核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)學(xué)

1、核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)學(xué) 第一講 核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第二講 蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第三講 酶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第四講 糖類化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第五講 脂類化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第六講 維生素和輔酶化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)授課內(nèi)容第1頁/共50頁課堂理論：課前輔導(dǎo)生化大分子基本性質(zhì)、提取、分離純化、含量檢測(cè)等相關(guān)生化物質(zhì)的分離分析技術(shù)。項(xiàng)目任務(wù)：設(shè)計(jì)案例，引導(dǎo)學(xué)生去解決案例問題的方式向?qū)W生布置項(xiàng)目任務(wù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施要求。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：學(xué)生分組查閱資料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案網(wǎng)上遞交教師修改及審核大組討論評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作：各小組（2人）為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)試劑、器材的準(zhǔn)備，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容操作。實(shí)驗(yàn)論文：根據(jù)任務(wù)要求，每位學(xué)生獨(dú)立完成課程論文。課堂

2、討論：大組為單位進(jìn)行全班ppt形式交流匯報(bào)實(shí)驗(yàn)實(shí)施流程第2頁/共50頁課程內(nèi)容課程內(nèi)容學(xué)時(shí)綜合訓(xùn)練內(nèi)容綜合訓(xùn)練內(nèi)容理論輔導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)評(píng)價(jià)2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，DNA提取與鑒定提取與鑒定技術(shù)，案例引導(dǎo)，項(xiàng)目任務(wù)發(fā)布；技術(shù)，案例引導(dǎo)，項(xiàng)目任務(wù)發(fā)布；學(xué)生設(shè)計(jì)方案評(píng)價(jià)交流學(xué)生設(shè)計(jì)方案評(píng)價(jià)交流實(shí)驗(yàn)1 基因組DNA的提取與PCR鑒定16基因組基因組DNA提取提取DNA含量和純度測(cè)定含量和純度測(cè)定DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR及產(chǎn)物檢測(cè)及產(chǎn)物檢測(cè) 課堂研討2實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)，實(shí)驗(yàn)成果、創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)過程總結(jié)，實(shí)驗(yàn)成果、創(chuàng)新技術(shù)分享，教師點(diǎn)評(píng)和總結(jié)技術(shù)分享，教師點(diǎn)評(píng)和總結(jié) 第一講 核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)

3、技術(shù)第3頁/共50頁案例1 目前，人們的生活中充斥了越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，目前，人們的生活中充斥了越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，如轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米、馬鈴薯、如轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因玉米、馬鈴薯、水稻等等。水稻等等。 轉(zhuǎn)基因作為一種新興的生物技術(shù)手段，它的不成熟轉(zhuǎn)基因作為一種新興的生物技術(shù)手段，它的不成熟和不確定性，使得和不確定性，使得轉(zhuǎn)基因食品的安全性成為人們關(guān)轉(zhuǎn)基因食品的安全性成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)注的焦點(diǎn)。 問題：如何檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品？第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目發(fā)布與設(shè)計(jì)方案評(píng)價(jià)第4頁/共50頁什么是轉(zhuǎn)基因食品？ 轉(zhuǎn)基因食品：以轉(zhuǎn)基因食品：以轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物為直接食品或?yàn)樵霞訛橹苯?/p>

4、食品或?yàn)樵霞庸どa(chǎn)的食品。工生產(chǎn)的食品。 轉(zhuǎn)基因食品利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的轉(zhuǎn)基因食品利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的基因轉(zhuǎn)移到其他物種基因轉(zhuǎn)移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，中去，改造生物的遺傳物質(zhì)，使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人們所使其在形狀、營養(yǎng)品質(zhì)、消費(fèi)品質(zhì)等方面向人們所需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。 第5頁/共50頁轉(zhuǎn)基因育種的程序？標(biāo)記基因 啟動(dòng)子 外源目的基因 終止序列載體的構(gòu)建第6頁/共50頁轉(zhuǎn)基因食品的核酸檢測(cè)技術(shù) 檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)對(duì)象：轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子、終止子、抗性篩選：轉(zhuǎn)基因的啟動(dòng)子、終止子、抗性篩選基因、目的基因等外源基因基因、目的基因等外源基因

