無菌檢查操作規(guī)程

1、頒發(fā)部門無菌檢查操作規(guī)程接收部門生效日期操作標(biāo)準(zhǔn)-質(zhì)量制定人制定日期文件編號(hào)審核人審核日期文件頁數(shù)共7頁批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期分發(fā)部門1.目的:建立無菌檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2 .范圍：適用于本廠質(zhì)監(jiān)科化驗(yàn)室對(duì)本廠生產(chǎn)的注射劑進(jìn)行無菌檢查。3 .責(zé)任：化驗(yàn)員有責(zé)任按本操作規(guī)程操作，并對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果負(fù)責(zé)。4 .定義：無菌檢查法系指檢查藥品是否無菌的一種方法。5 .內(nèi)容：5. 1無菌操作設(shè)備：無菌操作室或超凈工作臺(tái)，無菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精燈等。5.1.1 無菌室分無菌操作室和緩沖問。在緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆、干手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的層流裝置，

2、局部潔凈度100級(jí)超凈工作臺(tái)。緩沖間及操作室內(nèi)均設(shè)置能達(dá)到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作臺(tái)應(yīng)保持空氣正壓。5.1.2 無菌室應(yīng)每周和每次操作前用0.1%新潔爾滅或2%甲酚液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角，開動(dòng)無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時(shí)。在每次操作完畢，同樣用2%甲酚或0.1%新潔爾滅溶液擦拭工作臺(tái)面，用紫外光燈殺菌半小時(shí)。5.1.3 無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)。取直徑90m似碟，在接種室內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml,制成平板：在35-37C預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將3個(gè)

3、平板以無菌方式帶入無菌操作問的潔凈區(qū)域左、中、右各放1個(gè)；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將蓋蓋好，置35-37C培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，3個(gè)平板上生長的菌落數(shù)相加總數(shù)不得超過10個(gè)。無菌操作臺(tái)面或超凈工作臺(tái)應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢測其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級(jí)（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）,檢測塵埃粒徑05pm的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)/升；空氣流量應(yīng)控制在0.75-1.0m3/s;細(xì)菌菌落數(shù)平均1個(gè)，可根據(jù)無菌狀況定期置換過濾器。5.1.4 無菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒用5%甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、銀子、75%酒精棉及拖鞋等。5.2 儀器、用具：5.2.1 真空泵、恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、托盤天平（精

4、度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、三角瓶（100、500ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求規(guī)格）、試管、雙碟（9cm、注射針、銀子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環(huán)、微孔濾膜（直徑約5cM,孔徑應(yīng)在0.45±0.02pm）載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。5.2.2 用具的包扎：5.2.2.1 移液管在移液管上端管內(nèi)，松松地塞進(jìn)少許原棉，然后放入不銹鋼滅菌筒內(nèi)。5.2.2.2 試管在管口塞上紗布棉塞。5.2.2.3 無菌衣、褲、帽、口罩將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入布袋，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2.4 注射器洗滌干凈的注射

5、器及注射針頭裝配好后，放入墊有紗布的帶蓋容器內(nèi)（飯盒）一層層放好，上面蓋上紗布，然后蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。5.2.2.5 濾器將檢驗(yàn)合格后微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出后固定在細(xì)菌過濾器的濾板上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包扎，裝妥后放入容器內(nèi)，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包扎。5.2.3 用具的滅菌：將包扎好的用具，在121±0.5C蒸汽滅菌柜中滅菌30分鐘，物品取出時(shí)切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負(fù)壓，易致染菌，應(yīng)置溫箱或或加溫烘干。5.3 培養(yǎng)基、試劑：5.3.1 一般采用商

6、品干燥培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌使用。使用前，按要求分裝滅菌好的細(xì)菌培養(yǎng)基須經(jīng)30-35C培養(yǎng)48小時(shí)，真菌培養(yǎng)基須經(jīng)20-25C培養(yǎng)72小時(shí)，證明無菌生長后方可使用。制備的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基應(yīng)半個(gè)月內(nèi)用完，在供試品接種前，培養(yǎng)基指示劑氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度約1/5,否則須經(jīng)水浴煮沸加熱，只限加熱一次。5.3.2 革蘭氏碘液：先用3-5ml蒸儲(chǔ)水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解后，力口蒸儲(chǔ)水稀釋至300ml,搖勻。置密閉棕色瓶中備用。5.3.3 結(jié)晶紫染色液：將結(jié)紫1.0g溶解于20m195叱醇中后，與8

7、0ml1%t酸俊溶液相混合，靜置48小時(shí)使用。此液穩(wěn)定，置密閉的棕色瓶中可儲(chǔ)存數(shù)月。5.3.4 沙黃染色液：將0.2g沙黃溶解于10m195叱醇中，待完全溶解后再加蒸儲(chǔ)水至100ml。5.3.5 生理鹽水：稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝后于121±0.5C濕熱滅菌30分鐘。供作稀釋劑用5.3.6 75%乙醇量取無水乙醇75ml,加水稀釋至100ml,搖勻，即得。5.3.7 0.1%新潔爾滅：量取5麻潔爾滅20ml,加水稀釋至約1000ml,搖勻，即得。5.4 培養(yǎng)基靈敏度檢查：5.4.1 新購的干燥培養(yǎng)基或采用不同牌號(hào)原材料的新鮮培養(yǎng)基，其質(zhì)量均應(yīng)符合靈敏度檢查要求。(1

