酶工程第二節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)制

1、 第二節(jié)第二節(jié) 酶的催化機(jī)制酶的催化機(jī)制 問題：酶何以具有高催化活性？問題：酶何以具有高催化活性？ 為什么會(huì)有高度專一性？為什么會(huì)有高度專一性？ 近年來，有關(guān)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展近年來，有關(guān)酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展 很快，成為現(xiàn)代酶學(xué)與酶工程的一個(gè)重要很快，成為現(xiàn)代酶學(xué)與酶工程的一個(gè)重要 組成部分，也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要內(nèi)容；組成部分，也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的主要內(nèi)容； 酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了酶的空間構(gòu)象，酶蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了酶的空間構(gòu)象， 而酶所具有的特定空間構(gòu)象又是酶功能表而酶所具有的特定空間構(gòu)象又是酶功能表 達(dá)的基礎(chǔ)達(dá)的基礎(chǔ)決定了酶的高效、專一催化決定了酶的高效、專一催化 化學(xué)反

2、應(yīng)的能力化學(xué)反應(yīng)的能力 實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象： 在在8mol/L尿素存在尿素存在下，用巰基乙醇處理天然下，用巰基乙醇處理天然RNase,其二硫鍵全部斷其二硫鍵全部斷裂，肽鏈松散，活性全部裂，肽鏈松散，活性全部喪失，但當(dāng)用透析法除去喪失，但當(dāng)用透析法除去尿素、巰基乙醇后，尿素、巰基乙醇后，RNase活力全部恢復(fù)，而活力全部恢復(fù)，而且復(fù)原后產(chǎn)物其物化性質(zhì)且復(fù)原后產(chǎn)物其物化性質(zhì)與天然與天然RNase完全相同；完全相同；然而在隨機(jī)情況下，然而在隨機(jī)情況下，8個(gè)個(gè)HS形成形成4個(gè)個(gè)SS時(shí)，時(shí)，應(yīng)有應(yīng)有105種不同方式，但種不同方式，但在復(fù)原過程中，走向隨機(jī)在復(fù)原過程中，走向隨機(jī)的的RNase肽鏈卻只選擇了

3、肽鏈卻只選擇了其中一種方式（即與天然其中一種方式（即與天然構(gòu)象完全相同）構(gòu)象完全相同）. 一、酶分子的組成一、酶分子的組成酶按組成分類酶按組成分類單純酶：不需輔酶，除蛋白質(zhì)不含其他成分單純酶：不需輔酶，除蛋白質(zhì)不含其他成分 如水解酶類的胃蛋白酶、核酸酶、脲酶等如水解酶類的胃蛋白酶、核酸酶、脲酶等 結(jié)合酶結(jié)合酶（全酶）（全酶）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)非蛋白部分非蛋白部分金屬離子：金屬離子： 如羧肽酶含如羧肽酶含Zn2+小分子物質(zhì)：轉(zhuǎn)氨酶含磷酸吡哆醛小分子物質(zhì)：轉(zhuǎn)氨酶含磷酸吡哆醛 糖蛋白：凝血酶蛋白糖蛋白：凝血酶蛋白R(shí)NA ： RNase P含含RNA等等 1926 1926年年SumnerSumner首次提

4、出酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)首次提出酶的蛋白質(zhì)本質(zhì) 30 30年代，年代，NorthropsNorthrops得到了胃蛋白酶、胰蛋得到了胃蛋白酶、胰蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并從動(dòng)力學(xué)白酶、胰凝乳蛋白酶的結(jié)晶，并從動(dòng)力學(xué) 性質(zhì)證明了它們是蛋白質(zhì)性質(zhì)證明了它們是蛋白質(zhì) 酶是高分子膠體物質(zhì)、兩性電解質(zhì)，在電場(chǎng)酶是高分子膠體物質(zhì)、兩性電解質(zhì)，在電場(chǎng) 中如蛋白質(zhì)一樣泳動(dòng)中如蛋白質(zhì)一樣泳動(dòng); 導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素如溫度、導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的因素如溫度、pH、紫外線、紫外線、 表面活性劑、重金屬等往往也能使酶變性表面活性劑、重金屬等往往也能使酶變性; 酶能被蛋白酶水解而失活酶能被蛋白酶水解而失活; （一）、（一）、酶