5、 檢測(cè)方法檢測(cè)方法：普通定性：普通定性PCR、實(shí)時(shí)熒光定量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因芯片基因芯片 其中以普通定性其中以普通定性PCR、實(shí)時(shí)熒光定量、實(shí)時(shí)熒光定量PCR最常用。最常用。核酸定性PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品第7頁/共50頁 樣品基因組DNA的提取 DNA提取質(zhì)量檢測(cè) 特有序列的PCR 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 進(jìn)一步驗(yàn)證：測(cè)序、PCR產(chǎn)物酶切鑒定、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法等一般步驟核酸定性PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品第8頁/共50頁案例2 某實(shí)驗(yàn)人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，某實(shí)驗(yàn)人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特性初步鑒定為真菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特

6、性初步鑒定為真菌。 真菌種類繁多，地球上大約存在真菌種類繁多，地球上大約存在150150萬種真菌，已經(jīng)萬種真菌，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用的大約有被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用的大約有6900069000種。種。 生物遺傳物質(zhì)攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應(yīng)用分子生物學(xué)鑒定手段對(duì)真菌進(jìn)行種類鑒定和系統(tǒng)分類。 問題：如何準(zhǔn)確鑒定其種屬 ？第9頁/共50頁圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物l真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4種，在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。l18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元（圖1），三者高度保守

7、，適合較高等級(jí)水平生物群體間的系統(tǒng)分析。l其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，進(jìn)化相對(duì)迅速，具有多態(tài)性，適合較低等級(jí)水平的系統(tǒng)學(xué)研究。18S rDNA5.8S rDNA28S rDNA53ITS1ITS2ITS1 primerITS2 primerITS3 primerITS4 primer第10頁/共50頁 設(shè)計(jì)特定引物對(duì)該真菌菌株中的基因組中的設(shè)計(jì)特定引物對(duì)該真菌菌株中的基因組中的rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)的特定核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄區(qū)的特定核苷酸片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增，通過對(duì)所獲得的通過對(duì)所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，

8、與已知產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，與已知真菌序列比對(duì)即可確定該菌株在系統(tǒng)分類學(xué)上的真菌序列比對(duì)即可確定該菌株在系統(tǒng)分類學(xué)上的位置。位置。基于rDNA-ITS序列在真菌分子鑒定中的應(yīng)用，你如何獲得高質(zhì)量的基因組DNA并鑒定菌株的目的基因序列？ 第11頁/共50頁P(yáng)rimerSequence（5- 3）Length(bp)ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG19ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC20ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC20ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC20表1 真菌rDNA-ITS通用擴(kuò)增引物18S rDNA5.8S rDNA28S rD

9、NA53ITS1ITS2ITS1 primerITS2 primerITS3 primerITS4 primer圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物真菌rDNA-ITS通用引物第12頁/共50頁實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求： 根據(jù)案例提交一個(gè)具體解決基因組提取及分離鑒定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，包括從提供的不同材料中提取、分離得到基因組DNA，測(cè)定所得DNA的含量、純度及分子大小，并利用已知引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析PCR檢測(cè)的結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)題目： 基因組DNA的提取與PCR鑒定實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目與任務(wù)布置第13頁/共50頁分組題目 項(xiàng)目1：定性PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品 項(xiàng)目2：rDNA-ITS擴(kuò)增法鑒定真菌種類全班分成4大組，各選一個(gè)

10、題目。每個(gè)大組3個(gè)小組，2名同學(xué)一個(gè)小組。以大組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和討論。以小組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作。第14頁/共50頁實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)l學(xué)習(xí)從各種材料（動(dòng)物、植物組織、微生物）中提取和純化DNA的原理和操作技術(shù)。 l學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測(cè)，確定DNA的純度、含量與分子大小。l學(xué)習(xí)PCR的基本原理和操作方法。l掌握高速冷凍離心機(jī)、微量移液槍、水平電泳儀、PCR儀等儀器設(shè)備的使用。第15頁/共50頁實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需包含的主要技術(shù)內(nèi)容 基因組DNA提?。嚎蛇x用濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、水抽提法、試劑盒法等 DNA含量測(cè)定：可選用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA純度測(cè)定：紫外分光光度法

