生物化學(xué)-第一章蛋白質(zhì)

1、一。什么是生物化學(xué)一。什么是生物化學(xué) 是生命的化學(xué)，是研究微生物、植物、動(dòng)是生命的化學(xué)，是研究微生物、植物、動(dòng)物、及人體等的化學(xué)組成和生命過程中化學(xué)變物、及人體等的化學(xué)組成和生命過程中化學(xué)變化的一門科學(xué)。化的一門科學(xué)。18世紀(jì)下半葉，法國(guó)化學(xué)家研究燃燒和呼吸，為生命過世紀(jì)下半葉，法國(guó)化學(xué)家研究燃燒和呼吸，為生命過程中的氧化奠定了基礎(chǔ)。程中的氧化奠定了基礎(chǔ)。德國(guó)化學(xué)家李比希（德國(guó)化學(xué)家李比希（1803-1873）首次提出新陳代謝一詞。）首次提出新陳代謝一詞。德國(guó)醫(yī)生霍佩德國(guó)醫(yī)生霍佩-賽勒賽勒(1825-1895)將生理化學(xué)（生物化學(xué)）將生理化學(xué)（生物化學(xué)）建成一門獨(dú)立的科學(xué)建成一門獨(dú)立的科學(xué)-生

2、物化學(xué)（生物化學(xué)（1877）（Biochemistry）。）。l英國(guó)英國(guó) 霍普金斯發(fā)現(xiàn)維生素（霍普金斯發(fā)現(xiàn)維生素（1929年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)）后又年諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)）后又發(fā)現(xiàn)色氨酸和谷胱甘肽；李約瑟開創(chuàng)胚胎發(fā)生的生物化學(xué)領(lǐng)發(fā)現(xiàn)色氨酸和谷胱甘肽；李約瑟開創(chuàng)胚胎發(fā)生的生物化學(xué)領(lǐng)域；域；Marjory Stephenson從事細(xì)菌生理學(xué)研究；桑格確定了從事細(xì)菌生理學(xué)研究；桑格確定了牛胰島素的結(jié)構(gòu)（牛胰島素的結(jié)構(gòu)（1958諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)），設(shè)計(jì)諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)），設(shè)計(jì)DNA內(nèi)核苷酸內(nèi)核苷酸排列順序（與他人共獲排列順序（與他人共獲1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）。l德國(guó)德國(guó) Emil Fisher化學(xué)家

3、研究糖和嘌呤類物質(zhì)（化學(xué)家研究糖和嘌呤類物質(zhì)（1902年諾貝年諾貝爾化化學(xué)獎(jiǎng)）；爾化化學(xué)獎(jiǎng)）；Hans Fisher 德國(guó)生化學(xué)家研究氯血紅素和德國(guó)生化學(xué)家研究氯血紅素和葉綠素（諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）；埃姆登在糖代謝、脂肪代謝及肝葉綠素（諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）；埃姆登在糖代謝、脂肪代謝及肝臟合成氨基酸方面做出貢獻(xiàn)；邁爾霍夫生化家研究肌肉代謝臟合成氨基酸方面做出貢獻(xiàn)；邁爾霍夫生化家研究肌肉代謝的糖原的糖原-乳酸循環(huán)（乳酸循環(huán)（1922年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；威爾年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；威爾施泰特化學(xué)家研究葉綠素及其它植物色素結(jié)構(gòu)（施泰特化學(xué)家研究葉綠素及其它植物色素結(jié)構(gòu)（1915年諾貝年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）爾化學(xué)

4、獎(jiǎng)） ；溫道斯有機(jī)化學(xué)家研究維生素；溫道斯有機(jī)化學(xué)家研究維生素D等重要生物學(xué)等重要生物學(xué)作用的物質(zhì)（作用的物質(zhì)（1928年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）；瓦爾堡生化家研究細(xì)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）；瓦爾堡生化家研究細(xì)胞呼吸（胞呼吸（1931年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；美國(guó)美國(guó)李普曼分離出輔酶李普曼分離出輔酶A并確定其分子結(jié)構(gòu)（并確定其分子結(jié)構(gòu)（1953年諾貝爾生理年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）；奧喬亞發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)的多核苷酸磷酸化酶與科恩伯格（發(fā)現(xiàn)奧喬亞發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)的多核苷酸磷酸化酶與科恩伯格（發(fā)現(xiàn)DNA分子在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)及試管內(nèi)的復(fù)制方式）共獲分子在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)及試管內(nèi)的復(fù)制方式）共獲1959年諾

5、年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；沃森和克里克建立了沃森和克里克建立了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模式（雙螺旋結(jié)構(gòu)模式（1962年諾貝爾生年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)）諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；尼倫伯格在破譯遺傳密碼方面作出重要貢獻(xiàn)，霍利闡明酵母尼倫伯格在破譯遺傳密碼方面作出重要貢獻(xiàn)，霍利闡明酵母丙氨酸丙氨酸t(yī)RNA的核苷酸的排列順序，科拉納合成了精確結(jié)構(gòu)已的核苷酸的排列順序，科拉納合成了精確結(jié)構(gòu)已知的核酸分子，首次人工復(fù)制成酵母基因，三人共獲知的核酸分子，首次人工復(fù)制成酵母基因，三人共獲1969年年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。生物化學(xué)仍在發(fā)展之中：生物化學(xué)仍在發(fā)展之中：地球上生命

6、是怎樣起源的？地球上生命是怎樣起源的？地球以外的天體上有沒有生命？地球以外的天體上有沒有生命？遺傳物質(zhì)是怎樣進(jìn)化的？遺傳物質(zhì)是怎樣進(jìn)化的？一個(gè)受精卵中的遺傳物質(zhì)怎樣發(fā)生成個(gè)體？一個(gè)受精卵中的遺傳物質(zhì)怎樣發(fā)生成個(gè)體？怎樣發(fā)生為各種器官和組織的？怎樣發(fā)生為各種器官和組織的？癌、病毒、人體自身免疫、大腦記憶、環(huán)境生態(tài)等癌、病毒、人體自身免疫、大腦記憶、環(huán)境生態(tài)等問題。問題。l 源于生物技術(shù)，源于生物技術(shù)，20世紀(jì)世紀(jì)70年代發(fā)展起來年代發(fā)展起來l1?；蚬こ蹋寺〖夹g(shù)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品）。基因工程（克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品）l2。蛋白質(zhì)工程（結(jié)構(gòu)分析、基因修飾）。蛋白質(zhì)工程（結(jié)構(gòu)分析、基因修飾）l3。酶工程（

7、。酶工程（DNA重組技術(shù)克隆酶；產(chǎn)生突變酶；設(shè)計(jì)重組技術(shù)克隆酶；產(chǎn)生突變酶；設(shè)計(jì) 新酶）新酶）l4。細(xì)胞工程（融合、培養(yǎng)、快速繁殖、誘變育種）。細(xì)胞工程（融合、培養(yǎng)、快速繁殖、誘變育種）l5。微生物（發(fā)酵）工程。微生物（發(fā)酵）工程 （生化工程、反應(yīng)器設(shè)計(jì)放（生化工程、反應(yīng)器設(shè)計(jì)放 大、產(chǎn)品分離純化）大、產(chǎn)品分離純化）三。我國(guó)生物工程發(fā)展?fàn)顩r三。我國(guó)生物工程發(fā)展?fàn)顩r1。中科院上海生化所、有機(jī)所和北京大學(xué)共同合作于。中科院上海生化所、有機(jī)所和北京大學(xué)共同合作于1965年年用化學(xué)方法成功完成了人工合成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)用化學(xué)方法成功完成了人工合成具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)結(jié)晶牛胰島素。結(jié)晶牛胰島素。

