則值相等，則=1=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。明分不開。兩組分的兩組分的K K或或k k值相差越大，值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。分配系數(shù)是色譜分離的先決條件。二、塔板理論 最

19、早由最早由MartinMartin等人提出塔板理論，把色等人提出塔板理論，把色譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板譜柱比作一個(gè)精餾塔，沿用精餾塔中塔板的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，的概念來(lái)描述組分在兩相間的分配行為，同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指同時(shí)引入理論塔板數(shù)作為衡量柱效率的指標(biāo)。標(biāo)。 該理論假定： （i i）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度）在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H H內(nèi)，組分可以在內(nèi)，組分可以在兩相兩相間迅速達(dá)到平衡間迅速達(dá)到平衡。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板。這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板高度高度H H。 （ii ii）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是）以氣相色譜為例，載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而

20、是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積（板體積（VVm m）。）。 （iii iii）所有組分開始時(shí)存在于）所有組分開始時(shí)存在于第第0 0號(hào)號(hào)塔板上，而塔板上，而且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。且試樣沿軸（縱）向擴(kuò)散可忽略。 （iv iv）分配系數(shù)在所有塔板上是）分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)常數(shù)，與組分，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。. .為簡(jiǎn)單起見，設(shè)色譜往由5塊塔板（n5，n為柱子的塔板數(shù)）組成，并以r表示塔板編號(hào)，r=1，2，nl；某組分的分配比k=1根據(jù)上述假定，在色譜分離過程中，該組分的分布可計(jì)算如下： 開始時(shí)，若有單位質(zhì)量，即m=1

21、（例1mg或1g）的該組分加到第0號(hào)塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。當(dāng)一個(gè)板體積（lV）的載氣以脈動(dòng)形式進(jìn)入0號(hào)板時(shí)，就將氣相中含有nm部分組分的載氣頂?shù)?號(hào)板上，此時(shí)0號(hào)板液相（或固相）中ns部分組分及1號(hào)板氣相中的nm部分組分，將各自在兩相間重新分配。故0號(hào)板上所含組分總量為05，其中氣液（或氣固）兩相各為025而1號(hào)板上所含總量同樣為05氣液（或氣固）相亦各為025。以后每當(dāng)一個(gè)新的板體積載氣以脈動(dòng)式進(jìn)入色譜柱時(shí)，上述過程就重復(fù)一次(見下表)。表表2-2 2-2 組分在任一板上的分配情況組分在任一板上的分配情況m m為組分質(zhì)量，為組分質(zhì)量，VrVr為保留

22、體積，為保留體積，n n為理論塔板數(shù)。為理論塔板數(shù)。 當(dāng)當(dāng)V=Vr V=Vr 時(shí)，時(shí)，C C值最大，即值最大，即)1 (2exp22rrVVnVmnCrVmnC2max222/1)(16)(54.5YtYtnrrnLH 從上兩式可以看出，從上兩式可以看出，色譜峰色譜峰Y Y越小，越小，n n就越大就越大，而，而H H就越小，就越小，柱效能越高柱效能越高。因此，。因此，n n和和H H是描述柱效能的指標(biāo)是描述柱效能的指標(biāo)。 通常填充色譜柱的通常填充色譜柱的n n10103 3，H H1mm1mm。而毛細(xì)管柱。而毛細(xì)管柱 n=10n=105 5-10106 6，H H0.5mm0.5mm 由于死時(shí)

23、由于死時(shí)t tm m包括在包括在trtr中中, ,而實(shí)際的而實(shí)際的t tm m不參與柱內(nèi)分配不參與柱內(nèi)分配, ,所計(jì)算所計(jì)算的的n n值盡大值盡大,H,H很小很小, ,但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn)但與實(shí)際柱效能相差甚遠(yuǎn). .所以所以, ,提出把提出把t tm m扣扣除除, ,采用采用有效理論塔板數(shù)有效理論塔板數(shù)n neffeff和和有效塔板高有效塔板高H Heffeff評(píng)價(jià)柱效能。評(píng)價(jià)柱效能。 注意:同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不一樣的同一色譜柱對(duì)不同物質(zhì)的柱效能是不一樣的, ,當(dāng)用這些指標(biāo)當(dāng)用這些指標(biāo)表示柱效能時(shí)表示柱效能時(shí), ,必須說明是對(duì)什么物質(zhì)而言必須說明是對(duì)什么物質(zhì)而言. . 塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中塔板理論用熱力學(xué)觀點(diǎn)形象地描述了溶質(zhì)在色譜柱中的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，的分配平衡和分離過程，導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，并成功地解釋了流出曲線的形狀及濃度極大值的位置，還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。但由于它的某些基還提出了計(jì)算和評(píng)價(jià)柱效的參數(shù)。但由于它的某些基本假設(shè)并不完全符合柱內(nèi)實(shí)際發(fā)生的分離過程，例如，本假設(shè)并不完全符