11、 DNA分子大小測(cè)定：瓊脂糖凝膠電泳 PCR技術(shù)第16頁/共50頁實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求l各標(biāo)準(zhǔn)曲線l基因組DNA產(chǎn)品得率（mg/100g)l基因組DNA產(chǎn)品純度l基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖lPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖lPCR產(chǎn)物分子大?。╞p）l檢測(cè)結(jié)論第17頁/共50頁第18頁/共50頁 基因組DNA提取 4學(xué)時(shí) DNA的含量與純度測(cè)定 4學(xué)時(shí) DNA的瓊脂糖凝膠電泳 4學(xué)時(shí) PCR及產(chǎn)物檢測(cè) 4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間安排第19頁/共50頁課后研討題 1.DNA提取的方法主要有哪些？并說明各方法的原理。 2.結(jié)合本人實(shí)驗(yàn)操作的體會(huì)，試述在提取過程中應(yīng)如何避免大分子DNA的降解和斷裂？ 3.查閱資

12、料，說明提取的基因組DNA有哪些方面的用途？ 4.查閱資料，舉例說明DNA瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用和發(fā)展。 5.瓊脂糖凝膠電泳所用DNA染料EB具有潛在的致癌性，查閱資料，查找可替代EB的染料并說明優(yōu)缺點(diǎn)。第20頁/共50頁課后研討題 6.結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)，說明PCR技術(shù)的主要用途和發(fā)展。 7.通過本次實(shí)驗(yàn)，談?wù)勀銓?duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性的認(rèn)識(shí)。 8.查閱資料，說明轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)的常規(guī)方法。 9.查閱資料，綜述常用的物種分子鑒定技術(shù)。 10.案例分析：在美國海豹突擊隊(duì)擊斃本拉登幾個(gè)小時(shí)后，美國總統(tǒng)奧巴馬向全世界宣布拉登已被成功擊斃，死者確定為本拉登的可能性是99.9%。查閱資料，根據(jù)所學(xué)核酸分子鑒定技術(shù)，分

13、析如何對(duì)其進(jìn)行法醫(yī)鑒定。 第21頁/共50頁相關(guān)事項(xiàng)相關(guān)事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)習(xí)慣 藥品配制與保存 實(shí)驗(yàn)記錄 實(shí)驗(yàn)交流 實(shí)驗(yàn)論文材料名稱材料名稱份份 數(shù)數(shù)分值分值實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案115%實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)記錄110%實(shí)驗(yàn)論文實(shí)驗(yàn)論文250%課后研討題課后研討題210%匯報(bào)匯報(bào)ppt115%小組上交材料第22頁/共50頁論文格式模板第23頁/共50頁研討課要求 以大組為單位課后總結(jié)結(jié)果，討論，制作一份ppt，課內(nèi)討論匯報(bào)。 ppt內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)背景和目的，實(shí)驗(yàn)主要原理，實(shí)驗(yàn)條件的選擇，各小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析，課后研討題，實(shí)驗(yàn)體會(huì)等。第24頁/共50頁 l基因組是指細(xì)胞內(nèi)遺傳信息的攜帶者DNA的總體。l為了研

14、究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，要選擇適當(dāng)?shù)牟牧咸崛NA。l 從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于細(xì)胞核中，與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成染色體，原核生物的DNA不與任何蛋白質(zhì)結(jié)合。理論介紹一、內(nèi)容提要第25頁/共50頁 保持基因組DNA結(jié)構(gòu)相對(duì)完整：防止各種因素引起的降解。 純度高：盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質(zhì)、多糖和RNA等）。 得率好：選用合適的方法獲得足夠量的DNA。二、分離純化核酸的總原則第26頁/共50頁三、基因組三、基因組DNADNA提取的原理和方法提取的原

