蛋白質(zhì)的測(cè)定使用凱氏定氮法解說

1、項(xiàng)目三項(xiàng)目三食品中蛋白質(zhì)測(cè)定食品中蛋白質(zhì)測(cè)定【學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)目標(biāo)】v1、掌握食品中氮含量與蛋白質(zhì)含量之間的換、掌握食品中氮含量與蛋白質(zhì)含量之間的換算。算。v2、掌握凱氏定氮裝置的搭建技術(shù)。、掌握凱氏定氮裝置的搭建技術(shù)。v3、掌握蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)。、掌握蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)?！净A(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)】v1、蛋白質(zhì)及氨基酸概述、蛋白質(zhì)及氨基酸概述v蛋白質(zhì)由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，蛋白質(zhì)由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是它主要含的元素是C、H、O、N。v一般來說，一般來說，pro的的平均含氮量為平均含氮量為16/100，既一份氮相當(dāng)于，既一份氮相當(dāng)于6.25份蛋白

2、質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。v所以在用凱氏定氮法定量所以在用凱氏定氮法定量pro時(shí)，將測(cè)得的總氮時(shí)，將測(cè)得的總氮%乘上乘上pro的的換算系數(shù)換算系數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的即為該物質(zhì)的pro含量。含量。v注意：注意：v含含N是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。v不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為為6.25，花生為，花生為5.46，大米為，大米為5.95，大豆及其制品為，大豆及其制品為5.71，小麥粉為，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、燕麥

3、、裸麥和小米是、全小麥、大麥、燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類為；硬果類為5.30；牛乳牛乳及其制品為及其制品為6.38。2、原理、原理v蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸硫酸和和硫酸銅硫酸銅、硫酸鉀硫酸鉀一同一同加熱消化加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸胺。然后酸胺。然后堿化蒸餾堿化蒸餾使氨游離，用使氨游離，用硼酸吸收硼酸吸收后以硫酸或后以硫酸或鹽酸鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。的含量。v氨基酸氨基酸HClNv注意注

4、意v此法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉此法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱為粗粗pro。結(jié)果處理滴定2HCLOB)NH（吸收BOH2NH蒸餾NaOHSO)(NH消化催化 劑SOH）2N樣品（7424333424423、適用范圍、適用范圍v國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法v適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定4、任務(wù)分解、任務(wù)分解v任務(wù)一：任務(wù)一：濕法消化濕法消化v任務(wù)二：任務(wù)二：堿法蒸餾堿法蒸餾v 硼酸吸收硼酸吸收v任務(wù)三：任務(wù)三：鹽酸滴定鹽酸滴定v任

5、務(wù)四：任務(wù)四：數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算任務(wù)一：濕法消化任務(wù)一：濕法消化v子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備v儀器：儀器：子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備試劑試劑作用作用硫酸銅硫酸銅a催化作用催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。：加速有機(jī)物的氧化分解。b消化完全的指示劑消化完全的指示劑：藍(lán)綠色，澄清，透明；：藍(lán)綠色，澄清，透明；c蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀色沉淀硫酸鉀硫酸鉀提高溶液沸點(diǎn)提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解，從而加快有機(jī)物分解 濃硫酸濃硫酸氧化作用氧化作用：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為：有機(jī)物質(zhì)氧化分解

6、為H2O和和CO2子任務(wù)子任務(wù)2：樣品預(yù)處理：樣品預(yù)處理固體試樣固體試樣 0.22g半固體試樣半固體試樣 25g液體試樣液體試樣 1025g樣品充分混勻樣品充分混勻直接消化直接消化子任務(wù)子任務(wù)3：樣品稱量、消化：樣品稱量、消化1.000g1.000g奶粉奶粉0.2g0.2g硫酸銅硫酸銅6g6g硫酸鉀硫酸鉀20mL20mL濃硫酸濃硫酸玻璃珠玻璃珠小火加熱炭化小火加熱炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止輕搖輕搖 大火加熱大火加熱保持瓶中液體微沸保持瓶中液體微沸至藍(lán)綠色澄清透明至藍(lán)綠色澄清透明繼續(xù)加熱繼續(xù)加熱0.51h冷卻冷卻加加20mL水水冷卻冷卻同時(shí)做試劑同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)空白試驗(yàn)思考思考v1 1、

