基因工程章PCR技術(shù)及其應(yīng)用

1、基因工程章PCR技術(shù)及其應(yīng)用第1頁/共105頁圖 1 口腔腺中提取的RNAM: DL2000 marker; 1: 5 L RNA; 2: 10 L RNA; 3: 15 L RNA. M 1 2 328S18S5S第2頁/共105頁2022-5-74第七章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用一、一、PCR技術(shù)原理技術(shù)原理二、二、PCR技術(shù)的主要類型技術(shù)的主要類型三、三、PCR技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用第3頁/共105頁2022-5-75PCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史DNADNA的復(fù)制的復(fù)制DNADNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5 53TAGC

2、GCTATCGCATCGACGCTGGATCG3 35解鏈酶DNADNA解旋解鏈解旋解鏈合成引物合成引物子鏈延長子鏈延長一、一、 PCR技術(shù)原理技術(shù)原理第4頁/共105頁2022-5-76PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNARNA引物引物RNARNA引物引物第5頁/共105頁2022-5-77PCR技術(shù)簡史DNADNA的復(fù)制的復(fù)制DNADNA變性與復(fù)性變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明聚

3、合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA解旋解鏈解旋解鏈合成引物合成引物子鏈延長子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶第6頁/共105頁2022-5-78PCRPCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明第7頁/共105頁2022-5-79PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明n1971年，年，Khorana提出

4、：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆復(fù)該過程便可克隆tRNA基因?；?。n但由于測序和引物合成的困難，但由于測序和引物合成的困難，以及以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，使克隆基因成為可能，所以，Khorana設(shè)想被人們遺忘了設(shè)想被人們遺忘了第8頁/共105頁2022-5-710PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明n1985年，美國年，美國PE-Cetus公司的公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

5、應(yīng)。n基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。復(fù)制。n最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。程耗時，費力，且易出錯。n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶的應(yīng)用使得的應(yīng)用使得PCR能能高效率的進(jìn)行高效率的進(jìn)行第9頁/共105頁2022-5-711DNA polermases for PCR:Thermus aquaticus古細(xì)菌古細(xì)菌-水生棲熱菌水生棲熱菌最適生長溫度最適生長溫度70，具有，具有5 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 3外切酶活性外切酶活性第10頁/共105頁2

6、022-5-712()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20第11頁/共105頁2022-5-713引物引物引物引物第12頁/共105頁2022-5-714第13頁/共105頁2022-5-715PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶的應(yīng)用使得的應(yīng)用使得PCR能能高效率的進(jìn)行，隨后高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推公司推出了第一臺出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀自動化熱循環(huán)儀第14頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理 類似于DNADNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNADNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)

7、混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性- -復(fù)性- -延伸的過程就是一個PCRPCR循環(huán)，PCRPCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。2022-5-716第15頁/共105頁2022-5-717第16頁/共105頁PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95)2022-5-718Target SequenceTarget SequencePCRPCR原理示意圖原理示意圖模板模板DNA的變性：模板的變性：模板DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至

8、93-95左右一定時間左右一定時間后后,使模板使模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離解離,使之使之成為單鏈成為單鏈,以便它與引物結(jié)合以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；第17頁/共105頁PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences2022-5-719Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNADNA與引物的退火與引物的退火( (復(fù)性復(fù)性)

9、 )：模板：模板DNADNA經(jīng)加熱變性成單鏈后經(jīng)加熱變性成單鏈后, ,溫度降至溫度降至5555左右左右, ,引物與模板引物與模板DNADNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；單鏈的互補序列配對結(jié)合；第18頁/共105頁PCR Cycle - Step 3 - At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated2022-5-720Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymer

10、ase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板- -引物結(jié)引物結(jié)合物在合物在TaqDNATaqDNA聚聚合酶的作用下，合酶的作用下，以以dNTPdNTP為反應(yīng)原為反應(yīng)原料，靶序列為模料，靶序列為模板，按堿基配對板，按堿基配對與半保留復(fù)制原與半保留復(fù)制原理，合成一條新理，合成一條新的與模板的與模板DNA DNA 鏈。鏈。第19頁/共105頁End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence2022-5-721Target SequenceTarget Sequence每完成一個循環(huán)每完成一個循環(huán)需需2 24 4分

11、鐘，分鐘， 2 23 3小時就能將小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。增放大幾百萬倍。第20頁/共105頁2022-5-722被擴(kuò)增的被擴(kuò)增的DNADNA片段片段模板模板 DNA DNA 變性變性引物與模板退火引物與模板退火引物延伸引物延伸模板模板DNADNA變性變性引物與模板退火引物與模板退火引物延伸引物延伸引物延伸引物延伸循環(huán)循環(huán)1 1循環(huán)循環(huán)2 2循環(huán)循環(huán)3 3模板模板 DNA DNA 變性變性引物與模板退火引物與模板退火2 21 12 22 22 24 42 23 38 82525次循環(huán)后，被擴(kuò)增的次循環(huán)后，被擴(kuò)增的DNADNA片片段的拷貝數(shù)為段的拷貝數(shù)為 2 225

12、 25 附圖附圖Target Amplification第21頁/共105頁Target Amplification2022-5-723No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon第22頁/

13、共105頁2022-5-724PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系緩沖溶液緩沖溶液(Mg2+是是DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑) 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶脫氧核糖三磷酸核苷酸脫氧核糖三磷酸核苷酸 (dNTPs)模板模板DNA或或cDNA上游引物、下游引物上游引物、下游引物第23頁/共105頁2022-5-725（1）PCR反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液Mg2+是是DNA聚合酶的激活劑。聚合酶的激活劑。1.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使Taq酶活性喪失、酶活性喪失、PCR產(chǎn)量產(chǎn)量下降；下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子

14、結(jié)合，所以反應(yīng)體系中可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。濃度。第24頁/共105頁2022-5-726（2）Taq DNA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-5 U/100 L 酶量增加使反應(yīng)特異性下降酶量增加使反應(yīng)特異性下降; 酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。第25頁/共105頁2022-5-727（3）dNTP dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度濃度取決于擴(kuò)增片段的長度 四種四種dNTP濃度應(yīng)相等濃度應(yīng)相等,一般為一般為50-200 mol/L 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過

15、低則濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量降低反應(yīng)產(chǎn)量 dNTP可與可與Mg2+結(jié)合，使游離的結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，濃度下降，影響影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。第26頁/共105頁2022-5-728（4）模板）模板 單、雙鏈單、雙鏈DNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制聚合酶抑制劑、劑、DNA結(jié)合蛋白類。結(jié)合蛋白類。 一般一般100ng DNA模板模板/100 L。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。第27頁/共105頁2022-5-729（5）引物濃度）引物濃度 0.1-

16、1 mol/L 濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性反應(yīng)特異性下降。下降。第28頁/共105頁PCR引物的設(shè)計一般原則引物的設(shè)計一般原則引物長度一般以1530bp為宜,過短則降低特異性，過長則會引起引物間退火而影響有效擴(kuò)增。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。G/C和A/T堿基均勻分布，G/C含量在4555%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。2022-5-730第29頁/共105頁要避免兩個引物間特別是3末端堿基序列互補以及同一引物自身3末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體

17、或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。引物3末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對，并且3末端為G、C或T時引物效率較高。引物5末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。2022-5-731第30頁/共105頁2022-5-732例例 1. 引物的引物的 3 末端形成雜交末端形成雜交 5 GGCTATACCGATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5例例 2. 引物的引物的 5 末端形成雜交末端形成雜交 5 ATCGATCGATGGCAT