5、是蛋白質(zhì)酶是蛋白質(zhì)n1969年，Gutte Merrifield由氨基酸人工合成了具有催化活性的Rnase,進(jìn)一步證實(shí)了酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)（protein，簡(jiǎn)寫，簡(jiǎn)寫pro) 是由是由20種種L- 氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具較穩(wěn)定構(gòu)象并具一定生物功能（肽鍵）縮合而成的，具較穩(wěn)定構(gòu)象并具一定生物功能的生物大分子。的生物大分子。 一級(jí)結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu)血紅蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu) 纖維狀蛋白分子：纖維狀蛋白分子：種類種類:角蛋白、膠原角蛋白、膠原蛋白、血纖維蛋蛋白、血纖維蛋白、肌纖維蛋白。白、肌纖維蛋白。功能功能:在生物體

6、內(nèi)保在生物體內(nèi)保護(hù)、支持、結(jié)締護(hù)、支持、結(jié)締功能。功能。四、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)四、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)膠原蛋白膠原蛋白 球蛋白分子：球蛋白分子： 種類：血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白、球蛋白、酶種類：血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白、球蛋白、酶蛋白、激素蛋白、抗體等。蛋白、激素蛋白、抗體等。 具有酶活性的蛋白質(zhì)都是球蛋白具有酶活性的蛋白質(zhì)都是球蛋白 在酶蛋白分子表面，有一內(nèi)陷的空穴，此空穴往往是疏在酶蛋白分子表面，有一內(nèi)陷的空穴，此空穴往往是疏 水區(qū)，此空穴正好容納一個(gè)或多個(gè)小分子底物或大分水區(qū)，此空穴正好容納一個(gè)或多個(gè)小分子底物或大分 子底物的一部分子底物的一部分此即此即酶活性部位。酶活性部位。 有些酶蛋白具有四級(jí)

7、結(jié)構(gòu)，這類球蛋白的分子中含兩條或有些酶蛋白具有四級(jí)結(jié)構(gòu)，這類球蛋白的分子中含兩條或 更多條肽鏈，他們彼此以非共價(jià)鍵相連，每一條肽鏈都有更多條肽鏈，他們彼此以非共價(jià)鍵相連，每一條肽鏈都有 自己的二自己的二 、三級(jí)結(jié)構(gòu)，此多肽鏈即為蛋白質(zhì)分子的亞單位、三級(jí)結(jié)構(gòu)，此多肽鏈即為蛋白質(zhì)分子的亞單位 （亞基），亞基一般由一條多肽鏈組成，也有的有幾條多（亞基），亞基一般由一條多肽鏈組成，也有的有幾條多 肽鏈由二硫鍵相連而成。肽鏈由二硫鍵相連而成。 （二）、（二）、酶的活性部位酶的活性部位 問題：?jiǎn)栴}：酶是生物大分子物質(zhì)，分子量都在酶是生物大分子物質(zhì)，分子量都在1000010000以上，每個(gè)酶分子至少由以上，

8、每個(gè)酶分子至少由100100個(gè)以上氨基酸個(gè)以上氨基酸連接而成，而酶的作用底物多為有機(jī)小分子?？蛇B接而成，而酶的作用底物多為有機(jī)小分子?？梢韵胂?，只有少數(shù)一些氨基酸殘基和催化活力有以想象，只有少數(shù)一些氨基酸殘基和催化活力有關(guān)。后來證實(shí)這些特異的氨基酸殘基組成了酶的關(guān)。后來證實(shí)這些特異的氨基酸殘基組成了酶的活性中心?；钚灾行?。 經(jīng)分析證明，經(jīng)分析證明， DFPDFP與胰凝乳蛋白酶的與胰凝乳蛋白酶的Ser-195 Ser-195 的羥基反的羥基反應(yīng)。應(yīng)。Ser-195Ser-195在酶分子中處于特殊位置在酶分子中處于特殊位置, ,具有非常高的活具有非常高的活性，在催化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。性，在催化反

9、應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。( (C CH H3 3) )2 2C CH HO OP P O OO OF F+ +E EO OH H E E O O P PO OO OC CH H( (C CH H3 3) )2 2O OC CH H( (C CH H3 3) )2 2+ + H HF F( (C CH H3 3) )2 2C CH H許多絲氨酸蛋白水解酶都和其不可逆抑制劑許多絲氨酸蛋白水解酶都和其不可逆抑制劑DFP(DFP(二異丙基氟磷酸二異丙基氟磷酸) )化學(xué)計(jì)量反應(yīng)而失活：化學(xué)計(jì)量反應(yīng)而失活：令令DFPDFP與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)：與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)：1 1、酶活性中心存在的實(shí)驗(yàn)證據(jù)、酶活性中心存在的