8、2。1983年，通過協(xié)作采用有機(jī)合成與酶促合成相結(jié)合的方法，年，通過協(xié)作采用有機(jī)合成與酶促合成相結(jié)合的方法，完成酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成。完成酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成。3。酶的作用機(jī)理、血紅蛋白變異、生物膜結(jié)構(gòu)功能等方面做。酶的作用機(jī)理、血紅蛋白變異、生物膜結(jié)構(gòu)功能等方面做出國(guó)際水平的研究結(jié)果。出國(guó)際水平的研究結(jié)果。應(yīng)用遠(yuǎn)景：人類健康、動(dòng)物疾病治療和預(yù)防、污水和廢物處應(yīng)用遠(yuǎn)景：人類健康、動(dòng)物疾病治療和預(yù)防、污水和廢物處理、生物電子學(xué)等等。理、生物電子學(xué)等等。l1。授課內(nèi)容：蛋白質(zhì)、酶、糖、維生素、核酸。授課內(nèi)容：蛋白質(zhì)、酶、糖、維生素、核酸。l（時(shí)間：第（時(shí)間：第1周周第第

9、4周，第周，第7周周第第10周）周）l2。參考資料。參考資料l生物化學(xué)生物化學(xué) 沈同、王鏡巖主編，高教出版社出版沈同、王鏡巖主編，高教出版社出版l生物化學(xué)生物化學(xué) 王鏡巖、朱圣庚、徐長(zhǎng)法主編，高教出版王鏡巖、朱圣庚、徐長(zhǎng)法主編，高教出版 社出版社出版l生物化學(xué)生物化學(xué) B.D.Hames, N.M.Hooper & J.D.Houghtonl科學(xué)出版社出版科學(xué)出版社出版l圖解生物化學(xué)圖解生物化學(xué) P.N.Campbell, A.D.Smith，科學(xué)出版，科學(xué)出版社出版社出版l生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法 北京大學(xué)出版社北京大學(xué)出版社l3。成績(jī)?cè)u(píng)定。成績(jī)?cè)u(píng)定l作業(yè)：（每周

10、三交）作業(yè)：（每周三交）l實(shí)驗(yàn)：（實(shí)驗(yàn)：（5個(gè)，個(gè)，11周開始每周一個(gè)實(shí)驗(yàn)）周開始每周一個(gè)實(shí)驗(yàn)）l （1）蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定和沉淀反應(yīng)）蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定和沉淀反應(yīng)l （2）醋酸纖維膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)）醋酸纖維膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)l （3）多酚氧化酶的制備、性質(zhì)及影響因素）多酚氧化酶的制備、性質(zhì)及影響因素l （4）2709堿性蛋白酶活力測(cè)定堿性蛋白酶活力測(cè)定l （5）3、5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖l考試：（選擇題、簡(jiǎn)答題、計(jì)算題等）考試：（選擇題、簡(jiǎn)答題、計(jì)算題等）l 蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)（protein）是一類重要的生物大分子，是）是一類重要的生物大分子，是“最初的

11、最初的”、“第一重要的第一重要的”意思。意思。l 蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)占有特殊的地位。蛋白質(zhì)和核蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)占有特殊的地位。蛋白質(zhì)和核酸是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的主要成分。原生質(zhì)是生命現(xiàn)酸是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的主要成分。原生質(zhì)是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。象的物質(zhì)基礎(chǔ)。l一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成l C、H、O、N、少量、少量S，有些還有，有些還有P、Fe、Cu、Zn、I、Mo等。等。l 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：蛋白質(zhì)平均含蛋量為蛋白質(zhì)含量測(cè)定：蛋白質(zhì)平均含蛋量為16%，l 凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量 = 蛋白氮蛋白氮 6.25l式中的式中的6.25，即，即16%的倒數(shù)，為的倒數(shù)，

12、為1克氮所代表的蛋白質(zhì)克氮所代表的蛋白質(zhì)質(zhì)量（克數(shù)）。質(zhì)量（克數(shù)）。l二、蛋白質(zhì)的分類二、蛋白質(zhì)的分類l1。按化學(xué)組成分類：簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)（僅含氨基酸，不含。按化學(xué)組成分類：簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)（僅含氨基酸，不含 其它化學(xué)成分，如核糖核酸酶、胰島素等）；結(jié)合蛋其它化學(xué)成分，如核糖核酸酶、胰島素等）；結(jié)合蛋白質(zhì)（除蛋白質(zhì)部分外，還有非蛋白質(zhì)成分，如血紅白質(zhì)（除蛋白質(zhì)部分外，還有非蛋白質(zhì)成分，如血紅蛋白、核蛋白等）。蛋白、核蛋白等）。2。按外形分類。按外形分類a. 球狀蛋白質(zhì)：分子對(duì)稱性好，外形接近球狀或橢球狀，溶解球狀蛋白質(zhì)：分子對(duì)稱性好，外形接近球狀或橢球狀，溶解 度較好，能結(jié)晶，大多數(shù)蛋白屬于這一類。度較

13、好，能結(jié)晶，大多數(shù)蛋白屬于這一類。b. 纖維狀蛋白質(zhì)：對(duì)稱性差，分子類似細(xì)棒或纖維。又分為可纖維狀蛋白質(zhì)：對(duì)稱性差，分子類似細(xì)棒或纖維。又分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)（如肌球蛋白、血纖維蛋白原）和不溶性纖溶性纖維狀蛋白質(zhì)（如肌球蛋白、血纖維蛋白原）和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)（如膠原、絲心蛋白）。維狀蛋白質(zhì)（如膠原、絲心蛋白）。l 在四大類生物分子中（糖、脂、蛋白質(zhì)、核酸），在四大類生物分子中（糖、脂、蛋白質(zhì)、核酸），蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸（蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸（amino acid）是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。自然界中存在的成千上萬種蛋是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。自然界中存在的成千上萬種蛋白

14、質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上的驚人的多樣性是由白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上的驚人的多樣性是由20種常見種常見氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)造成的。包括：氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)造成的。包括：l? 聚合能力聚合能力l? 特有的酸堿性質(zhì)特有的酸堿性質(zhì)l? 側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)功能的多樣性側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)及其化學(xué)功能的多樣性l? 手性手性l 它們是討論蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)、功能以及其它有它們是討論蛋白質(zhì)和酶的結(jié)構(gòu)、功能以及其它有關(guān)問題的基礎(chǔ)。關(guān)問題的基礎(chǔ)。一、蛋白質(zhì)的水解一、蛋白質(zhì)的水解 一百多年前開始蛋白質(zhì)的化學(xué)研究，水解作用提供了蛋一百多年前開始蛋白質(zhì)的化學(xué)研究，水解作用提供了蛋白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的極有價(jià)值的資料。在水解過程中，蛋白質(zhì)白質(zhì)組成和結(jié)構(gòu)的

15、極有價(jià)值的資料。在水解過程中，蛋白質(zhì)逐漸降解成相對(duì)分子質(zhì)量越來越小的肽段（逐漸降解成相對(duì)分子質(zhì)量越來越小的肽段（peptide fragment）, 直到最后成為直到最后成為AA的混合物。的混合物。 完全水解：完全水解： 各種各種AA的混合物的混合物 不完全水解：不完全水解：AA + 肽段混合物肽段混合物1。酸水解。酸水解 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)AALhrSOMHorMHCl204642優(yōu)點(diǎn)：不引起消旋優(yōu)點(diǎn)：不引起消旋缺點(diǎn)：色氨酸破壞完全，含羥基氨基酸（絲、蘇）有一小部分缺點(diǎn)：色氨酸破壞完全，含羥基氨基酸（絲、蘇）有一小部分被分解，同時(shí)天冬酰胺、谷氨酰胺的酰胺基被水解下來。被分解，同時(shí)天冬酰胺、谷氨酰胺

