激光共焦顯微鏡技術(shù)ppt課件

1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及運(yùn)用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 樣品要求樣品要求 原理原理 功能功能 在生物醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用在生物醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18mm 二、二、 原理原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)原理

2、小結(jié)原理小結(jié):Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測，來自在檢測器前的探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測，來自光源的光經(jīng)過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平光源的光經(jīng)過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔面的某個點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻撓。照上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻撓。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平軛的，因此被探測點(diǎn)即

3、共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完好的圖像，由示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完好的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完好的共焦圖像。只需載物臺沿著一幅完好的共焦圖像。只需載物臺沿著Z軸上下挪動，軸上下挪動，將樣品新的一個層面挪動到共焦平面上，樣品的新將樣品新的一個層面挪動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷挪動，就可軸的不斷挪動，就可得到樣品不同層面延續(xù)的光切圖像得到樣品不

4、同層面延續(xù)的光切圖像 。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 1.抑制圖像的模糊，獲得明晰的圖像抑制圖像的模糊，獲得明晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取延續(xù)具有更高的軸向分辨率，并可獲取延續(xù)光學(xué)切片光學(xué)切片conventionalconfocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技

5、術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 3. 添加側(cè)向分辨率添加側(cè)向分辨率d2alconventionconfocaldd激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別 4. 由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明點(diǎn)照明2.具有照明具有照明pinhole和探測和探測pinhole3.照明照明pinhole和探測和探測pinhole共軛共軛(共焦共焦), 共共焦點(diǎn)即被探測點(diǎn)，

6、被探測點(diǎn)所在的平面焦點(diǎn)即被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個四個具有多個四個 熒光通道，可同時探熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)志物測多個被標(biāo)志物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)目的技術(shù)目的Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61/NA 0.25 m ) Confocal: Rxy=0.4/NA0.18 m ) 2. 樣品的最大厚度樣品的最大厚度: 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、物鏡的任務(wù)間隔、物鏡的任

7、務(wù)間隔 激光的穿透力、樣品的透明激光的穿透力、樣品的透明度度 Z軸的最大挪動范圍軸的最大挪動范圍(166m、Z-wide) 3. 樣品的最小光切厚度樣品的最小光切厚度: (載物臺最小挪動間隔載物臺最小挪動間隔為為40nm 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、針孔大小、針孔大小 Z軸的最小挪動步距軸的最小挪動步距: 40nm Z軸的分辨率軸的分辨率: 0.35 m 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光

8、器的特點(diǎn)激光器的特點(diǎn): 1) 方向性好方向性好: 激光根本延直線傳播激光根本延直線傳播 2) 單色性好單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度其在空間上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, 光纖耦合光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個熒光通道四個熒光通道, 一個透射光通道一個透射光通道 即除了可同時采集多標(biāo)志熒光圖像外即除了可同時采集多標(biāo)志熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像還可以同時采集透射光圖像,但透射光但透射光圖像為非共焦圖像。圖像為非共焦圖像。

9、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)6.掃描速度掃描速度: slow 220lines/s 512512 2-3秒秒 slow2 440lines/s2：雙向掃描：雙向掃描 medium 450lines/s 512512 1.7秒秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512512 0.7秒秒 128128 0.2秒秒 fast2 2000lines/s7. 掃描密度掃描密度: 6464 128128 512512 10241024 20482048 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的運(yùn)用The application of Confocal Laser S

10、canning Microscopy激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 功能功能.1.多熒光標(biāo)志樣品的高明晰度、高分辨率多熒光標(biāo)志樣品的高明晰度、高分辨率圖像采集圖像采集2.無損傷、延續(xù)光學(xué)切片，顯微無損傷、延續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT3.真正的三維重組真正的三維重組4.假三維圖的顯示假三維圖的顯示5.可沿可沿Z軸軸xy平面和平面和Y軸軸xz平面方平面方向進(jìn)展光切向進(jìn)展光切6.定量分析定量分析7.時間序列掃描時間序列掃描: xyt 、xyzt 和和 xt 掃描掃描8.圖像處置圖像處置9. 旋轉(zhuǎn)掃描旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描光譜掃描 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光

11、掃描共焦顯微鏡運(yùn)用運(yùn)用運(yùn)用定位、定量定位、定量三維重組三維重組動態(tài)丈量動態(tài)丈量 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度分布和濃度的變化的變化 丈量丈量(Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自在基的檢測自在基的檢測 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 活細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞內(nèi)H+濃度濃度 pH值的丈量值的丈量 線粒體膜電位的丈量線粒體膜電位的丈量 熒光漂白恢復(fù)熒光漂白恢復(fù)FRAP的丈量的丈量 籠鎖解籠鎖的丈量籠鎖解籠鎖的丈量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移熒光能量共振轉(zhuǎn)移FRET的丈量的