10、實(shí)驗(yàn)證據(jù)（1 1）、從抑制劑的作用推測(cè)）、從抑制劑的作用推測(cè) （2 2）、從酶與底物的作用推測(cè)）、從酶與底物的作用推測(cè) 令胰凝乳蛋白酶作用于對(duì)硝基苯酚乙酸酯：令胰凝乳蛋白酶作用于對(duì)硝基苯酚乙酸酯： EXH + CH3C O0NO2NO2+X EHOCOCH3EXH + HOOCCH3H2O O CH3 C Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu 中間物用同位素標(biāo)記，然后水解，得含標(biāo)中間物用同位素標(biāo)記，然后水解，得含標(biāo)記的乙?；亩?，其序列與記的乙?；亩危湫蛄信cDFPDFP抑制劑的抑制劑的SerSer殘殘基周圍的氨基酸序列一致。所以可以推測(cè)，基周圍的氨基酸序列一致。所以可以推

11、測(cè)，DFPDFP抑制的部位是酶催化的中抑制的部位是酶催化的中“關(guān)鍵關(guān)鍵”部位。部位。2 2、活性部位的研究方法、活性部位的研究方法n化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法n動(dòng)力學(xué)分析法動(dòng)力學(xué)分析法n光譜法光譜法nX X線晶體衍射法線晶體衍射法 化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法 酶分子中可修飾基團(tuán)：羥基、酶分子中可修飾基團(tuán)：羥基、 -HS-HS基、氨基、基、氨基、 羧基、咪銼基等，可用于化學(xué)修飾的基團(tuán)也不羧基、咪銼基等，可用于化學(xué)修飾的基團(tuán)也不 少。少。 （1 1）、）、使用非特異試劑對(duì)特殊基團(tuán)的標(biāo)記；使用非特異試劑對(duì)特殊基團(tuán)的標(biāo)記； 非特異性試劑：非特異性試劑：不能區(qū)分活性部位內(nèi)和活性部不能區(qū)分活性部位內(nèi)和活性部 位外基團(tuán)

12、的試劑。位外基團(tuán)的試劑。 特殊基團(tuán)特殊基團(tuán): :某些酶的活性部位含有活性部位以某些酶的活性部位含有活性部位以 外沒有的氨基酸殘基，如（外沒有的氨基酸殘基，如（-HS-HS基）?；?。 例如：木瓜蛋白酶中有例如：木瓜蛋白酶中有7 7個(gè)半胱氨酸殘基，其中的個(gè)半胱氨酸殘基，其中的6 6個(gè)個(gè)形成三對(duì)二硫橋，只有一個(gè)殘基以自由巰基形式存在于形成三對(duì)二硫橋，只有一個(gè)殘基以自由巰基形式存在于活性部位，這時(shí)就可以用任何一種巰基試劑來標(biāo)記（如活性部位，這時(shí)就可以用任何一種巰基試劑來標(biāo)記（如碘乙酸）得到巰基修飾與活力喪失相平行的結(jié)果。碘乙酸）得到巰基修飾與活力喪失相平行的結(jié)果。 若是若是非特殊基團(tuán)非特殊基團(tuán)，要充

13、分利用活性部位中某一基團(tuán)，要充分利用活性部位中某一基團(tuán)具有特別高的反應(yīng)性的有利條件進(jìn)行化學(xué)修飾。（如胰具有特別高的反應(yīng)性的有利條件進(jìn)行化學(xué)修飾。（如胰凝乳蛋白酶的凝乳蛋白酶的Ser-195Ser-195與與DFPDFP的作用）的作用） （2 2）、）、差示標(biāo)記差示標(biāo)記是非特異性試劑標(biāo)記的一個(gè)發(fā)展，要求被是非特異性試劑標(biāo)記的一個(gè)發(fā)展，要求被標(biāo)記的活性部位基團(tuán)有特殊靈敏的反應(yīng)性。標(biāo)記的活性部位基團(tuán)有特殊靈敏的反應(yīng)性。 + +RRR(a)+ +PP+RRP-PR+R*RR*(b)（3 3）、）、親和標(biāo)記親和標(biāo)記 主要利用酶和底物特異結(jié)合的性質(zhì)主要利用酶和底物特異結(jié)合的性質(zhì) 設(shè)計(jì)標(biāo)記試劑。設(shè)計(jì)標(biāo)記試劑

14、。+x-y 2 2、動(dòng)力學(xué)分析法、動(dòng)力學(xué)分析法 酶蛋白是帶有許多解離基團(tuán)的兩性蛋白質(zhì)，酶蛋白是帶有許多解離基團(tuán)的兩性蛋白質(zhì)，pH pH 改變必然影響解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，改變必然影響解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，處于活處于活性部位的解離基團(tuán)的解離狀態(tài)的改變會(huì)直接關(guān)性部位的解離基團(tuán)的解離狀態(tài)的改變會(huì)直接關(guān)系到酶的催化活性。系到酶的催化活性。例如：通過例如：通過pHpH- -酶催化活力關(guān)系的研究，可能得到酶催化活力關(guān)系的研究，可能得到 與催化直接相關(guān)的某些基團(tuán)的與催化直接相關(guān)的某些基團(tuán)的pKpK值；值； 通過在不通過在不同溫度條件下測(cè)定同溫度條件下測(cè)定V V與與pHpH的關(guān)系，可求得有關(guān)基的關(guān)系，可求得有關(guān)基