16、的酰胺基被水解下來。2。堿水解。堿水解特點(diǎn)：產(chǎn)生消旋，但色氨酸穩(wěn)定特點(diǎn)：產(chǎn)生消旋，但色氨酸穩(wěn)定缺點(diǎn)：精氨酸脫氨產(chǎn)生鳥氨酸缺點(diǎn)：精氨酸脫氨產(chǎn)生鳥氨酸+尿素尿素3。酶水解。酶水解特點(diǎn)：不消旋，不破壞氨基酸；但一種酶水解不徹底，需幾種特點(diǎn)：不消旋，不破壞氨基酸；但一種酶水解不徹底，需幾種 酶長(zhǎng)時(shí)間共同作用，主要用于部分水解。酶長(zhǎng)時(shí)間共同作用，主要用于部分水解。AALDhrMNaOH)(20105 蛋白質(zhì)二、氨基酸的分類二、氨基酸的分類 從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有從各種生物體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸已有180多種，但是參與多種，但是參與蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨基酸只有蛋白質(zhì)組成的常見氨基酸或稱基本氨

17、基酸只有20種，成種，成為蛋白質(zhì)氨基酸。為蛋白質(zhì)氨基酸。1。脂肪族氨基酸。脂肪族氨基酸中性氨基酸中性氨基酸b. 含羥基或硫氨基酸含羥基或硫氨基酸c. 酸性氨基酸及其酰胺酸性氨基酸及其酰胺d. 堿性氨基酸堿性氨基酸2。芳香族氨基酸。芳香族氨基酸3。雜環(huán)族氨基酸。雜環(huán)族氨基酸4。非蛋白質(zhì)氨基酸。非蛋白質(zhì)氨基酸除了蛋白質(zhì)氨基酸以外，還在各種組織細(xì)胞中找到除了蛋白質(zhì)氨基酸以外，還在各種組織細(xì)胞中找到150多多種其它氨基酸。這些氨基酸大多是蛋白質(zhì)中存在的種其它氨基酸。這些氨基酸大多是蛋白質(zhì)中存在的L型型-氨基酸的衍生物。但是有一些是氨基酸的衍生物。但是有一些是-，-，或，或-氨基酸，氨基酸，并且有些是并

18、且有些是D型氨基酸。型氨基酸。l 掌握氨基酸的酸堿性質(zhì)是極其重要的，是掌握氨基酸的酸堿性質(zhì)是極其重要的，是了解蛋白質(zhì)的許多性質(zhì)的基礎(chǔ)，而氨基酸的分了解蛋白質(zhì)的許多性質(zhì)的基礎(chǔ)，而氨基酸的分析分離是測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成和序列的必析分離是測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成和序列的必要步驟。要步驟。l1。氨基酸的兼性離子形式。氨基酸的兼性離子形式AA晶體熔點(diǎn)很高，一般晶體熔點(diǎn)很高，一般200 例如：例如：CH3COOH mp 16. 5 NH2CH2COOH mp 232 密度大密度大 例如：例如： NH2CH2COOH = 1. 607 HOCH2CONH2 = 1. 390介電常數(shù)介電常數(shù) 水水 D=80

19、，加入乙醇，加入乙醇 D= 24 , 加入甲醇加入甲醇 D= 33 加入加入AA D=102-108電縮作用電縮作用 1mol Gly V=43. 5 ml , HOCH2CONH2 V=56. 2 ml 結(jié)論：結(jié)論：氨基酸是以離子晶格組成的，維持晶格質(zhì)點(diǎn)的作用氨基酸是以離子晶格組成的，維持晶格質(zhì)點(diǎn)的作用 力是強(qiáng)大的異性電荷之間的靜電引力，因此熔點(diǎn)高；介電力是強(qiáng)大的異性電荷之間的靜電引力，因此熔點(diǎn)高；介電常數(shù)與電解質(zhì)分子的極性結(jié)構(gòu)有關(guān)，極性分子的介電常數(shù)常數(shù)與電解質(zhì)分子的極性結(jié)構(gòu)有關(guān)，極性分子的介電常數(shù)高。同樣道理，氨基酸分子的密度大，電縮作用強(qiáng)。高。同樣道理，氨基酸分子的密度大，電縮作用強(qiáng)。

20、2。氨基酸的兩性解離和等電點(diǎn)。氨基酸的兩性解離和等電點(diǎn) 根據(jù)酸堿質(zhì)子理論，酸是質(zhì)子（根據(jù)酸堿質(zhì)子理論，酸是質(zhì)子（H+）的供體（）的供體（donor)，堿是質(zhì)子的受體或接納體（堿是質(zhì)子的受體或接納體（accepter）。酸堿的相互關(guān)系）。酸堿的相互關(guān)系如下：如下：HA H+ + A-酸酸 質(zhì)子質(zhì)子 堿堿 氨基酸在水中的偶極離子既起酸的作用：氨基酸在水中的偶極離子既起酸的作用：也起堿的作用：也起堿的作用：因此，是一類兩性電解質(zhì)。因此，是一類兩性電解質(zhì)。 氨基酸完全質(zhì)子化時(shí)，可以看成是多元酸，側(cè)鏈不氨基酸完全質(zhì)子化時(shí)，可以看成是多元酸，側(cè)鏈不解離的中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和堿性氨解離的中性

21、氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和堿性氨基酸可視為三元酸?，F(xiàn)以甘氨酸（基酸可視為三元酸。現(xiàn)以甘氨酸（Gly）為例，說明氨基）為例，說明氨基酸的解離情況。酸的解離情況。第一步解離：第一步解離：第二步解離：第二步解離： 氨基酸的解離常數(shù)（氨基酸的解離常數(shù)（Ka1, Ka2）可用測(cè)定滴定曲線的）可用測(cè)定滴定曲線的實(shí)驗(yàn)方法求得。滴定可以從甘氨酸溶液（等電甘氨酸）、實(shí)驗(yàn)方法求得。滴定可以從甘氨酸溶液（等電甘氨酸）、甘氨酸鹽酸鹽或甘氨酸鈉溶液開始。甘氨酸鹽酸鹽或甘氨酸鈉溶液開始。由于由于兩式相乘得：兩式相乘得： Ka1 Ka2 = H+2 A-/A+在等電點(diǎn)時(shí)，在等電點(diǎn)時(shí)， A- = A+ ，因此，因此，

22、H+ 2 = Ka1 Ka2 ， H+ = （ Ka1 Ka2 ）1/ 2如以如以I 代表等電點(diǎn)的氫離子濃度，即代表等電點(diǎn)的氫離子濃度，即 I = H+ ,則：則：pI = (pKa1+p Ka2 )3。氨基酸等電點(diǎn)的確定。氨基酸等電點(diǎn)的確定 從甘氨酸的解離公式或解離曲線可以看到，氨基從甘氨酸的解離公式或解離曲線可以看到，氨基酸的帶電狀況與溶液的酸的帶電狀況與溶液的pH值有關(guān)，改變值有關(guān)，改變pH可以使氨可以使氨基酸帶上正電荷或負(fù)電荷，也可以使它處于正負(fù)電荷基酸帶上正電荷或負(fù)電荷，也可以使它處于正負(fù)電荷數(shù)相等即靜電荷為零的兼性離子狀態(tài)。滴定曲線的拐數(shù)相等即靜電荷為零的兼性離子狀態(tài)。滴定曲線的拐

