高效液相色譜儀原理及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、高效液相色譜儀原理及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書 貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開發(fā)中心（綠色農(nóng)藥與生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）1. 實(shí)驗(yàn)類型：設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)（研究性實(shí)驗(yàn)）2. 課時(shí)安排：6課時(shí)3. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x：通過學(xué)習(xí)高效液相色譜儀的構(gòu)成和使用方法，及其在定性、定量分析中的應(yīng)用，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度、細(xì)致的工作作風(fēng)、實(shí)事求是的數(shù)據(jù)報(bào)告和良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣（準(zhǔn)備充分、操作規(guī)范，記錄簡明，臺(tái)面整潔、實(shí)驗(yàn)有序，良好的環(huán)保和公德意識(shí)）。培養(yǎng)培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力、理論聯(lián)系實(shí)際的能力、統(tǒng)籌思維能力、創(chuàng)新能力、獨(dú)立分析解決實(shí)際問題的能力、查閱手冊資料并運(yùn)用其數(shù)據(jù)資料的能力以及歸納總結(jié)的能力等。4. 實(shí)驗(yàn)原理高效液相色譜分離是利用試樣中各組分

2、在色譜柱中的淋洗液和固定相間的分配系數(shù)不同，當(dāng)試樣隨著流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱中后，組分就在其中的兩相間進(jìn)行反復(fù)多次（103-106）的分配（吸附脫附放出）由于固定相對(duì)各種組分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各組份在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，順序離開色譜柱進(jìn)入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號(hào)經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。5. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備高效液相色譜儀、色譜柱、容量瓶、分析實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器、甲醇等色譜純試劑，超純水，濾膜。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。6. 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：了解并初步掌握高效液相色譜儀的基本原理與構(gòu)造；了解高效液相色譜儀常用的幾種檢測器工作原理和使用范圍；學(xué)習(xí)高效液相色譜

3、法分離化合物和檢測化合物的含量的方法；通過測定對(duì)樣品的定性、定量測定，初步掌握獲得高效液相色譜譜圖和數(shù)據(jù)的一般操作程序與技術(shù)；學(xué)習(xí)樣品制備的方法；了解影響分析測定的重要因素，學(xué)會(huì)優(yōu)化分析條件；學(xué)習(xí)譜圖和數(shù)據(jù)的處理方法。1) 樣品制備 樣品制備過程中，要同時(shí)考慮將被分析的樣品中，可能干擾欲測組分定量的物質(zhì)盡可能的分離出去。當(dāng)欲測組分含量很低時(shí)，還要考慮通過樣品制備使欲測組分在試驗(yàn)樣品中的含量得以提高，便于進(jìn)行色譜分析。2) 定性、定量方法 保留時(shí)間定性；峰高、峰面積定量（歸一法、外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、標(biāo)準(zhǔn)加入法）。3) 方法可行性的驗(yàn)證聯(lián)用技術(shù)進(jìn)一步定性；準(zhǔn)確度（添加回收率實(shí)驗(yàn)）、精密度實(shí)驗(yàn)。4) 數(shù)

4、據(jù)處理實(shí)驗(yàn)中所有測量數(shù)據(jù)都要隨時(shí)記在專用的記錄本上，不可記在其他任何地方，記錄的數(shù)據(jù)不得隨意進(jìn)行涂改；其平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般不應(yīng)大于5%；實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差應(yīng)不超過±2%。 5) 儀器操作a. 開機(jī)，啟動(dòng)裝置，進(jìn)入Win2000；開啟LC，點(diǎn)擊Instrumentl online圖標(biāo)，進(jìn)入儀器控制面板，設(shè)置所需各項(xiàng)參數(shù)。 b. 設(shè)置分析用流動(dòng)相清洗流路,等待色譜柱、系統(tǒng)的平衡，基線穩(wěn)定，開始進(jìn)樣分析。c. 分析結(jié)束，數(shù)據(jù)處理，打印報(bào)告。d. 關(guān)閉柱溫箱和檢測器，沖洗色譜柱，關(guān)閉脫氣機(jī)、泵，關(guān)閉整個(gè)裝置。e. 關(guān)閉總電源。f. 在記錄本上記錄使用情況。7. 注意事項(xiàng)

5、1) 實(shí)驗(yàn)之前必須交預(yù)習(xí)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)完后每人寫一份實(shí)驗(yàn)報(bào)告。2) 嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度。3) 做好實(shí)驗(yàn)記錄工作。8. 思考題1) 通過對(duì)方法準(zhǔn)確度和精密度的考察，說明方法的可行性。2) 高效液相色譜儀的日常維護(hù)及其必要性。附：參考實(shí)驗(yàn)實(shí)例農(nóng)藥制劑的高效液相色譜分析   一、目的要求1、了解高效液相色譜儀和二極管陣列檢測器(DAD)的使用范圍、原理和使用方法。2、掌握高效液相色譜含量測定方法和方法學(xué)的考察。3、本方法的適用性，適用于生產(chǎn)過程和實(shí)驗(yàn)過程中中間體和產(chǎn)物含量跟二、基本原理  大部分的農(nóng)藥能在紫外可見光區(qū)有吸收，因此選擇高效液相色譜（配DAD檢測器）對(duì)上述兩

6、種化合物進(jìn)行分離，定性定量測定。    三、儀器與試劑 儀器：高效液相色譜儀（配DAD檢測器）；C18反相柱；容量瓶。  試劑：甲醇（色譜純），超純水，濾膜。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品。四、試驗(yàn)步驟1. 色譜條件：色譜柱，Eclipse XDB反相柱（4.6×150 mm i.d.）；流動(dòng)相，甲醇：水（70: 30, v/v），檢測波長，212 nm；流速，1 mL/min；柱溫，25C。2. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，置于25ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。3. 樣品的配制準(zhǔn)確稱取一定量的農(nóng)藥制劑樣品 (精確至0.000l g 置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋、定容，配制成樣品。五、方法學(xué)考察1. 線性相關(guān)性測定配制 6個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣分析，以濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)作圖，檢測方法的線性范圍和相關(guān)性。2. 方法的精密度在要求的色譜條件下，對(duì)同一樣