15、團(tuán)的解離熱團(tuán)的解離熱H H，H H的測(cè)定有助于補(bǔ)充的測(cè)定有助于補(bǔ)充pKpK值對(duì)值對(duì)活性部位性質(zhì)的判斷。進(jìn)而推斷此基團(tuán)的本質(zhì)活性部位性質(zhì)的判斷。進(jìn)而推斷此基團(tuán)的本質(zhì)。 3 3、光譜法、光譜法 依據(jù)是酶蛋白分子中含有生色基團(tuán)，依據(jù)是酶蛋白分子中含有生色基團(tuán)，也可以用化學(xué)方法引入生色基團(tuán)。也可以用化學(xué)方法引入生色基團(tuán)。 4 4、X X線衍射法線衍射法 以上方法所得結(jié)果還是較零碎和間接的，以上方法所得結(jié)果還是較零碎和間接的，只能推斷出構(gòu)成活性部位的氨基酸殘基，而只能推斷出構(gòu)成活性部位的氨基酸殘基，而X X線衍射還能了解到這些基團(tuán)的相對(duì)位置與實(shí)際線衍射還能了解到這些基團(tuán)的相對(duì)位置與實(shí)際狀態(tài)。狀態(tài)。 X

16、X線衍射法最令人信服，但單靠一種方法往往線衍射法最令人信服，但單靠一種方法往往不能解決問題，需幾種方法證明后才能確定。不能解決問題，需幾種方法證明后才能確定。 3 3、酶活性中心的概念、酶活性中心的概念 酶與其他蛋白質(zhì)的不同之處在于，酶分子酶與其他蛋白質(zhì)的不同之處在于，酶分子在一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過二三級(jí)折疊盤繞在一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過二三級(jí)折疊盤繞, ,形成了形成了各自特定的具有催化功能的活性構(gòu)像區(qū)域，酶各自特定的具有催化功能的活性構(gòu)像區(qū)域，酶分子不是以整個(gè)分子，而是在這個(gè)區(qū)域內(nèi)參與分子不是以整個(gè)分子，而是在這個(gè)區(qū)域內(nèi)參與和底物結(jié)合并對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)。和底物結(jié)合并對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)。 前列腺素H2

17、合成酶活性中心活性中心的本質(zhì)活性中心的本質(zhì)n活性中心是酶分活性中心是酶分子中與子中與催化功能催化功能直接有關(guān)直接有關(guān)并在并在三三維結(jié)構(gòu)上相互靠維結(jié)構(gòu)上相互靠近近的的少數(shù)幾個(gè)少數(shù)幾個(gè)aa殘基或其上的某殘基或其上的某些基團(tuán)些基團(tuán)按照特定按照特定立體構(gòu)象立體構(gòu)象組成的組成的活性結(jié)構(gòu)區(qū)域活性結(jié)構(gòu)區(qū)域.（是與底物結(jié)合并催化（是與底物結(jié)合并催化反應(yīng)的場(chǎng)所）反應(yīng)的場(chǎng)所）溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心活性中心的特點(diǎn)：活性中心的特點(diǎn)：n僅為酶分子的少數(shù)僅為酶分子的少數(shù)幾個(gè)殘基由于肽鏈幾個(gè)殘基由于肽鏈的盤繞折疊而成；的盤繞折疊而成；n是由特定空間構(gòu)象是由特定空間構(gòu)象維持的一個(gè)裂隙；維持的一個(gè)裂隙；n活性中心以外

18、的部活性中心以外的部分對(duì)活性中心形成分對(duì)活性中心形成提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。 羧肽酶活性中心羧肽酶活性中心 活性中心包括催化部位和底物結(jié)合部位活性中心包括催化部位和底物結(jié)合部位n催化部位：在催化反應(yīng)中直接參與電子催化部位：在催化反應(yīng)中直接參與電子授受關(guān)系的部位，直接參與催化，底物授受關(guān)系的部位，直接參與催化，底物敏感鍵在此被切斷或形成新鍵，并形成敏感鍵在此被切斷或形成新鍵，并形成底物。底物。n底物結(jié)合部位：指與底物特異結(jié)合的有底物結(jié)合部位：指與底物特異結(jié)合的有關(guān)部位，也叫特異性決定部位。關(guān)部位，也叫特異性決定部位。 溶菌酶與溶菌酶與(NAG)(NAG)6 6 的結(jié)合方式的結(jié)合方式返回 酶酶