23、點(diǎn)就是甘氨酸處于靜電荷為零時(shí)的點(diǎn)就是甘氨酸處于靜電荷為零時(shí)的pH， 成為等電點(diǎn)成為等電點(diǎn) pI (isoelectric point)。在等電。在等電pH時(shí)，時(shí)， 氨基酸在電場(chǎng)中氨基酸在電場(chǎng)中既不向正極移動(dòng)，也不向負(fù)極移動(dòng)，即處于等電點(diǎn)兼既不向正極移動(dòng)，也不向負(fù)極移動(dòng)，即處于等電點(diǎn)兼性離子狀態(tài)。性離子狀態(tài)。氨基酸的解離常數(shù)和等電點(diǎn)氨基酸的解離常數(shù)和等電點(diǎn)對(duì)于對(duì)于R基不解離的中性基不解離的中性AA來說，來說， pI = (pKa1+pKa2 )對(duì)于對(duì)于R基參與解離的基參與解離的AA等電點(diǎn)計(jì)算。等電點(diǎn)計(jì)算。谷氨酸解離：谷氨酸解離：等電點(diǎn)時(shí)，谷氨酸主要以兼性離子（等電點(diǎn)時(shí)，谷氨酸主要以兼性離子（A0

24、）存在，）存在，A+和和A-很小而且相等，很小而且相等，A2-的量可以忽略不計(jì)，因此：的量可以忽略不計(jì)，因此：pIGlu = (pKa1+pKa2)=1/2(2.19 + 4.25)=3.22賴氨酸的解離情況是：賴氨酸的解離情況是：在這里在這里A2+ 極小，極小，A0是等電是等電pH時(shí)的主要形式，因此：時(shí)的主要形式，因此：pILys = (pKa2+pKa3)=1/2(8.95+10.53)=9.74例例1 ： 將含有將含有Asp (pI=2.98) 、Gly (pI=5.97) 、Thr (pI=6.53)、Leu( pI=5.98) 和和 Lys (pI=9.74)的的pH 3.0 檸檬酸

25、緩沖溶液，加到預(yù)先用同樣緩沖液檸檬酸緩沖溶液，加到預(yù)先用同樣緩沖液平衡過的陽離子交換樹脂中，隨后用該緩沖液洗平衡過的陽離子交換樹脂中，隨后用該緩沖液洗脫此柱，并分部地收集洗出液，這脫此柱，并分部地收集洗出液，這5 種氨基酸將種氨基酸將按什么次序洗脫下來？按什么次序洗脫下來？例例2： 向向1L 1 mol/L 的處于等電點(diǎn)的的處于等電點(diǎn)的Gly 溶液中加溶液中加入入 0.3mol HCl, 問所得溶液的問所得溶液的pH是多少？如果加是多少？如果加入入 0.3 mol NaOH代替代替HCl時(shí)，時(shí)，pH 將是多少？將是多少？作業(yè)：作業(yè)：p91-1，2，4l 氨基酸的化學(xué)反應(yīng)主要是指它的氨基酸的化學(xué)

26、反應(yīng)主要是指它的-氨基和氨基和-羧基羧基以及側(cè)鏈上的功能團(tuán)所參與的反應(yīng)。以及側(cè)鏈上的功能團(tuán)所參與的反應(yīng)。l1。 -氨基參與的反應(yīng)氨基參與的反應(yīng) （1） 與亞硝酸反應(yīng)與亞硝酸反應(yīng) 在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成的氮?dú)怏w積，即可計(jì)算出氨基在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成的氮?dú)怏w積，即可計(jì)算出氨基酸的量。可用于氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定。酸的量?？捎糜诎被岫亢偷鞍踪|(zhì)水解程度的測(cè)定。（2） 與?；噭┓磻?yīng)與酰化試劑反應(yīng) 氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時(shí)，氨基即被酰基化。例如：作用時(shí)，氨基即被?；?。例如： ?；噭┰诙嚯暮偷鞍踪|(zhì)的人工合成中被用酰化試劑在多肽和

27、蛋白質(zhì)的人工合成中被用作氨基的保護(hù)試劑。作氨基的保護(hù)試劑。（3） 烴基化反應(yīng)烴基化反應(yīng)桑格反應(yīng)桑格反應(yīng)a. 氨基酸氨基的一個(gè)氨基酸氨基的一個(gè)H原子可被烴基（及其原子可被烴基（及其衍生物）取代，如與衍生物）取代，如與2，4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB或或FDNB）發(fā)生親核芳環(huán)取代反應(yīng)生成二硝基苯基氨）發(fā)生親核芳環(huán)取代反應(yīng)生成二硝基苯基氨基酸（簡(jiǎn)稱基酸（簡(jiǎn)稱DNP氨基酸）。這個(gè)反應(yīng)首先被英國(guó)氨基酸）。這個(gè)反應(yīng)首先被英國(guó)的的Sanger用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)的用來鑒定多肽或蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸。末端氨基酸。b. Edman法（法（PITC）與苯異硫氰酸酯（與苯異硫氰酸酯（PITC）形成苯氨基

28、硫甲酰（）形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用生成苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物。這個(gè)反應(yīng)首先為）衍生物。這個(gè)反應(yīng)首先為Edman用于鑒定多肽用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的或蛋白質(zhì)的N-末端分析。末端分析。（4）形成西佛堿反應(yīng)）形成西佛堿反應(yīng)氨基酸的氨基酸的-氨基與醛反應(yīng)生成弱堿，即西佛堿。氨基與醛反應(yīng)生成弱堿，即西佛堿。-羧基參與的反應(yīng)羧基參與的反應(yīng)2. 氨基酸的氨基酸的-羧基和其它有機(jī)酸一樣，在一定條件下羧基和其它有機(jī)酸一樣，在一定條件下可以發(fā)生成鹽、成酯、成酰氯、成酰胺以及脫羧和疊可以發(fā)生成鹽、成酯、成酰氯、成酰胺以及脫羧和疊氮

29、化等反應(yīng)。氮化等反應(yīng)。（1）成鹽和成酯反應(yīng)）成鹽和成酯反應(yīng)當(dāng)氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯或鈉鹽后，羧基的化學(xué)反應(yīng)當(dāng)氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯或鈉鹽后，羧基的化學(xué)反應(yīng)性能即被掩蔽或者羧基被保護(hù)，而氨基的化學(xué)反應(yīng)性能得到性能即被掩蔽或者羧基被保護(hù)，而氨基的化學(xué)反應(yīng)性能得到加強(qiáng)或說氨基被活化，容易和?；驘N基結(jié)合。加強(qiáng)或說氨基被活化，容易和?；驘N基結(jié)合。（2）成酰氯反應(yīng)）成酰氯反應(yīng)氨基酸的氨基如被保護(hù)基保護(hù)，羧基可與二氯亞砜或五氯化氨基酸的氨基如被保護(hù)基保護(hù)，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，此反應(yīng)常用于多肽人工合成中。磷作用生成酰氯，此反應(yīng)常用于多肽人工合成中。（3）脫羧基反應(yīng)）脫羧基反應(yīng)在