7、玻璃珠的作用？、玻璃珠的作用？v2 2、小漏斗的作用？、小漏斗的作用？v3 3、消化過程為什么要不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏瓶？、消化過程為什么要不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏瓶？v4 4、開始消化時(shí)為什么用小火？、開始消化時(shí)為什么用小火？v5 5、消化液不易澄清透明時(shí)可采用的措施？、消化液不易澄清透明時(shí)可采用的措施？v6 6、消化完成時(shí)的產(chǎn)物？、消化完成時(shí)的產(chǎn)物？v7 7、加、加20mL20mL水的作用？水的作用？v8 8、空白試驗(yàn)的目的？、空白試驗(yàn)的目的？任務(wù)二：堿法蒸餾、硼酸吸收任務(wù)二：堿法蒸餾、硼酸吸收v子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備v儀器：儀器：10mL100mL 3只只子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑

8、的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備v水蒸氣發(fā)生器：水蒸氣發(fā)生器：v裝水至裝水至2/32/3處，加入數(shù)粒處，加入數(shù)粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基橙指示劑甲基橙指示劑數(shù)滴及數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)數(shù)mlml，使水呈微紅色，使水呈微紅色按上圖所示搭好按上圖所示搭好裝置裝置v注意注意v裝置搭建好了之后要先進(jìn)行撿漏，利用虹吸原理。裝置搭建好了之后要先進(jìn)行撿漏，利用虹吸原理。v在蒸汽發(fā)生瓶中要加在蒸汽發(fā)生瓶中要加甲基橙指示劑甲基橙指示劑數(shù)滴及數(shù)滴及硫酸硫酸數(shù)數(shù)mlml以使其以使其始終保持酸性，以防水中氨蒸出。始終保持酸性，以防水中氨蒸出。子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備v試劑：試劑：v40%40%氫氧化鈉氫氧

9、化鈉v20%20%硼酸溶液硼酸溶液v混合指示劑混合指示劑v1 1、1 1份份甲基紅乙醇溶液甲基紅乙醇溶液（1g/L1g/L）與）與5 5份份溴甲酚綠乙醇溴甲酚綠乙醇溶液溶液（1g/L1g/L）臨用時(shí)混合）臨用時(shí)混合 酒紅色酒紅色綠色綠色v2 2、2 2份份甲基紅乙醇溶液（甲基紅乙醇溶液（1g/L1g/L）與與1 1份份亞甲基藍(lán)乙醇亞甲基藍(lán)乙醇溶液溶液（1g/L1g/L）臨用時(shí)混合）臨用時(shí)混合 紫紅色紫紅色綠色綠色子任務(wù)子任務(wù)2：堿化蒸餾、硼酸吸收：堿化蒸餾、硼酸吸收v10.0mL10.0mL硼酸溶液硼酸溶液 100mL100mL三角瓶三角瓶 加加1 12 2滴混合指滴混合指示劑示劑 冷凝管下端

10、插入三角瓶液面下冷凝管下端插入三角瓶液面下 準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取10mL10mL試樣試樣 由小玻杯流入反應(yīng)室由小玻杯流入反應(yīng)室 少量水洗滌小少量水洗滌小漏斗漏斗 蓋緊玻璃塞蓋緊玻璃塞 量筒取量筒取10.0mLNaOH10.0mLNaOH溶液溶液 倒倒入小玻杯入小玻杯 提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室 立即立即塞緊玻璃塞塞緊玻璃塞 加水于小玻杯防漏氣加水于小玻杯防漏氣 通蒸汽通蒸汽 顏色變化時(shí)開始計(jì)時(shí)蒸餾顏色變化時(shí)開始計(jì)時(shí)蒸餾5min 5min 移動(dòng)接受瓶使液移動(dòng)接受瓶使液面離開冷凝管下端面離開冷凝管下端 再蒸餾再蒸餾1min 1min 用少量水沖洗用少量水沖洗冷凝管下端外部冷凝