19、活性中心上的基團(tuán)活性中心上的基團(tuán) 胰蛋白酶Ser-183,His-46枯草桿菌蛋白酶Ser,His,pK8-7的基團(tuán)木瓜蛋白酶CysCys,His,羧基乳酸脫氫酶Cys,His,TyrG6P脫氫酶(酵母)Lys,His,Tyr蘋果酸脫氫酶Tyr核糖核酸酶His12,119,Lys7,Asp121葡萄糖磷酸變位酶一個(gè)氨基一些酶活性中心的基團(tuán)一些酶活性中心的基團(tuán) 實(shí)驗(yàn)表明：實(shí)驗(yàn)表明： 活性中心上有活性中心上有7 7種氨基酸的頻率最高，分別是：種氨基酸的頻率最高，分別是： Ser,His,Cys,Tyr,Asp,Glu,Lys 同類酶活性中心一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸順序十分相似；同類酶活性中心一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基

20、酸順序十分相似； 催化各類反應(yīng)的酶，其活性中心的基團(tuán)常有一定的特征；催化各類反應(yīng)的酶，其活性中心的基團(tuán)常有一定的特征； 如：蛋白酶如：蛋白酶-絲氨酸、組氨酸（絲氨酸、組氨酸（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶） 半胱氨酸（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶）半胱氨酸（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶） 脫氫酶脫氫酶-絡(luò)氨酸（蘋果酸脫氫酶等）絡(luò)氨酸（蘋果酸脫氫酶等） 轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶或異構(gòu)酶轉(zhuǎn)移酶、脫羧酶或異構(gòu)酶-氨基（轉(zhuǎn)氨酶、某些激酶）氨基（轉(zhuǎn)氨酶、某些激酶） 氧化還原酶氧化還原酶- CysCys二硫鍵二硫鍵 兩個(gè)兩個(gè)CysCys的的SHSH基經(jīng)脫氫連接而成二硫鍵。兩個(gè)基經(jīng)脫氫連接而成二硫鍵。兩個(gè)CysCys通

21、常并不相鄰而是間隔若干個(gè)氨基酸殘基。對(duì)于通常并不相鄰而是間隔若干個(gè)氨基酸殘基。對(duì)于這一類酶來說，二硫鍵是酶表現(xiàn)活力所必需的，這一類酶來說，二硫鍵是酶表現(xiàn)活力所必需的，如還原成如還原成SHSH反而喪失活力。而有些酶還通過二硫反而喪失活力。而有些酶還通過二硫鍵與鍵與SHSH基互變而表現(xiàn)活力?；プ兌憩F(xiàn)活力。一些氧化還原酶活性中心二硫鍵附近的一些氧化還原酶活性中心二硫鍵附近的氨基酸順序氨基酸順序酶順序硫辛酰氨脫氫酶(E.Coli)Leu-Gly-Gly-Val-*Cys-Leu-Asn-Val-Gly-*Cys-Ile-Pro-Ser-Lys硫辛酰氨脫氫酶 (豬心）Leu-Gly-Gly-Thr-

22、*Cys-Leu-Asn-Val-Gly-*Cys-Ile-Pro-Ser-Lys谷胱甘肽還原酶（酵母）Leu-Gly-Gly-Thr-*Cys-Val-Asn-Val-Gly-*Cys-Val-Pro-Lys-Val硫氧還蛋白還原酶（E.Coli)Ala-*Cys-Ala-The-*Cys-Asp-Gly-Phe 但是，如何從一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其二但是，如何從一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)呢級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)呢 ? ?生物信息學(xué)或結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本任生物信息學(xué)或結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基本任務(wù)務(wù) 。 非蛋白催化劑（非酶催化劑）的發(fā)現(xiàn)非蛋白催化劑（非酶催化劑）的發(fā)現(xiàn) 1978年耶魯大學(xué)年耶魯大學(xué)Altmen等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌

23、等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌 RNase P是一種不尋常的催化劑。是一種不尋常的催化劑。 1982年年Cech研究組發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物四膜蟲核糖研究組發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物四膜蟲核糖 體中有一段體中有一段RNA可以在不存在蛋白質(zhì)酶的條可以在不存在蛋白質(zhì)酶的條 件下將件下將rRNA前體自我剪切。這表明前體自我剪切。這表明RNA分子分子 本身具有催化性。本身具有催化性。 Ribozyme具有催化能力的具有催化能力的RNACech和他們小組發(fā)現(xiàn)的RNA酶 根據(jù)輔酶根據(jù)輔酶（非蛋白部非蛋白部分）與酶蛋白結(jié)合程度分）與酶蛋白結(jié)合程度輔酶：輔酶：與酶蛋白結(jié)合不牢，極易與酶蛋白結(jié)合不牢，極易分離，在反應(yīng)溶液中與酶蛋白處分離，在反應(yīng)溶液中