30、生物體內(nèi)氨基酸經(jīng)氨基酸脫羧酶作用，放出在生物體內(nèi)氨基酸經(jīng)氨基酸脫羧酶作用，放出CO2并生并生成相應(yīng)的一級(jí)胺：成相應(yīng)的一級(jí)胺：（4）疊氮反應(yīng)）疊氮反應(yīng)-氨基和氨基和-羧基共同參與的反應(yīng)羧基共同參與的反應(yīng)（1）與茚三酮反應(yīng)）與茚三酮反應(yīng) 茚三酮在酸性溶液中與茚三酮在酸性溶液中與-氨基酸共熱，引起氨基酸氨基酸共熱，引起氨基酸氧化脫氨、脫羧反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)。利用茚三酮顯氧化脫氨、脫羧反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)。利用茚三酮顯色可以定性或定量測(cè)定各種氨基酸，從定量釋放的色可以定性或定量測(cè)定各種氨基酸，從定量釋放的CO2的量，可計(jì)算出參加反應(yīng)的氨基酸的量。的量，可計(jì)算出參加反應(yīng)的氨基酸的量。（2）成肽反應(yīng)）成肽反

31、應(yīng)一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱為肽鍵。肽，形成的鍵稱為肽鍵。3. 側(cè)鏈側(cè)鏈R基參與的反應(yīng)基參與的反應(yīng) 氨基酸側(cè)鏈具有功能團(tuán)時(shí)能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有些反氨基酸側(cè)鏈具有功能團(tuán)時(shí)能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，有些反應(yīng)是蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的基礎(chǔ)。應(yīng)是蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的基礎(chǔ)。五、氨基酸的分離分析五、氨基酸的分離分析紫外吸收光譜紫外吸收光譜有芳香族氨基酸有紫外吸收，有芳香族氨基酸有紫外吸收，Phe: =257nm Tyr : = 275 nm ; Trp: = 280 nm1. 2. 層析法層析法l 關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究工作已進(jìn)行了一百多年。關(guān)于蛋白質(zhì)

32、結(jié)構(gòu)的研究工作已進(jìn)行了一百多年。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜，研究工作比較緩慢，到由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜，研究工作比較緩慢，到1902年，德國(guó)化學(xué)家年，德國(guó)化學(xué)家Fisher提出了提出了“肽鏈學(xué)說肽鏈學(xué)說”，認(rèn)，認(rèn)為蛋白質(zhì)中的各種氨基酸是以肽鍵的方式形成一條肽為蛋白質(zhì)中的各種氨基酸是以肽鍵的方式形成一條肽鏈。鏈。l Fisher曾合成了一個(gè)由曾合成了一個(gè)由18個(gè)個(gè)-AA分子量為分子量為1213的的多肽，后來德國(guó)化學(xué)家阿布德爾哈頓由多肽，后來德國(guó)化學(xué)家阿布德爾哈頓由19個(gè)個(gè)AA組成的組成的分子量為分子量為1326的多肽，但都無活性。的多肽，但都無活性。l 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在公認(rèn)蛋白質(zhì)是由氨基隨著

33、科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在公認(rèn)蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的生物大分子，一般都有四級(jí)結(jié)構(gòu)，它的各級(jí)酸組成的生物大分子，一般都有四級(jí)結(jié)構(gòu)，它的各級(jí)結(jié)構(gòu)和它的分子大小、形狀、性質(zhì)、反應(yīng)和生物功能結(jié)構(gòu)和它的分子大小、形狀、性質(zhì)、反應(yīng)和生物功能等都有著密切的關(guān)系。等都有著密切的關(guān)系。l 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)有時(shí)也稱蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)有時(shí)也稱蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。1969年，國(guó)際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)（年，國(guó)際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)（IUPAC）就曾規(guī)）就曾規(guī)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)只指肽鏈中氨基酸順序。定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)只指肽鏈中氨基酸順序。l一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)l 肽鍵是一種酰胺鍵，肽鏈中的酰胺基（

34、肽鍵是一種酰胺鍵，肽鏈中的酰胺基（-CO-NH-）稱為肽單位。稱為肽單位。由于酰胺氮上的孤電子對(duì)離域與羰基碳軌道重疊，在酰由于酰胺氮上的孤電子對(duì)離域與羰基碳軌道重疊，在酰胺氮與羰基氧之間發(fā)生共振相互作用，使肽鍵具有部分胺氮與羰基氧之間發(fā)生共振相互作用，使肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，如圖：雙鍵性質(zhì)，如圖：二、肽段等電點(diǎn)的確定二、肽段等電點(diǎn)的確定其中凈電荷為零時(shí)的溶液其中凈電荷為零時(shí)的溶液pH就是該肽的等電點(diǎn)：就是該肽的等電點(diǎn)：pI=1/2（4.5+7.8）= 6.15例：三肽例：三肽Lys-Lys-Lys的的pI值必定大于它的任何一個(gè)個(gè)值必定大于它的任何一個(gè)個(gè)別基團(tuán)的別基團(tuán)的pKa值。這種說法是否正確

35、？為什么？值。這種說法是否正確？為什么？作業(yè)：作業(yè)：p92-5,9三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定三、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈中氨基酸的排列次序，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈中氨基酸的排列次序，即了解蛋白質(zhì)有多少種氨基酸，每種氨基酸的含量，即了解蛋白質(zhì)有多少種氨基酸，每種氨基酸的含量，這些氨基酸是怎樣連接成多肽鏈的。這些氨基酸是怎樣連接成多肽鏈的。 測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的，測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的，純度應(yīng)在純度應(yīng)在97%以上，同時(shí)必須知道分子量，其誤差允以上，同時(shí)必須知道分子量，其誤差允許在許在10%左右。左右。 蛋白質(zhì)的氨基酸順序主要是根據(jù)英國(guó)蛋白

36、質(zhì)的氨基酸順序主要是根據(jù)英國(guó)F.Sanger實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中發(fā)展起來的方法進(jìn)行測(cè)定的，這個(gè)方法首先應(yīng)用于室中發(fā)展起來的方法進(jìn)行測(cè)定的，這個(gè)方法首先應(yīng)用于胰島素的氨基酸順序測(cè)定并于胰島素的氨基酸順序測(cè)定并于1954年取得成功。年取得成功。1. 基本設(shè)計(jì)思想基本設(shè)計(jì)思想 氨基酸順序測(cè)定一般包括以下幾個(gè)步驟：氨基酸順序測(cè)定一般包括以下幾個(gè)步驟：（1）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。（2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈。（3）測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成，分析多肽鏈的）測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成，分析多肽鏈的N末端和末端和 C末端殘基。末端殘基。（4）斷裂多肽鏈內(nèi)的二

37、硫鍵。）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵。（5）多肽鏈斷成肽段，測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序，）多肽鏈斷成肽段，測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序， 確定肽段在多肽鏈中的次序。確定肽段在多肽鏈中的次序。（6）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。）確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。端基分析（端基分析（N末端和末端和C末端氨基酸殘基的確定）末端氨基酸殘基的確定）（1） N 末端分析末端分析a. DNFB法或法或FDNB法（法（2，4-二硝基氟苯法）二硝基氟苯法）NHO 2NNO2CH CORAA2-AA3-弱 堿 中后 酸 化FO 2NNO2+H2NCH CORAA2-AA3-6M HCl105 ,16hrNHO 2NNO2CH COR