8、)取藤黃微球菌MicrococcusluteusCMCC(B)28001的營養(yǎng)瓊脂斜面和白色念珠菌CandidaalbicansCMCC(F)98001的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；取生抱梭菌ClostridiumsporogenesCMCC(B)64941不含瓊脂的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，用滅菌毛細(xì)管將其吸至滅菌離心管內(nèi)，離心，棄去上清液，沉淀菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻菌懸液。然后以10倍系列稀釋后，制成1ml中含10-100個(gè)菌并計(jì)數(shù)。(2)取藤黃微球菌、生抱梭菌的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，白色念珠菌的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新

9、鮮培養(yǎng)物，取接種至霉菌培養(yǎng)基內(nèi)，20-25C用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，制成1ml中含10-100個(gè)菌并計(jì)數(shù)。將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml,分別接種至每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，生抱梭菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml,分別接種至每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml,接種至每管裝量為9ml的真菌培養(yǎng)基3管，以未接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)5天并逐日記錄結(jié)果。結(jié)果判定：以每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長，即該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合要求。5.4.2 配制的培養(yǎng)基應(yīng)在涼暗處保存，一般

10、不得超過2周，臨用前細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基分別經(jīng)30-35C和20-25C培養(yǎng)不少于48小時(shí)和72小時(shí)，證明無菌生長后方可使用。5.4.3 需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基在試管中裝量高度不得少于7Cm其指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1/5,否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。5.5 對(duì)照用菌液的制備：5.5.1 試驗(yàn)用菌種、菌種的復(fù)蘇、菌種的接種與保存等均應(yīng)按照“抗生素微生物檢定法”標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程項(xiàng)下操作。5.5.2 金黃色葡萄球菌菌液用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌Staphy-lococcusaureusCMCC(B)26003的營養(yǎng)瓊脂斜面新

11、鮮培養(yǎng)物少許，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35C培養(yǎng)16-18小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:1065.5.3 生抱梭菌菌液用接種環(huán)取生抱梭菌CMCC(B)64941的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至相同培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35C培養(yǎng)18-24小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。5.5.4 白色念珠菌菌液用接種環(huán)取白色念珠菌CMCC(F)98001的真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至真菌培養(yǎng)基內(nèi)，在20-25C培養(yǎng)24小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105o5.5.5 上述制備的菌液，一般當(dāng)日使用。5.6 進(jìn)入無菌室的操作要點(diǎn)：5.6.1 根據(jù)試驗(yàn)程序，將用具物品

12、搬入緩沖間，打開紫外光燈和空氣過濾裝置并使其工作1小時(shí)以上。5.6.2 操作人員用肥皂水刷洗雙手，關(guān)閉緩沖間紫外光燈，進(jìn)入緩沖間內(nèi)，關(guān)閉第一層門，用2豚蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手，用消毒毛巾擦干，換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3 關(guān)閉無菌室內(nèi)紫外光燈，進(jìn)入第二層門并將用具搬至無菌室內(nèi)，關(guān)閉無菌室門。5.6.4 凡進(jìn)入無菌室后不應(yīng)再外出取物品，因此，在每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并準(zhǔn)備好備用物品。從進(jìn)入第一層門直至無菌室內(nèi)，隨操作人員的進(jìn)入應(yīng)噴霧2麻蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液。5.7 檢查法：5.7.1 無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用于非抗菌作用的供試品；后者適

13、用于有抗菌作用的或大容量的供試品。5.7.2 操作時(shí)，應(yīng)先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面后，以無菌的方法取內(nèi)容物。5.7.3 凡無菌檢查中，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對(duì)照。5.7.4 供試品制備：用滅菌銀取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，蓋為橡皮塞時(shí)，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取藥液。按規(guī)定須稀釋或滅活的供試品，可直接或?qū)⑵績?nèi)供試液抽出至滅菌玻璃容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理并稀釋至規(guī)定的體積和濃度；抽取瓶中內(nèi)容液體時(shí)，應(yīng)將供試品倒置并使針頭在液面下。5.7.5 直接接種法：按規(guī)定量取供試品，以無菌操作將該供試品分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基6管，其中1管接種金

14、黃色葡萄球菌液1ml,作陽性對(duì)照，另接種于真菌培養(yǎng)基5管。輕輕搖動(dòng)，使供試品與培養(yǎng)基混合。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置30-35C、真菌培養(yǎng)基管置20-25C培養(yǎng)7日。在培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對(duì)照管在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)有菌生長，如在加入供試品后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)7天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2日，真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。5.7.6 薄膜過濾法：將微孔濾膜過濾裝置、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。取規(guī)定量供試品

15、，按規(guī)定的方法處理后，加入0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合后，通過裝有孔徑不大于0.45仙m的薄膜過濾器，減壓抽干后，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次至少100ml,取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養(yǎng)基中，按規(guī)定溫度和時(shí)間培養(yǎng)。陽性對(duì)照管應(yīng)根據(jù)供試品特性加入相應(yīng)對(duì)照菌液1ml（抗細(xì)菌藥物，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌藥物，以生抱梭菌為對(duì)照菌；抗真菌藥物，以白色念珠菌為對(duì)照菌）。陽性對(duì)照管細(xì)菌應(yīng)在培養(yǎng)24-48小時(shí)，真菌應(yīng)在培養(yǎng)24-72小時(shí)有菌生長。5.8 結(jié)果判斷：第7頁/共7頁當(dāng)陽性對(duì)照管顯渾濁并確有菌生長，陰性對(duì)照管呈陰性時(shí)，可根據(jù)觀察所得的結(jié)果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖渾濁但經(jīng)證明并非有菌生長，均應(yīng)判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基