12、丈量 其他運(yùn)用其他運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用一、定位、定量一、定位、定量免疫熒光標(biāo)志單標(biāo)、雙標(biāo)或三免疫熒光標(biāo)志單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)的定位、標(biāo)的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化增值、分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交末端原位雜交-fitc + PI熒光原位雜交：熒光原位雜交： 染色體基因定位

13、染色體基因定位 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 定位、定量研討中常用熒光探針定位、定量研討中常用熒光探針 1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)志等位雜交、受體標(biāo)志等 Green Red Fura-red FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅四甲基異硫氰基羅丹明丹明) Alexa Flu

14、or 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅德州紅) Cy3 558/568 BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用1)細(xì)胞外表抗原、胞內(nèi)某種蛋白細(xì)胞外表抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)志：免役熒光標(biāo)志： 與抗體耦聯(lián)與抗體耦聯(lián), 直標(biāo)直標(biāo): 一抗一抗+熒光探針熒光探針 間標(biāo)間標(biāo): 二抗二抗+熒光探針熒光探針 如如: 微管蛋白微管蛋白tublin ( 抗抗 tublin抗體抗體+熒光探針熒光探針) 肌動蛋白肌動蛋

15、白actin ( Palloidine+熒光探針熒光探針)2)細(xì)胞膜外表受體細(xì)胞膜外表受體配體配體+熒光探針熒光探針 如如: nAchR、mAchR、多巴胺受體、多巴胺受體(D1,D2) 標(biāo)志標(biāo)志 Gm1: 霍亂毒素受體霍亂毒素受體 霍亂毒素霍亂毒素+FITC 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用2.標(biāo)志細(xì)胞器熒光探針標(biāo)志細(xì)胞器熒光探針1)線粒體線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢可檢 測線粒體膜電位測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時間短時間短 JC1 線粒體膜電位低時為單體線

16、粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光發(fā)綠光 線粒體膜電位高時為多聚體線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光發(fā)紅光 可標(biāo)志活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最可標(biāo)志活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型氧化型)Mitotracker Orange 復(fù)原型復(fù)原型, 只能染活細(xì)胞只能染活細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用2)溶酶體 Lysosome 中性紅

17、 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)志溶酶體等酸性器官 為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)志內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較低濃度標(biāo)志線粒體4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 細(xì)胞器的單克隆抗體細(xì)胞器的單克隆抗體5)細(xì)胞核細(xì)胞核 PI propidium iod

18、ide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞死細(xì)胞碘化丙啶碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞死細(xì)胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞活細(xì)胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞活細(xì)胞DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞半通透細(xì)胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活細(xì)胞活細(xì)胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞死細(xì)胞SYTO1116 2024 488/ 520 活細(xì)胞活細(xì)胞SYTO

19、1116 2024 521/ 556 活細(xì)胞活細(xì)胞SYTO 17 621/634 活細(xì)胞活細(xì)胞3. GFP 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：的的發(fā)現(xiàn)：60年代，年代，Shimomura等首先從水母中等首先從水母中分別出一種水母發(fā)光蛋白分別出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證明在水母體內(nèi)還存在另外一的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證明在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP, 后經(jīng)研討闡明，在后經(jīng)研討闡明，在水母體內(nèi)水母

20、體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光生綠色熒光 。 將外源基因與將外源基因與GFP DNA 相連相連, GFP可作為外源基因可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá)的報(bào)告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá).激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用GFP主要運(yùn)用主要運(yùn)用: 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)展準(zhǔn)確定位及動態(tài)察看對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)展準(zhǔn)確定位及動態(tài)察看 可實(shí)時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中可實(shí)時原位

21、跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達(dá)或外界刺激因子的作用下的時空表達(dá), 如某種轉(zhuǎn)錄因子的核如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。的膜轉(zhuǎn)位等。 GFP基因與分泌蛋白基因銜接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因與分泌蛋白基因銜接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動態(tài)察看可動態(tài)察看 該分該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯就能顯 示示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的構(gòu)造及病理過程構(gòu)造及病理過程 可用于察看分子

22、的運(yùn)動可用于察看分子的運(yùn)動FRAP蛋白之間的相互作用蛋白之間的相互作用FRET激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用三三.動態(tài)丈量動態(tài)丈量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化丈量細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化丈量1).游離游離Ca2+丈量丈量 檢測游離檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探變化熒光探針的原理：這類探針多為針多為Ca2+螯合劑，不與螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只需與乙酰甲酯光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只需與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)