38、O H + AA2 + AA3 + - 多肽或蛋白質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)的NH2末端與末端與Sanger試劑反應(yīng)后，生成試劑反應(yīng)后，生成DNP-多肽或多肽或DNP-蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)。由于DNFB與氨基形成的鍵對(duì)與氨基形成的鍵對(duì)水解的穩(wěn)定性遠(yuǎn)比肽鍵高，因此水解的穩(wěn)定性遠(yuǎn)比肽鍵高，因此DNP-多肽經(jīng)酸水解后，多肽經(jīng)酸水解后，只有只有N末端氨基酸為黃色末端氨基酸為黃色DNP-氨基酸衍生物，其余的都氨基酸衍生物，其余的都是游離氨基酸。只要鑒別所生成的是游離氨基酸。只要鑒別所生成的DNP-氨基酸，便可得氨基酸，便可得知多肽鏈的知多肽鏈的N末端殘基。待分析的末端殘基。待分析的DNP-氨基酸可用紙層氨基酸可用紙

39、層析、薄層層析或高效液相色譜進(jìn)行分離鑒定和定量測(cè)定。析、薄層層析或高效液相色譜進(jìn)行分離鑒定和定量測(cè)定。 多肽側(cè)鏈上的多肽側(cè)鏈上的-NH2、酚羥基等也能與、酚羥基等也能與DNFB反應(yīng)，反應(yīng)，但生成的側(cè)鏈取代但生成的側(cè)鏈取代DNP衍生物當(dāng)用有機(jī)溶劑提取時(shí)，只衍生物當(dāng)用有機(jī)溶劑提取時(shí)，只有有-DNP氨基酸溶于有機(jī)相。再與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶于有機(jī)相。再與標(biāo)準(zhǔn)-DNP氨基酸樣品氨基酸樣品進(jìn)行對(duì)照，即可得知進(jìn)行對(duì)照，即可得知N末端是哪一種氨基酸。末端是哪一種氨基酸。 Sanger就是用這種方法測(cè)得胰島素有兩個(gè)就是用這種方法測(cè)得胰島素有兩個(gè)N端基：端基：DNP-Gly，DNP-Phe，即有兩條肽鏈。，即有兩條肽鏈

40、。b. 丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）法）S O 2 C lNC H 3 C H 3+H2NCH CAA2-AA3-OR 1p H = 9 .5 -1 0 .5 3 7 1 h rNC H 3 C H 3S O 2 N H - CH CAA2-AA3-OR 16 M H C l, 1 0 5 , 2 0 h rNC H 3 C H 3S O 2 N H - CH COR 1-OH+ A A 2 + A A 3 + - 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡(jiǎn)稱，縮寫丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的簡(jiǎn)稱，縮寫為為DNS。此方法的原理與。此方法的原理與DNFB法相同，只是用法相同，只是用DNS代替代替DNF

41、B。由于丹磺酰基具有強(qiáng)烈的熒光，。由于丹磺?；哂袕?qiáng)烈的熒光，靈敏度比靈敏度比DNFB法高法高100倍，并且水解后的倍，并且水解后的DNS-氨氨基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。鑒定。C. 苯異硫氰酸酯法（苯異硫氰酸酯法（PITC法）法） 也稱也稱Edman化學(xué)降解法，是化學(xué)降解法，是1950年提出來的。年提出來的。降解反應(yīng)分三步進(jìn)行。降解反應(yīng)分三步進(jìn)行。第一步是偶聯(lián)反應(yīng)：第一步是偶聯(lián)反應(yīng)：第二步是環(huán)化斷裂反應(yīng)：第二步是環(huán)化斷裂反應(yīng)：第三步是轉(zhuǎn)化反應(yīng)：第三步是轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 所有所有PTH-氨基酸在紫外區(qū)都有強(qiáng)吸收，最大吸收值氨基酸在紫外

42、區(qū)都有強(qiáng)吸收，最大吸收值在在268nm處。處。PTH氨基酸可用各種層析技術(shù)分離。由于氨基酸可用各種層析技術(shù)分離。由于PITC法只切下法只切下N端基氨基酸殘基，剩下的減少了一個(gè)殘端基氨基酸殘基，剩下的減少了一個(gè)殘基的肽鏈便在它的基的肽鏈便在它的N端暴露出一個(gè)新的末端氨基，又可參端暴露出一個(gè)新的末端氨基，又可參加第二輪反應(yīng)。加第二輪反應(yīng)。 這樣每輪這樣每輪Edman反應(yīng)后，只要通過過濾即可回收剩反應(yīng)后，只要通過過濾即可回收剩余的肽鏈，以利于反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行。理論上講，進(jìn)行余的肽鏈，以利于反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行。理論上講，進(jìn)行n輪反輪反應(yīng)就能測(cè)出應(yīng)就能測(cè)出n個(gè)殘基的序列。（有報(bào)道一次測(cè)出個(gè)殘基的序列。（有報(bào)道一次

43、測(cè)出90-100個(gè)個(gè)殘基序列）殘基序列） Edman降解法測(cè)定順序操作程序復(fù)雜，工作量大。降解法測(cè)定順序操作程序復(fù)雜，工作量大。蛋白質(zhì)測(cè)序儀的出現(xiàn)滿足了蛋白質(zhì)微量序列的要求，該蛋白質(zhì)測(cè)序儀的出現(xiàn)滿足了蛋白質(zhì)微量序列的要求，該儀器靈敏度高，蛋白質(zhì)樣品的最低用量在儀器靈敏度高，蛋白質(zhì)樣品的最低用量在5皮摩爾水平。皮摩爾水平。氨肽酶法氨肽酶法 氨肽酶（氨肽酶（amino peptidase）是一類肽鏈外切）是一類肽鏈外切酶或叫外肽酶，它們能從多肽鏈的酶或叫外肽酶，它們能從多肽鏈的N末端逐個(gè)地向里末端逐個(gè)地向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基切。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基酸種

44、類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的N末端殘基順序。末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，它水解以最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，它水解以亮氨酸為亮氨酸為N末端的肽鍵速度為最大。末端的肽鍵速度為最大。（2）C 末端分析末端分析肼解法肼解法 它是目前測(cè)定它是目前測(cè)定C 末端殘基的最重要的化學(xué)方末端殘基的最重要的化學(xué)方法。法。a. 反應(yīng)中生成的氨基酸酰肼可用苯甲醛作用變?yōu)榉磻?yīng)中生成的氨基酸酰肼可用苯甲醛作用變?yōu)樗蝗苄缘亩交苌铩Ｉ锨逡褐械挠坞x水不溶性的二苯基衍生物。上清液中的游離C末端末端氨

45、基酸借助氨基酸借助FDNB法或法或DNS法以及層析技術(shù)進(jìn)行鑒法以及層析技術(shù)進(jìn)行鑒定。定。還原法還原法 肽鏈肽鏈C-末端氨基酸可用末端氨基酸可用LiBH4還原成相應(yīng)的還原成相應(yīng)的-氨基氨基醇。肽鏈完全水解后，代表原來醇。肽鏈完全水解后，代表原來C-末端氨基酸的末端氨基酸的-氨基氨基醇，可用層析法加以鑒定。醇，可用層析法加以鑒定。Sanger早期就是采用這早期就是采用這個(gè)方個(gè)方法鑒定胰島素法鑒定胰島素A、B鏈的鏈的C-末端殘基。末端殘基。羧肽酶法羧肽酶法 是目前所有測(cè)定是目前所有測(cè)定C-末端方法中最有效、最常用的末端方法中最有效、最常用的一一種。羧肽酶（種。羧肽酶（carboxypeptidase