24、與酶蛋白處于可逆的解離狀態(tài)如于可逆的解離狀態(tài)如NAD+、NADP+輔基：輔基：與酶蛋白結(jié)合十分牢固而與酶蛋白結(jié)合十分牢固而不易分離如細(xì)胞色素氧化酶的鐵不易分離如細(xì)胞色素氧化酶的鐵卟啉、葡萄糖氧化酶的卟啉、葡萄糖氧化酶的FAD分子分子 輔酶的功能：輔酶的功能：參與和底物分子作用，催化底參與和底物分子作用，催化底物反應(yīng)，而且對(duì)酶蛋白的穩(wěn)定性起保護(hù)作用物反應(yīng)，而且對(duì)酶蛋白的穩(wěn)定性起保護(hù)作用. 輔酶的分類輔酶的分類 1 1、與轉(zhuǎn)移、與轉(zhuǎn)移氫（電子）有關(guān)的輔酶（氧化還原氫（電子）有關(guān)的輔酶（氧化還原 反應(yīng)的輔酶）反應(yīng)的輔酶） 例例: 尼克酰胺核苷酸又稱煙酰胺核苷酸尼克酰胺核苷酸又稱煙酰胺核苷酸絕大部分脫

25、氫酶的輔酶絕大部分脫氫酶的輔酶 尼克酰胺環(huán)是其作用核心，在生物氧化過程中起傳遞氫作用。尼克酰胺環(huán)是其作用核心，在生物氧化過程中起傳遞氫作用。 氧化型尼克酰胺核苷酸（氧化型尼克酰胺核苷酸（NAD+、NADP+）接受一個(gè)質(zhì)子、）接受一個(gè)質(zhì)子、 兩個(gè)電子，還原為兩個(gè)電子，還原為NADH、NADPH還原性底物 + NAD+氧化性底物 + NADH + H+NADP+NADPH 2 2、與其、與其他基團(tuán)（除氫）轉(zhuǎn)移有關(guān)的輔酶他基團(tuán)（除氫）轉(zhuǎn)移有關(guān)的輔酶 例例: 三磷酸腺苷（三磷酸腺苷（ATP）與兩類反應(yīng)有關(guān)：一類是與兩類反應(yīng)有關(guān)：一類是ATP分子轉(zhuǎn)分子轉(zhuǎn) 移到適當(dāng)?shù)氖荏w，如磷酸激酶催化：移到適當(dāng)?shù)氖荏w，

26、如磷酸激酶催化： ATP + 乙酸乙酸 乙酰磷酸乙酰磷酸 + ADP 另一類是另一類是ATP釋放能量供另外的反應(yīng)使用釋放能量供另外的反應(yīng)使用 焦磷酸硫胺素（焦磷酸硫胺素（TPP）是脫羧酶的輔酶，在以下兩種反應(yīng)是脫羧酶的輔酶，在以下兩種反應(yīng)中中 充當(dāng)輔酶：充當(dāng)輔酶： 1、丙酮酸等、丙酮酸等-酮酸的非氧化脫羧和氧化脫羧酮酸的非氧化脫羧和氧化脫羧 2、-乙酮醇的生成和轉(zhuǎn)移反應(yīng)乙酮醇的生成和轉(zhuǎn)移反應(yīng) 磷酸吡哆醛（磷酸吡哆醛（PLP）是轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸脫羧酶的輔酶，它是轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸脫羧酶的輔酶，它 對(duì)蛋白質(zhì)代謝具有十分重要的意義所有的轉(zhuǎn)氨酶都含磷酸對(duì)蛋白質(zhì)代謝具有十分重要的意義所有的轉(zhuǎn)氨酶都含磷酸 吡哆

27、醛，與酶以牢固非共價(jià)鍵相連吡哆醛，與酶以牢固非共價(jià)鍵相連 PLPTPP 黃素核苷酸屬輔基黃素核苷酸屬輔基類，是黃素酶的輔基，類，是黃素酶的輔基，有黃素單核苷酸（有黃素單核苷酸（FMNFMN）黃素腺嘌呤二核苷酸黃素腺嘌呤二核苷酸（ FADFAD）兩種，都含）兩種，都含黃素。黃素。 其催化反應(yīng)的核心其催化反應(yīng)的核心是異咯嗪，二者均呈是異咯嗪，二者均呈黃色熒光，在還原作黃色熒光，在還原作用中其熒光消失，氧用中其熒光消失，氧化后又恢復(fù)化后又恢復(fù)FMNFAD 3 3、金屬、金屬 許多酶的催化作用需要金屬參與，這些金屬被稱為活化因子許多酶的催化作用需要金屬參與，這些金屬被稱為活化因子. 有的金屬有的金屬直

