遺傳實驗14、15小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備

1、一、實驗原理一、實驗原理 骨髓細(xì)胞骨髓細(xì)胞 骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期細(xì)胞而不必象血淋巴細(xì)胞或組織那樣接得到中期細(xì)胞而不必象血淋巴細(xì)胞或組織那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。要經(jīng)過體外培養(yǎng)。 經(jīng)秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于經(jīng)秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞由于紡綞體的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩紡綞體的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩極而使之停留于中期，同時染色體縮短，輪廓清極而使之停留于中期，同時染色體縮短，輪廓清晰，把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定處理，使細(xì)胞晰，把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定處理，使細(xì)胞處于膨脹狀態(tài)，再將

2、細(xì)胞懸液滴在處于膨脹狀態(tài)，再將細(xì)胞懸液滴在預(yù)冷的預(yù)冷的載片上，載片上，使細(xì)胞破裂，染色體散開，染色后即可觀察到使細(xì)胞破裂，染色體散開，染色后即可觀察到染染色體色體。二、實驗?zāi)康亩嶒災(zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法。體的制備方法。 觀察小鼠染色體的形態(tài)特征觀察小鼠染色體的形態(tài)特征, ,統(tǒng)統(tǒng)計細(xì)胞的染色體數(shù)目。計細(xì)胞的染色體數(shù)目。 小白鼠（小白鼠（2n=402n=40）三、實驗材料三、實驗材料 四、實驗器具和藥品四、實驗器具和藥品 1. 1.器具：注射器（器具：注射器（1ml1ml，5ml5ml各一支）、各一支）、托盤、解剖剪、鑷子、吸管、離心管、托盤、解

3、剖剪、鑷子、吸管、離心管、離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。 2.2.藥品：藥品： 0.15mg/ml 0.15mg/ml 秋水仙素，秋水仙素， 1%1%檸檬酸三鈉，固定液（檸檬酸三鈉，固定液（3 3份甲醇，份甲醇，1 1份份冰乙酸，臨用時現(xiàn)配），冰乙酸，臨用時現(xiàn)配），GiemsaGiemsa染液，染液，2.2%2.2%檸檬酸鈉，檸檬酸鈉，0.01M0.01M磷酸緩沖液磷酸緩沖液（PBSPBS）pH6.8pH6.8。 購買小鼠（體重購買小鼠（體重3030克最佳；盡量雌雄各半）克最佳；盡量雌雄各半） 溶液配制：溶液配制：v (1) 2.2%2.2%檸檬酸三鈉檸檬

4、酸三鈉：稱：稱11g11g檸檬酸三鈉到檸檬酸三鈉到500ml500ml蒸餾水中，充分溶解；蒸餾水中，充分溶解；v (2) 1%1%檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉： 取取5g5g檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉溶解到溶解到500ml500ml蒸蒸餾餾水中，充分溶解；水中，充分溶解；v (3) PBSPBS（pH6.8)pH6.8): A: A液：取液：取NaNa2 2HPOHPO4 4 12g 12g溶于溶于500ml500ml蒸水中，充分溶解；蒸水中，充分溶解； B B液：取液：取KHKH2 2POPO4 4 4.55g 4.55g溶于溶于500ml500ml蒸水中，充分溶解；蒸水中，充分溶解； 使用時使用時,A,

5、A、B B液等體積混合，即為液等體積混合，即為pH6.8pH6.8的的PBSPBS；v (4) 0.150.15mg/ml mg/ml 秋水仙素秋水仙素：取秋水仙素：取秋水仙素15mg15mg溶于溶于100ml 0.85%100ml 0.85%生理鹽水生理鹽水v 中，混勻；中，混勻；v (5) 75%75%酒精酒精： 取取375ml 95%375ml 95%乙醇，加入乙醇，加入125ml125ml餾餾蒸水；蒸水；五、實驗準(zhǔn)備五、實驗準(zhǔn)備六、實驗步驟六、實驗步驟 1 1、處理處理： 用用1.5mg/kg1.5mg/kg體重劑量，腹腔注射秋水仙素處體重劑量，腹腔注射秋水仙素處理小鼠。本次實驗的注射

6、量為理小鼠。本次實驗的注射量為0.1ml/10g0.1ml/10g體重，體重，即用上述配制的秋水仙素溶液按每即用上述配制的秋水仙素溶液按每10g10g體重體重注射注射0.1ml0.1ml（每只小鼠按（每只小鼠按30g30g體重計算，注射體重計算，注射0.3ml0.3ml，含，含秋水仙素秋水仙素0.045mg）。注射）。注射2424小小時后，可以取骨髓。時后，可以取骨髓。2. 2. 處死及收集骨髓細(xì)胞處死及收集骨髓細(xì)胞： （1 1）斷頸法處死小鼠。剪刀剪開腿部的皮膚，）斷頸法處死小鼠。剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的