46、）是一類肽鏈外切酶，）是一類肽鏈外切酶，它專一地從肽鏈的它專一地從肽鏈的C末端開始逐個(gè)降解，釋放出游末端開始逐個(gè)降解，釋放出游離氨離氨基酸。被釋放的氨基酸數(shù)目與種類隨反應(yīng)時(shí)間而變基酸。被釋放的氨基酸數(shù)目與種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化?；８鶕?jù)釋放的氨基酸量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，便可知道根據(jù)釋放的氨基酸量與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，便可知道該肽該肽鏈的鏈的C-末端氨基酸序列。末端氨基酸序列。目前常用的有目前常用的有4種羧肽酶：種羧肽酶：A、B、C及及Y，A和和B分別分別來自牛胰和豬胰，來自牛胰和豬胰，C得自得自柑橘葉，柑橘葉，Y取自面包酵母。取自面包酵母。羧肽酶羧肽酶A能釋放除能釋放除Pro,Arg和和Lys之外的所

47、有之外的所有C末端殘基，而羧肽酶末端殘基，而羧肽酶B只水解以只水解以堿性氨基酸堿性氨基酸Arg和和Lys為為C末端殘基的肽鍵。羧肽酶末端殘基的肽鍵。羧肽酶A和和B的混合物能釋放除的混合物能釋放除Pro以外的任一以外的任一C末端殘基。末端殘基。二硫橋的斷裂二硫橋的斷裂 由幾條多肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，有兩種情況：由幾條多肽鏈構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子，有兩種情況：一一種是幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵；另一種是幾條多肽鏈種是幾條多肽鏈借助非共價(jià)鍵；另一種是幾條多肽鏈通通過共價(jià)二硫鍵交聯(lián)在一起。過共價(jià)二硫鍵交聯(lián)在一起。 斷裂二硫橋的方法有很多種，歸結(jié)起來主要是斷裂二硫橋的方法有很多種，歸結(jié)起來主要是過甲過甲酸氧化法和

48、巰基化合物還原法。酸氧化法和巰基化合物還原法。（1）氧化法）氧化法（2）還原法）還原法變性劑：變性劑：8mol/L尿素或尿素或6mol/L鹽酸胍，使蛋白質(zhì)結(jié)鹽酸胍，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散而成無規(guī)則的構(gòu)象。胰島素經(jīng)巰基乙醇還原構(gòu)松散而成無規(guī)則的構(gòu)象。胰島素經(jīng)巰基乙醇還原和碘乙酸保護(hù)得到和碘乙酸保護(hù)得到A鏈和鏈和B鏈的羧甲基衍生物。鏈的羧甲基衍生物。酶裂解法酶裂解法 用于肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱蛋白酶已有十多用于肽鏈斷裂的蛋白水解酶或稱蛋白酶已有十多種，種，并且不斷有新的蛋白酶發(fā)現(xiàn)并投入使用。最常用的蛋并且不斷有新的蛋白酶發(fā)現(xiàn)并投入使用。最常用的蛋白白水解酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（也稱糜蛋白酶）、水解

49、酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（也稱糜蛋白酶）、噬熱菌蛋白酶、胃蛋白酶等，這些蛋白酶都是肽鏈內(nèi)噬熱菌蛋白酶、胃蛋白酶等，這些蛋白酶都是肽鏈內(nèi)切切酶或叫內(nèi)肽酶。酶或叫內(nèi)肽酶。（1）胰蛋白酶（）胰蛋白酶（trypsin）這是最常用的蛋白水解酶，專一性強(qiáng)，只斷裂這是最常用的蛋白水解酶，專一性強(qiáng)，只斷裂lys和和Arg殘基的羧基參與形成的肽鍵。用它斷裂多肽鏈得到的殘基的羧基參與形成的肽鍵。用它斷裂多肽鏈得到的是是以以Lys和和Arg為為C-末端殘基的肽段。產(chǎn)生的肽段數(shù)目末端殘基的肽段。產(chǎn)生的肽段數(shù)目等于等于多肽鏈中多肽鏈中Arg和和Lys總數(shù)加總數(shù)加1。 有時(shí)斷裂的多肽鏈中有時(shí)斷裂的多肽鏈中Lys和（或）

50、和（或）Arg殘基的數(shù)量殘基的數(shù)量較多，為了減少胰蛋白酶的作用位點(diǎn)，可以通過化學(xué)修較多，為了減少胰蛋白酶的作用位點(diǎn)，可以通過化學(xué)修飾將其側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)起來。飾將其側(cè)鏈基團(tuán)保護(hù)起來。例如用馬來酸酐減少例如用馬來酸酐減少Trypsin的作用位點(diǎn)：的作用位點(diǎn)：+NH3(CH2)4Lystrypsin+OOOpH=9(CH2)4LystrypsinNHCOCHCHCOO-pH=3.520hr+NH3(CH2)4Lystrypsin+OOO 如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點(diǎn)，可用如果想增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點(diǎn)，可用氮丙啶處理多肽鏈樣品，這時(shí)氮丙啶處理多肽鏈樣品，這時(shí)Cys殘基側(cè)鏈被修飾成殘基側(cè)鏈被修

51、飾成類似類似Lys的側(cè)鏈，也具有的側(cè)鏈，也具有-NH2。這樣，胰蛋白酶便。這樣，胰蛋白酶便能斷裂能斷裂Cys羧基側(cè)的肽鍵。羧基側(cè)的肽鍵。CH2SHCys+HNCH2CH2乙烯亞胺氮丙啶pH=8.5CH2S+NH3CH3CH2trypsinCH2H2CCH2CH2+NH3Lys等距（2）糜蛋白酶（）糜蛋白酶（chymotrypsin） 此酶的專一性不如胰蛋白酶，它斷裂此酶的專一性不如胰蛋白酶，它斷裂Phe、Trp和和Tyr等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近等疏水氨基酸的羧基參與形成的肽鍵。斷裂鍵鄰近的基團(tuán)是堿性的。裂解能力增加；是酸性的，裂解能的基團(tuán)是堿性的。裂解能力增加；是酸性的，裂

52、解能力將減弱。力將減弱。（3）噬熱菌蛋白酶（）噬熱菌蛋白酶（thermolysin） 它是一個(gè)含金屬鋅和鈣的蛋白酶。它是一個(gè)含金屬鋅和鈣的蛋白酶。Zn是酶活力必是酶活力必需的，鈣與酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)。此酶的專一性較差，需的，鈣與酶的熱穩(wěn)定性有關(guān)。此酶的專一性較差，常用于斷裂較短的多肽鏈或大肽段。常用于斷裂較短的多肽鏈或大肽段。（4）胃蛋白酶（）胃蛋白酶（pepsin）它的專一性與糜蛋白酶類似，但它要求被斷裂鍵兩側(cè)它的專一性與糜蛋白酶類似，但它要求被斷裂鍵兩側(cè)的殘基都是疏水性氨基酸。此外與酶蛋白酶不同的是的殘基都是疏水性氨基酸。此外與酶蛋白酶不同的是酶作用的最適酶作用的最適pH，前者是，前者是2后

53、者是后者是8-9。由于二硫鍵在。由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，因此斷定二硫鍵位置時(shí)，常用胃蛋酸性條件下穩(wěn)定，因此斷定二硫鍵位置時(shí)，常用胃蛋白酶來水解。白酶來水解。（5）木瓜蛋白酶（）木瓜蛋白酶（papain） 專一性差，斷裂位點(diǎn)與其附近的序列關(guān)系密切，專一性差，斷裂位點(diǎn)與其附近的序列關(guān)系密切，它對(duì)它對(duì)Arg和和Lys殘基的羧基端肽鍵敏感。木瓜蛋白酶在殘基的羧基端肽鍵敏感。木瓜蛋白酶在番木瓜果中很豐富，另一個(gè)類似的蛋白酶鳳梨中的菠番木瓜果中很豐富，另一個(gè)類似的蛋白酶鳳梨中的菠蘿蛋白酶。蘿蛋白酶。（6）葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶）葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶 是近年來發(fā)現(xiàn)的幾種高專一性肽鏈內(nèi)切酶，在蛋