28、接關(guān)系到酶的活性直接關(guān)系到酶的活性，如羧肽酶，如羧肽酶A中的鋅；也有的金屬主中的鋅；也有的金屬主 要是維持主體結(jié)構(gòu)，與酶活性有要是維持主體結(jié)構(gòu)，與酶活性有間接關(guān)系間接關(guān)系，如脂肪酶中的金屬鈣；，如脂肪酶中的金屬鈣； 金屬離子的作用，可能是將酶與底物通過配位鍵連接起來形成如金屬離子的作用，可能是將酶與底物通過配位鍵連接起來形成如 圖所示的復(fù)合物。圖所示的復(fù)合物。 底物底物MCOO- NH2酶蛋白酶蛋白Zinc Finger: 2 His (green) and 2 Cys (red) coordinate the Zn+ (blue)Zn2+ 與羧肽酶與羧肽酶A緊密結(jié)合，對(duì)于該酶的活性頗為重要。

29、緊密結(jié)合，對(duì)于該酶的活性頗為重要。 Zn2+使底物上使底物上 （敏感鍵）中的（敏感鍵）中的 基團(tuán)極化為基團(tuán)極化為 ，同時(shí)，同時(shí)Glu-270的的O-也使也使 的偶極距增多，但并不抵消電子張力的作用，這樣的偶極距增多，但并不抵消電子張力的作用，這樣Zn2+在底物中造成的電子張力就大大促進(jìn)了底物水解在底物中造成的電子張力就大大促進(jìn)了底物水解CNO HCOC+O C+O-Glu270OO-ONH2NHOO-OHTyr248OHZn2+酶 二、酶的作用原理二、酶的作用原理酶與一般化學(xué)催化劑的比較：酶與一般化學(xué)催化劑的比較： A. A. 更高的催化效率更高的催化效率 B. B. 更高的更高的反應(yīng)專一性反

30、應(yīng)專一性 C. C. 溫和的反應(yīng)條件溫和的反應(yīng)條件 D. D. 具有具有調(diào)節(jié)能力調(diào)節(jié)能力 E. E. 易變性失活易變性失活 （一）、酶的高催化效率（一）、酶的高催化效率 就分子比而言，酶催化反應(yīng)速度比非催化就分子比而言，酶催化反應(yīng)速度比非催化反應(yīng)速度高反應(yīng)速度高10108 8 10102020倍，比非酶催化反應(yīng)高倍，比非酶催化反應(yīng)高10107 710101313倍。以轉(zhuǎn)換數(shù)表示，大部分酶為倍。以轉(zhuǎn)換數(shù)表示，大部分酶為10001000左右。左右。 轉(zhuǎn)換數(shù)：轉(zhuǎn)換數(shù)：每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn) 變的分子數(shù)。變的分子數(shù)。 用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)證明酶的催化效率用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)證明酶的催化效

31、率：2 H2 H2 2OO2 2 2 2 H H2 2O + OO + O2 2鐵屑鐵屑 肝糜肝糜 肝糜肝糜（煮）（煮） 酶的催化機(jī)理是降低活化能酶的催化機(jī)理是降低活化能 19461946年年, ,諾貝爾獎(jiǎng)二次得主美國(guó)化學(xué)家諾貝爾獎(jiǎng)二次得主美國(guó)化學(xué)家Linus Linus Pauling Pauling提出酶催化反應(yīng)的提出酶催化反應(yīng)的過渡態(tài)理論過渡態(tài)理論： 酶催化化學(xué)反應(yīng)的機(jī)制在于酶與高能、短壽命酶催化化學(xué)反應(yīng)的機(jī)制在于酶與高能、短壽命的過渡態(tài)（激發(fā)態(tài)）相結(jié)合，在這個(gè)處于反應(yīng)底的過渡態(tài)（激發(fā)態(tài)）相結(jié)合，在這個(gè)處于反應(yīng)底物和產(chǎn)物之間的過渡態(tài)構(gòu)型中物和產(chǎn)物之間的過渡態(tài)構(gòu)型中, ,某些鍵斷裂而另一某