11、管下端外部 取下接收瓶取下接收瓶 v注意v加入NaOH一定要過量，判斷NaOH是否過量的方法，看反應(yīng)室內(nèi)液體顏色v加堿加堿足量的判斷：足量的判斷：v溶液溶液會(huì)變成會(huì)變成深藍(lán)色深藍(lán)色或或產(chǎn)生黑色沉淀產(chǎn)生黑色沉淀v原理：原理：過量過量的氫氧化鈉會(huì)跟硫酸銅反應(yīng)生成的氫氧化鈉會(huì)跟硫酸銅反應(yīng)生成氫氧化氫氧化銅藍(lán)色沉淀銅藍(lán)色沉淀，藍(lán)色沉淀在加熱的情況下會(huì)分解成，藍(lán)色沉淀在加熱的情況下會(huì)分解成黑黑色的氧化銅沉淀色的氧化銅沉淀。v如果沒有上述現(xiàn)象，說明氫氧化鈉加的量不足，需如果沒有上述現(xiàn)象，說明氫氧化鈉加的量不足，需要繼續(xù)加入氫氧化納，直到產(chǎn)生上述現(xiàn)象為止。要繼續(xù)加入氫氧化納，直到產(chǎn)生上述現(xiàn)象為止。v樣液中的

12、樣液中的硫酸銨硫酸銨在堿性條件下釋放出在堿性條件下釋放出氨氨，為，為防止樣液防止樣液中氨氣逸出。中氨氣逸出。一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要水一是加入氫氧化鈉溶液要過量，二是要水封，三要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，四要在蒸餾過程封，三要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，四要在蒸餾過程中要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象中要注意接頭處有無松漏現(xiàn)象v加熱蒸餾出來的氨可以用加熱蒸餾出來的氨可以用硼酸進(jìn)行吸收硼酸進(jìn)行吸收，因?yàn)榕鹚嶂唬驗(yàn)榕鹚嶂怀饰⑷跛嵝?，不影響指示劑的變色反?yīng)，但是具有吸收呈微弱酸性，不影響指示劑的變色反應(yīng)，但是具有吸收氨的作用，與氨形成氨的作用，與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽強(qiáng)堿弱酸鹽 。v冷凝管下端先插入硼酸

13、吸收液液面以下才能蒸餾。吸冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。吸收液溫度不應(yīng)超過收液溫度不應(yīng)超過4040，避免氨氣逸出，避免氨氣逸出，若超過時(shí)可置若超過時(shí)可置于冷水浴中使用。于冷水浴中使用。v檢驗(yàn)蒸餾是否完成的方法：檢驗(yàn)蒸餾是否完成的方法：奈氏試紙法奈氏試紙法。原理原理:NH4+或或NH3遇奈氏試劑會(huì)反應(yīng)生成綜紅色的碘化汞銨化合物，如遇奈氏試劑會(huì)反應(yīng)生成綜紅色的碘化汞銨化合物，如NH4+或或NH3含量較少，試紙呈黃色，若含量過多，呈棕黃含量較少，試紙呈黃色，若含量過多，呈棕黃色或棕紅色的沉淀反應(yīng)色或棕紅色的沉淀反應(yīng)v在蒸餾時(shí)，在蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過程中不

14、得?；饠?，蒸餾過程中不得停火斷汽汽, ,否則會(huì)發(fā)生否則會(huì)發(fā)生倒吸倒吸。v蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，再蒸蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，再蒸1 1分鐘，分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸倒吸。v所用的試劑溶液所用的試劑溶液 必須用必須用無氨蒸餾水無氨蒸餾水配制。配制。任務(wù)三：鹽酸滴定任務(wù)三：鹽酸滴定v子任務(wù)子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備：儀器及試劑的準(zhǔn)備v儀器：儀器：v25mL25mL酸式滴定管酸式滴定管

15、1 1套套v試劑試劑v0.0500mol/L HCL0.0500mol/L HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液子任務(wù)子任務(wù)2：鹽酸滴定：鹽酸滴定v接收瓶接收瓶 以以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定 灰色終點(diǎn)灰色終點(diǎn) 記錄記錄VHcl（1 1）硼酸吸收）硼酸吸收液的顏色液的顏色（2 2）吸收氨氣）吸收氨氣后的硼酸吸收液后的硼酸吸收液的顏色的顏色（3 3）鹽酸滴定）鹽酸滴定終點(diǎn)的顏色終點(diǎn)的顏色v注意注意v混合指示劑在混合指示劑在堿性溶液中呈堿性溶液中呈綠色綠色, ,在在中性溶液中性溶液中中呈呈灰色灰色, ,在在酸性溶液酸性溶液中呈中呈紅色紅色。v酸式滴定管的正確使用酸式滴定管的正確使用項(xiàng)目名稱項(xiàng)目名稱檢測(cè)日