54、是近年來發(fā)現(xiàn)的幾種高專一性肽鏈內(nèi)切酶，在蛋白質(zhì)序列測(cè)定中很有前途，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量比較大的白質(zhì)序列測(cè)定中很有前途，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量比較大的多肽鏈采用逐級(jí)專一性降解是相當(dāng)理想的。多肽鏈采用逐級(jí)專一性降解是相當(dāng)理想的。 葡萄球菌蛋白酶亦稱葡萄球菌蛋白酶亦稱Glu蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)蛋白酶，相對(duì)分子質(zhì)量為量為12000，當(dāng)在磷酸緩沖液（，當(dāng)在磷酸緩沖液（pH=7.8）進(jìn)行裂解）進(jìn)行裂解時(shí)，它能在時(shí)，它能在Glu殘基和殘基和Asp殘基的羧基端斷裂肽鍵。殘基的羧基端斷裂肽鍵。如果改用如果改用NH4HCO3緩沖液（緩沖液（pH7.8）或）或NH4Ac緩沖緩沖液（液（pH4.0）時(shí)，則只能斷裂谷氨酸殘基羧基端的）

55、時(shí)，則只能斷裂谷氨酸殘基羧基端的肽鍵。肽鍵。 梭菌蛋白酶或稱梭菌蛋白酶或稱Arg蛋白酶，它專門裂解蛋白酶，它專門裂解Arg殘殘基的羧基端肽鍵。即使在基的羧基端肽鍵。即使在6mol/L尿素中尿素中20hr內(nèi)仍具內(nèi)仍具活力，這樣對(duì)不溶性蛋白質(zhì)的長(zhǎng)時(shí)間裂解將是很有活力，這樣對(duì)不溶性蛋白質(zhì)的長(zhǎng)時(shí)間裂解將是很有效的。效的。二硫橋位置的確定二硫橋位置的確定 如果蛋白質(zhì)分子中存在鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵，則如果蛋白質(zhì)分子中存在鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵，則在完在完成多肽鏈的氨基酸序列時(shí)，首先需要把蛋白質(zhì)分子成多肽鏈的氨基酸序列時(shí)，首先需要把蛋白質(zhì)分子中的中的全部二硫鍵拆開。確定二硫鍵的位置一般采用胃蛋全部二硫鍵拆開。確定二硫

56、鍵的位置一般采用胃蛋白酶白酶水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。水解原來的含二硫鍵的蛋白質(zhì)。 胃蛋白酶的專一性比較低，切點(diǎn)多，生成的肽胃蛋白酶的專一性比較低，切點(diǎn)多，生成的肽段包段包括含有二硫橋的肽段都比較小，對(duì)后面的分離、鑒括含有二硫橋的肽段都比較小，對(duì)后面的分離、鑒定比定比較容易；胃蛋白酶作用的較容易；胃蛋白酶作用的pH是酸性范圍，有利于防是酸性范圍，有利于防止二止二硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)而造成的麻煩。所得肽段混合物硫鍵發(fā)生交換反應(yīng)而造成的麻煩。所得肽段混合物使用使用對(duì)角線電泳進(jìn)行分離。對(duì)角線電泳進(jìn)行分離。把水解后的混合肽段點(diǎn)到濾紙的中央，在把水解后的混合肽段點(diǎn)到濾紙的中央，在pH6.5的條件的條件下進(jìn)

57、行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離下進(jìn)行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來。濾紙暴露在過甲酸蒸汽中，使開來。濾紙暴露在過甲酸蒸汽中，使S-S鍵斷裂。濾紙鍵斷裂。濾紙旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)90角在與第一向完全角在與第一向完全相同的條件下進(jìn)行第二向電相同的條件下進(jìn)行第二向電泳。大多數(shù)肽段的遷移率未泳。大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對(duì)變，并將位于濾紙的一條對(duì)角線上，而含磺基丙氨酸的角線上，而含磺基丙氨酸的成對(duì)肽段比原來含二硫鍵的成對(duì)肽段比原來含二硫鍵的肽小而負(fù)電荷增加，結(jié)果它肽小而負(fù)電荷增加，結(jié)果它們都偏離了對(duì)角線。們都偏離了對(duì)角線。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)舉例蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)舉例（1）胰島

58、素）胰島素（2）核糖核酸酶）核糖核酸酶 五十年代末，美國(guó)學(xué)者五十年代末，美國(guó)學(xué)者Stanford Moore等人完成等人完成了牛胰核糖核酸酶的全順序分析。它是測(cè)出一級(jí)結(jié)構(gòu)了牛胰核糖核酸酶的全順序分析。它是測(cè)出一級(jí)結(jié)構(gòu)的第一個(gè)酶分子，由一條的第一個(gè)酶分子，由一條含含124個(gè)殘基的多肽鏈組個(gè)殘基的多肽鏈組成，分子內(nèi)含有成，分子內(nèi)含有4個(gè)鏈內(nèi)個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子量為二硫鍵，分子量為12600。（3）血紅蛋白）血紅蛋白 研究蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的另一個(gè)重大成就是血紅研究蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)的另一個(gè)重大成就是血紅蛋白（蛋白（h emoglobin）分子的全部一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。）分子的全部一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。血紅蛋白分子是一

59、個(gè)四聚體，它由四條稱珠蛋白的血紅蛋白分子是一個(gè)四聚體，它由四條稱珠蛋白的多肽鏈（亞基）借非共價(jià)鍵連接聚集而成，其中兩多肽鏈（亞基）借非共價(jià)鍵連接聚集而成，其中兩條條是相同的是相同的 鏈（鏈（141個(gè)殘基），另兩條是相同的個(gè)殘基），另兩條是相同的 鏈鏈（146個(gè)殘基）。鏈和鏈在許多位置上含有相同的個(gè)殘基）。鏈和鏈在許多位置上含有相同的 氨氨基酸殘基?；釟埢＠簩⒗簩?mmol五肽酸水解得到五肽酸水解得到2mmolGlu，1mmolLys，（1）該肽用）該肽用trypsin處理成兩個(gè)肽段。處理成兩個(gè)肽段。（2）以）以FDNB處理及酸水解得到處理及酸水解得到DNP-Glu。（3）該肽用糜蛋白酶

60、）該肽用糜蛋白酶 處理得到兩個(gè)肽段及游離處理得到兩個(gè)肽段及游離Glu。 試推測(cè)該五肽的試推測(cè)該五肽的AA順序。順序。解：解：a. 酸水解后得到三肽，丟失二肽：酸水解后得到三肽，丟失二肽：2Trp b. trypsin 處理后得兩個(gè)肽段：說明處理后得兩個(gè)肽段：說明Lys在第二或第在第二或第 三位。三位。 c. 得到得到DNP-Glu說明：說明：Glu在第一位。在第一位。 d. 用糜蛋白酶處理后說明：另一個(gè)用糜蛋白酶處理后說明：另一個(gè)Glu在第五位。在第五位。 e. 五肽順序：五肽順序：Glu-Trp-Lys-Trp-Glu例：今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是例：今有一個(gè)七肽，經(jīng)分析它的氨基酸組成是L