7、兩股骨取出將小鼠的兩股骨取出(注意股骨的完整性注意股骨的完整性) ，擦凈，擦凈股骨上的肌肉。股骨上的肌肉。 （2 2）去）去股骨股骨的髖面，將吸有的髖面，將吸有2.2%2.2%檸檬酸三鈉檸檬酸三鈉溶液溶液的小注射器的針頭插入，反復(fù)數(shù)次的小注射器的針頭插入，反復(fù)數(shù)次吹出骨髓吹出骨髓細(xì)胞細(xì)胞，反復(fù)吹打直至，反復(fù)吹打直至股股骨呈白色骨呈白色(注意吹干凈，充注意吹干凈，充分收集骨髓細(xì)胞分收集骨髓細(xì)胞) ，制成細(xì)胞懸液。，制成細(xì)胞懸液。3. 3. 低滲低滲： 將細(xì)胞懸液在將細(xì)胞懸液在1000rpm/min1000rpm/min離心離心5min5min，棄除上清液，留，棄除上清液，留0.5ml0.5ml搖

8、勻。向細(xì)胞液中再加入搖勻。向細(xì)胞液中再加入1%1%的檸檬酸三鈉溶液的檸檬酸三鈉溶液 5ml 5ml ，用吸管輕輕吹打均勻，在室溫下用吸管輕輕吹打均勻，在室溫下低滲低滲 30min30min。 低滲期間，配制固定液，即甲醇：冰醋酸為低滲期間，配制固定液，即甲醇：冰醋酸為3:13:1 （v/v)v/v)，置，置 44冰箱中備用。冰箱中備用。4. 4. 預(yù)固定預(yù)固定( (第第1 1次次) )： 低滲處理后的細(xì)胞懸液離心低滲處理后的細(xì)胞懸液離心5 5分鐘，分鐘， 留留1ml1ml原液，搖勻。加入原液，搖勻。加入新配制的固定液至新配制的固定液至6ml6ml， 吹打均勻，固定吹打均勻，固定5 5分鐘，再在

9、分鐘，再在1000rpm/min1000rpm/min 離心離心3-5min3-5min，去掉上清液。，去掉上清液。六、實驗步驟六、實驗步驟六、實驗步驟六、實驗步驟5. 5. 固定（第固定（第2次）：次）： 沿離心管壁慢慢沿離心管壁慢慢加入新配制的固定液加入新配制的固定液6ml， 用吸管輕輕吹打均勻，用吸管輕輕吹打均勻，室溫下固定室溫下固定5min， 1000rpm/min 3min，棄去上清；如此，棄去上清；如此 反復(fù)固定兩次（共反復(fù)固定兩次（共固定固定3次次）。）。6.6.細(xì)胞懸液：細(xì)胞懸液： 根據(jù)管底細(xì)胞量的多少，加入新配制根據(jù)管底細(xì)胞量的多少，加入新配制 的固定液的固定液0.30.30

10、.8ml0.8ml，用吸管打均勻，用吸管打均勻， 使其形成細(xì)胞懸液使其形成細(xì)胞懸液。六、實驗步驟六、實驗步驟7. 7. 滴片滴片： 將預(yù)冷的載玻片（將預(yù)冷的載玻片（00冰?。?，冰?。?，水平或傾斜水平或傾斜4545角放置，用吸管吸取細(xì)胞懸液，從約角放置，用吸管吸取細(xì)胞懸液，從約 0.50.51 1mm高處高處滴滴 1 12 2滴滴到片子上，用口將其到片子上，用口將其吹干吹干，靜置使其，靜置使其干燥干燥。8. 8. 染色染色： 將干燥的玻片放入將干燥的玻片放入2ml2ml吉姆薩原液加入吉姆薩原液加入40ml40ml磷磷酸緩沖液（酸緩沖液（pH6.8pH6.8）配成的染液中）配成的染液中染色染色20

11、min20min，用，用磷酸緩沖液（磷酸緩沖液（pH6.8pH6.8）沖洗沖洗，晾干后鏡檢。晾干后鏡檢。七、觀察七、觀察 低倍鏡下尋找中期分裂相，然后低倍鏡下尋找中期分裂相，然后用高倍鏡和油鏡觀察染色體形態(tài)，統(tǒng)用高倍鏡和油鏡觀察染色體形態(tài)，統(tǒng)計染色體數(shù)目。計染色體數(shù)目?？梢娦∈蟮目梢娦∈蟮?040條染色體呈紫紅色。條染色體呈紫紅色。小鼠骨髓細(xì)胞的小鼠骨髓細(xì)胞的40條染色體條染色體小鼠骨髓細(xì)胞染色體圖小鼠骨髓細(xì)胞染色體圖小鼠骨髓細(xì)胞染色體放大圖小鼠骨髓細(xì)胞染色體放大圖(10100)作業(yè)作業(yè)1. 1.找到一個分裂相良好的區(qū)域，統(tǒng)計小鼠找到一個分裂相良好的區(qū)域，統(tǒng)計小鼠2n2n染色體的數(shù)目，仔細(xì)觀察其形態(tài)特