32、些鍵斷裂而另一些鍵形成，從而大大降低了化學(xué)反應(yīng)的活化能。些鍵形成，從而大大降低了化學(xué)反應(yīng)的活化能。 證明：證明：人工合成了過渡態(tài)類似物；人工合成了過渡態(tài)類似物； 用過渡態(tài)類似物制備出抗體酶。用過渡態(tài)類似物制備出抗體酶。 1、中間絡(luò)合物學(xué)說中間絡(luò)合物學(xué)說( (酶酶- -底物復(fù)合體學(xué)說底物復(fù)合體學(xué)說) ) 當(dāng)一個(gè)酶在起催化作用時(shí)當(dāng)一個(gè)酶在起催化作用時(shí), ,首先要和底首先要和底物結(jié)合形成一個(gè)酶物結(jié)合形成一個(gè)酶 底物復(fù)合體底物復(fù)合體, ,然后再然后再催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。這是一個(gè)專一性催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。這是一個(gè)專一性決定過程、也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)決定過程、也是變分子間反應(yīng)為分子內(nèi)反應(yīng)的過程、又是一

33、個(gè)誘導(dǎo)挈合過程。反應(yīng)的過程、又是一個(gè)誘導(dǎo)挈合過程。 E E+ +S S E ES S E E+ +P P 學(xué)說認(rèn)為：學(xué)說認(rèn)為： （1 1）、當(dāng)）、當(dāng)酶催化一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，首先酶催化一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，首先 E和和 S結(jié)結(jié)合形成中間產(chǎn)物合形成中間產(chǎn)物 ES，然后它再分解成產(chǎn)物，然后它再分解成產(chǎn)物P并并釋放酶釋放酶E。S + E ES E + PE-S complexsubstrateRNAse_ESES（2 2）、中間產(chǎn)物比底物需較少的活化）、中間產(chǎn)物比底物需較少的活化 能就可分解成產(chǎn)物并放出酶。能就可分解成產(chǎn)物并放出酶。 （3 3）、）、中間絡(luò)合物中間絡(luò)合物 結(jié)合方式的特點(diǎn)結(jié)合方式的特點(diǎn) 大多通過短程

34、的非共價(jià)鍵大多通過短程的非共價(jià)鍵結(jié)合，反應(yīng)產(chǎn)物易于同酶結(jié)合，反應(yīng)產(chǎn)物易于同酶- -底物復(fù)合物分開。底物復(fù)合物分開。 從酶作用的立體特異性說從酶作用的立體特異性說明酶和底物的結(jié)合至少有三明酶和底物的結(jié)合至少有三點(diǎn)，否則就不能產(chǎn)生立體特點(diǎn)，否則就不能產(chǎn)生立體特異性。異性。 （4 4）、）、ES ES 決定決定酶促反應(yīng)速度。酶促反應(yīng)速度。 根據(jù)上述理論提出根據(jù)上述理論提出酶的催化機(jī)理學(xué)說酶的催化機(jī)理學(xué)說 A A、底物形變、底物形變 B B、鄰近與定向效應(yīng)、鄰近與定向效應(yīng) C C、酸堿催化、酸堿催化 D D、共價(jià)催化、共價(jià)催化 E E、微環(huán)境效應(yīng)、微環(huán)境效應(yīng) 底物形變底物形變(扭曲、張變）扭曲、張變）

35、 酶反應(yīng)時(shí)酶反應(yīng)時(shí), ,酶活性部位與底物分子結(jié)酶活性部位與底物分子結(jié)合合, ,由于酶活性中心關(guān)鍵電荷基團(tuán)使底物由于酶活性中心關(guān)鍵電荷基團(tuán)使底物某些敏感鍵發(fā)生形變某些敏感鍵發(fā)生形變( (扭曲、張變扭曲、張變) )，使底，使底物分子構(gòu)象改變，有關(guān)反應(yīng)鍵削弱，從而物分子構(gòu)象改變，有關(guān)反應(yīng)鍵削弱，從而使反應(yīng)物從基態(tài)激發(fā)為過渡態(tài)，從而降低使反應(yīng)物從基態(tài)激發(fā)為過渡態(tài)，從而降低了活化能，形成過渡態(tài)絡(luò)合物，加速反應(yīng)了活化能，形成過渡態(tài)絡(luò)合物，加速反應(yīng)進(jìn)行。進(jìn)行。 鄰近與定向效應(yīng)鄰近與定向效應(yīng) 鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成絡(luò)合物以后，使底鄰近效應(yīng)是指酶與底物結(jié)合形成絡(luò)合物以后，使底物與底物、酶的催化基團(tuán)與底物之間，結(jié)合于同一分子物與底物、酶的催化基團(tuán)與底物之間，結(jié)合于同一分子的活性部位上的活性部位上而使活性部位的底物有效濃度而使活性部位的底物有效