23、合后發(fā)出熒光。Kd值為值為Ca2+解離常數(shù)，闡明檢測解離常數(shù)，闡明檢測Ca2+濃度的范濃度的范圍圍:0.1xKd-10 xkd, Kd和很多要素有關(guān)，如和很多要素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值濃度值(10-100n M)，細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃超載濃度值根底度值根底Ca2+濃度的濃度的10倍左右倍左右 熒光探針熒光探針 激發(fā)波長激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射波長 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 5

24、30nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 328nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用程序化丈量：用程序化丈量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)展不同時間序列的掃描測中的編程按鈕可進(jìn)展不同時間序列的掃描測 量。量。 F/F=(F-Fbase)/(

25、Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對丈量濃度絕對丈量1單波長公式法單波長公式法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時的熒光強(qiáng)度細(xì)胞內(nèi)無鈣時的熒光強(qiáng)度( MnCl2)Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強(qiáng)度：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強(qiáng)度(A23187)丈量時切記細(xì)胞內(nèi)靜息丈量時切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低F值不值不低于低于40激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用細(xì)胞內(nèi)生理細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值濃度值10-8 -10-7 M細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值根底超載濃度值根

26、底Ca2+濃度的濃度的10倍左右倍左右2規(guī)范曲線法規(guī)范曲線法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做規(guī)范曲線，橫軸為做規(guī)范曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度3比例熒光的丈量比例熒光的丈量.雙波長雙波長(比例熒光：比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用快速快速Ca2+變化的丈量

27、變化的丈量1.改動掃描速度改動掃描速度2.采用雙向掃描采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率犧牲空間分辨率4.采用線掃描采用線掃描(xt)細(xì)胞器的細(xì)胞器的Ca2+丈量丈量1.線粒體內(nèi)游離線粒體內(nèi)游離Ca2+丈量丈量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色線粒體熒光探針，紅色2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化變

28、化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能運(yùn)用，因生物發(fā)光很弱不能運(yùn)用Confocal檢測檢測 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+丈量的運(yùn)用鈣的特性1細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍2細(xì)胞膜浸透性稍有改動或鈣庫釋放稍有添加，導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高3細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)2神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3學(xué)習(xí)記憶的加強(qiáng)4卵子受精5細(xì)胞分裂和再生6細(xì)胞調(diào)亡7細(xì)胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用8細(xì)胞信號傳導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)

29、9. DNA合成合成10. 基因表達(dá)基因表達(dá)細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病胞內(nèi)鈣濃度異常胞內(nèi)鈣濃度異常2糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病胞內(nèi)鈣濃度增高胞內(nèi)鈣濃度增高3人體缺鈣人體缺鈣骨鈣大量喪失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高骨鈣大量喪失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4老化和老年性癡呆老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值濃度值10-8 -10-7 M細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值根底超載濃度值根底Ca2+濃度的濃度的10倍左右倍左右激光掃描共焦顯微

30、鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用電刺激引起骨骼肌 細(xì)胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 pH值的檢測：值的檢測： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0自在基的檢測自在基的檢測熒光探針：熒光探針：H2DCF-DAH2DCF-DA504nm/529nm504nm/529nm2-2-氫，氫，2 2氯熒光素乙酰乙酸鹽氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外胞外H2DCF-DA H2DCF-DA 分散入細(xì)胞內(nèi)分散入細(xì)胞內(nèi) 酯酶脫乙酰酯酶脫乙酰DCF-H(DCF-H(

31、不熒發(fā)光不熒發(fā)光 DCFDCF發(fā)熒光發(fā)熒光* *樣品不能在鏡下用汞燈照射及察看樣品不能在鏡下用汞燈照射及察看 Dihydrorhodamine 123Dihydrorhodamine 123507nm/529nm507nm/529nmH2rhod123 H2rhod123 被動分散入細(xì)胞內(nèi)被動分散入細(xì)胞內(nèi) 在細(xì)胞內(nèi)被氧化成在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123rod123發(fā)光發(fā)光激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程及定位分布藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程及定位分布 xyzt 掃描掃描 激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用激光掃描共焦顯微鏡運(yùn)用四四. . 膜電位的丈量膜電位的丈量標(biāo)志膜電位探針標(biāo)志膜電位探針( (慢反響：慢反響：JC1 510nmJC1 510nm 530/590nm 530/590nmDioc5(3) 548nmDioc5(3) 548nm 573nm 573nmDioc6(3) 484nmDioc6(3) 484nm 500nm 500nm快反響探針：快反響探針：Di-4-ANEPPS 496nmDi-4-ANEPPS 496nm 70