15、理和方法裂解細(xì)胞，釋放DNA核酸分離純化沉淀并吸附核酸核酸溶解（緩沖液）準(zhǔn)備適宜的材料去除蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)第27頁/共50頁細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 細(xì)菌溶菌酶（降解細(xì)胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢劑SDS（破壞細(xì)胞膜） 酵母破壁酶或液氮研磨 植物材料液氮研磨（使細(xì)胞凍結(jié)，用研缽碾制成粉狀） 動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨 化學(xué)法、機(jī)械法、生物法第28頁/共50頁DNA與蛋白質(zhì)的分離 SDS：真核生物的DNA與組蛋白結(jié)合形成DNP，SDS能夠破壞DNA與蛋白質(zhì)之間的靜電引力或配位鍵，可使DNA與蛋白質(zhì)解聚，釋放出DNA。 CTAB：是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，能與核酸形成復(fù)合

16、物，在高鹽溶液（NaCl0.7M）中是可溶的，當(dāng)NaCl降低到0.3M 時(shí)，可沉淀CTAB-核酸復(fù)合物。 苯酚-氯仿-異戊醇：苯酚、氯仿能變性蛋白質(zhì)，離心分層，DNA溶于上層水相，變性蛋白質(zhì)位于水相和有機(jī)相之間。異戊醇可減少抽提過程的泡沫產(chǎn)生。1.DNP中DNA與蛋白質(zhì)的分離2.蛋白質(zhì)的去除核酸分離純化第29頁/共50頁RNA的去除 用不含DNA酶的RNase處理，使RNA降解。 添加RNase處理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，離心除去蛋白質(zhì)及寡核苷酸。核酸分離純化第30頁/共50頁 含DNA的水相可用1倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇沉淀。 基因組的大分子DNA沉淀形成纖維狀絮團(tuán)漂浮其中

17、，可用吸頭將其挑出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附在壁上及底部。 如果DNA沉淀量少或無法撈出，可離心獲取沉淀。 沉淀DNA前，為提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸銨等鹽類促進(jìn)沉淀。 獲取的沉淀需再用70%乙醇洗滌除去殘留的有機(jī)物、無機(jī)鹽等。沉淀并吸附核酸第31頁/共50頁基因組基因組DNADNA提取注意事項(xiàng)提取注意事項(xiàng) 使用新鮮、幼嫩的材料；材料應(yīng)適量，過少造成核酸提取量少，過多影響裂解，導(dǎo)致DNA量少。（推薦0.2-5g）。 簡化操作步驟，縮短提取過程，避免物理、化學(xué)和生物的因素對(duì)核酸的降解，如機(jī)械剪切力、高溫和DNase等酶，防止過酸、過堿，避免劇烈振蕩和混合。 采用酚-氯仿抽提時(shí)應(yīng)

18、采用上下顛倒的方法充分混勻，但動(dòng)作要輕柔，離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間。 沉淀DNA用的異戊醇、乙醇事先放入-20冰箱，待用時(shí)取出。第32頁/共50頁特別注意特別注意 液氮研磨時(shí)為防止凍傷，需戴棉線手套操作，研磨越細(xì)越好。 苯酚腐蝕性極強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套。 一定要搞清提取原理，知道每一步操作DNA所在的位置，防止出錯(cuò)。第33頁/共50頁四、基因組DNA的檢測(cè)1、二苯胺顯色法測(cè)定DNA濃度 二苯胺法定量測(cè)定DNA的原理為：在強(qiáng)酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生嘌呤堿基、脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中，2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中成為w-羥基

19、-r-酮基戊醛，此物與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400ug范圍內(nèi)光吸收值與DNA含量成正比。 詳見教材：實(shí)驗(yàn)二十二 二苯胺顯色法測(cè)定DNA濃度第34頁/共50頁2、紫外分光光度法測(cè)定DNA含量 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260nm波長下，在pH7.0時(shí)每毫升含1g DNA溶液的光吸收值約為0.020。故測(cè)定待測(cè)DNA溶液260nm的光吸收值即可計(jì)算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。詳見實(shí)驗(yàn)課件：核酸定量測(cè)定第35頁/共50頁3、紫外分光光度法測(cè)定DNA純度 當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或