16、期檢測(cè)日期樣品名稱樣品名稱檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)依據(jù)內(nèi)容內(nèi)容1 12 23 3 空白空白樣品質(zhì)量樣品質(zhì)量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V終終 / / mLmL消耗的體積消耗的體積V V1 1 / /mLmL吸取消化液體積吸取消化液體積V V3 3 /mL/mL蛋白質(zhì)含量（蛋白質(zhì)含量（g/100gg/100g）平均值（平均值（g/100gg/100g）兩次測(cè)定之差兩次測(cè)定之差/ /平均值平均值精密度精密度CyCy （g/100gg/100g） F F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.386.38任務(wù)四、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算任務(wù)四、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算v有效數(shù)字：有效數(shù)字：v蛋白

17、質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留時(shí)，結(jié)果保留三位三位有效數(shù)字有效數(shù)字v蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量1 g/100 g時(shí)，結(jié)果保留時(shí)，結(jié)果保留兩位兩位有效數(shù)字。有效數(shù)字。v精密度：精密度：v在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的得超過算術(shù)平均值的10%（g/100g）小結(jié)小結(jié)步驟步驟反應(yīng)前后顏色變化反應(yīng)前后顏色變化濕法消化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）凱氏燒瓶：樣品無色（加硫酸前）加加硫酸炭化黑色硫酸炭化黑色消化后紅棕色消化后紅棕色 棕褐棕褐色色消化終點(diǎn)藍(lán)綠色消化終點(diǎn)藍(lán)綠色/ /墨綠色墨綠色淡藍(lán)色淡藍(lán)色（冷卻后溶液

18、）（冷卻后溶液）堿化蒸餾堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫紅色紫紅色綠色綠色鹽酸滴定鹽酸滴定甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色灰色灰色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色藍(lán)紫色藍(lán)紫色v凱氏定氮法用于所有動(dòng)物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的測(cè)凱氏定氮法用于所有動(dòng)物、植物類食品的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測(cè)定結(jié)果為含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測(cè)定結(jié)果為粗蛋白粗蛋白質(zhì)含量。質(zhì)含量。v若要測(cè)定

19、樣品的蛋白氮若要測(cè)定樣品的蛋白氮, ,則需要向樣品中加入則需要向樣品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶液溶液, ,使其最終濃度為使其最終濃度為5%,5%,然后測(cè)定未加入三氯乙酸的樣品及加入然后測(cè)定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量, ,進(jìn)一步計(jì)算出蛋白質(zhì)含量進(jìn)一步計(jì)算出蛋白質(zhì)含量: : 蛋白氮蛋白氮= =總氮總氮- -非蛋白氮非蛋白氮任務(wù)五：試驗(yàn)器具的清洗整理任務(wù)五：試驗(yàn)器具的清洗整理【拓展學(xué)習(xí)【拓展學(xué)習(xí)】v1、其他蛋白質(zhì)測(cè)定方法、其他蛋白質(zhì)測(cè)定方法分光光度法分光光度法v（1）原理）原理v食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與食品中的蛋白質(zhì)在

20、催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸結(jié)合生成硫酸銨硫酸銨，在，在pH 4.8 pH 4.8 的的乙酸鈉乙酸鈉- -乙酸乙酸緩沖溶液中緩沖溶液中與與乙酰丙酮乙酰丙酮和和甲醛甲醛反應(yīng)生成反應(yīng)生成黃色黃色的的3,5-3,5-二乙酰二乙酰-2,6-2,6-二甲基二甲基- -1,4-1,4-二氫化二氫化吡啶化合物吡啶化合物。在波長(zhǎng)。在波長(zhǎng)400nm400nm下測(cè)定吸光度值，與下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。，即為蛋白質(zhì)含量。v（2）特點(diǎn)）特點(diǎn)v快速、污染少、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)快速、污染少、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)v 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)第二法第二法v2、改良式凱氏裝置、改良式凱氏裝置江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院泰州市質(zhì)監(jiān)局泰州市質(zhì)監(jiān)局v3、自動(dòng)凱氏定氮法、自動(dòng)凱氏定氮法1.1.原理原理 同常量凱氏定氮法同常量凱氏定氮法2.2.主要儀器主要儀器 自動(dòng)凱氏定氮儀：