20、其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。DNA純度的判斷根據(jù)OD260/OD280值判斷，符合要求、純度高的純化DNA其比值為1.8。如果樣品中污染有蛋白質(zhì)或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值。此時(shí)無法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。第36頁/共50頁4、瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定DNA分子大小 電泳電泳是荷電溶質(zhì)或粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生定向泳動(dòng)的現(xiàn)象。核酸的分離和鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳。 不同大小大小、不同形狀形狀和不同構(gòu)象構(gòu)象的DNA 分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。瓊脂糖凝膠電泳分離后的DNA可用

21、溴化乙啶溴化乙啶（EB）染色。詳見實(shí)驗(yàn)課件：DNA的瓊脂糖凝膠電泳第37頁/共50頁五、PCR檢測(cè)技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR），是一種選擇性的體外擴(kuò)增DNA或RNA的分子生物學(xué)技術(shù)。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 第38頁/共50頁 PCR由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： 模板DNADNA的變性：模板DNADNA經(jīng)加熱至9494左右一定時(shí)間后，使模板DNADNA雙鏈或經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNADNA解離，成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備； 模板D

22、NADNA與引物的退火：模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至5050左右，引物與模板DNADNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合； 引物的延伸：DNADNA模板引物結(jié)合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPdNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNADNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 第39頁/共50頁P(yáng)CR反應(yīng)示意圖第40頁/共50頁 重復(fù)循環(huán)：變性退火延伸這三個(gè)過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。 每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)增目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 PCR動(dòng)畫演示第41頁/共50

23、頁 第一講 核酸化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第二講 蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第三講 酶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第四講 糖類化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第五講 脂類化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 第六講 維生素和輔酶化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)授課內(nèi)容第42頁/共50頁課堂理論：課前輔導(dǎo)生化大分子基本性質(zhì)、提取、分離純化、含量檢測(cè)等相關(guān)生化物質(zhì)的分離分析技術(shù)。項(xiàng)目任務(wù)：設(shè)計(jì)案例，引導(dǎo)學(xué)生去解決案例問題的方式向?qū)W生布置項(xiàng)目任務(wù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施要求。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：學(xué)生分組查閱資料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案網(wǎng)上遞交教師修改及審核大組討論評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)操作：各小組（2人）為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)試劑、器材的準(zhǔn)備，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容操作。實(shí)驗(yàn)論文：根據(jù)任務(wù)要求，每位學(xué)生獨(dú)立完成課程論文。課堂討論：大組為單位

24、進(jìn)行全班ppt形式交流匯報(bào)實(shí)驗(yàn)實(shí)施流程第43頁/共50頁案例2 某實(shí)驗(yàn)人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，某實(shí)驗(yàn)人員從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)植酸酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特性初步鑒定為真菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特性初步鑒定為真菌。 真菌種類繁多，地球上大約存在真菌種類繁多，地球上大約存在150150萬種真菌，已經(jīng)萬種真菌，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用的大約有被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用的大約有6900069000種。種。 生物遺傳物質(zhì)攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應(yīng)用分子生物學(xué)鑒定手段對(duì)真菌進(jìn)行種類鑒定和系統(tǒng)分類。 問題：如何準(zhǔn)確鑒定其種屬 ？第44頁/共50頁圖1 真菌rDNA轉(zhuǎn)錄區(qū)和相關(guān)引物l真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4種，在染色體上頭尾相連，串聯(lián)排列，相互間由間隔區(qū)分隔。l18S、5.8S和28S rDNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元（圖1），三者高度保守，適合較高等級(jí)水平生物群體間的系統(tǒng)分析。l其間的間隔區(qū)為內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS），包括ITS1和ITS2，進(jìn)化相