18、GGTAT 3 3 TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5例例 3. 引物的中間部分形成雜交引物的中間部分形成雜交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5例例 4. 5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3引物設(shè)計軟件：引物設(shè)計軟件：Primer 5, Oligo6第31頁/共105頁第32頁/共105頁第33頁/共105頁第34頁/共105頁第35頁/共105頁第36頁/共105頁目的基因上游引物設(shè)計第37頁/共105頁目的基因下游引物設(shè)計第38頁/共105頁第39頁/共105頁2022-5-741PCR一般循環(huán)參數(shù)一般

19、循環(huán)參數(shù)(1)(1)變性變性 使雙鏈?zhǔn)闺p鏈DNADNA解鏈為單鏈解鏈為單鏈,95,95 3 35 5分鐘分鐘(2)(2)退火退火 溫度由引物長度和溫度由引物長度和GC含量決定含量決定, 適宜的退火溫度大適宜的退火溫度大約低于引物約低于引物Tm值值45-55 ，介于，介于45-55 。 增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。Tm值就是DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。 Tm（）（）第40頁/共105頁2022-5-742（3 3）延伸）延伸 7272，延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定，

20、延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4 4）循環(huán)次數(shù)）循環(huán)次數(shù) 主要取決于模版主要取決于模版DNADNA的濃度的濃度 一般為一般為25-3525-35次次 次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加第41頁/共105頁標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 10緩沖液 10 L 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12g Taq DNA聚合酶 2.5U Mg 2+ 1.5mmol/L2022-5-743第42頁/共105頁2022-5-744PCR儀儀第43頁/共105頁2022-5-745模板DNA95第44頁/共105

21、頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-74650引物1引物2DNA引物第45頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-747引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶第46頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-74872第1輪結(jié)束第2輪開始第47頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-749955072TaqTaqTaqTaq第48頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR

22、反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-75072第2輪結(jié)束第49頁/共105頁PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點2022-5-751重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 附圖第50頁/共105頁PCR反應(yīng)注意的事項反應(yīng)注意的事項（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EPEP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照：陽性對照： 陽性模板陰性對照： 陰性模板試劑對照： 除模板

23、外的所有組分2022-5-752第51頁/共105頁PCR反應(yīng)的特點反應(yīng)的特點靈敏度高1.1. 皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級擴(kuò)增到微克(ug=10(ug=10-6-6) )水平2.2. 能從100100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞3.3. 病毒檢測的靈敏度可達(dá)3 3個RFURFU（空斑形成單位） 4.4. 細(xì)菌檢測的最小檢出率為3 3個細(xì)菌簡便、快速1.1. 一次性加好反應(yīng)液，2 24 h4 h完成擴(kuò)增2.2. 擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低u 血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNADNA2022-5-753第52頁/共105頁 空斑形成單位又稱

24、蝕斑形成單位，是計量病毒（或噬菌空斑形成單位又稱蝕斑形成單位，是計量病毒（或噬菌體）的一種單位，但只限于用在有產(chǎn)生空斑能力的病毒。體）的一種單位，但只限于用在有產(chǎn)生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破壞宿主細(xì)胞能力的病毒去感染已其原理是：用少量有破壞宿主細(xì)胞能力的病毒去感染已形成致密單層狀態(tài)的宿主細(xì)胞群體時，經(jīng)過一定培養(yǎng)時形成致密單層狀態(tài)的宿主細(xì)胞群體時，經(jīng)過一定培養(yǎng)時間使每個感染細(xì)胞周圍的細(xì)胞逐漸感染崩潰，形成肉眼間使每個感染細(xì)胞周圍的細(xì)胞逐漸感染崩潰，形成肉眼可見的空斑（噬菌體時可直接觀察，病毒時則需借助于可見的空斑（噬菌體時可直接觀察，病毒時則需借助于活體染色的方法）。在理論上，一個病毒

25、體就可以形成活體染色的方法）。在理論上，一個病毒體就可以形成一個空斑，但實際上有不同程度誤差，因此不能準(zhǔn)確的一個空斑，但實際上有不同程度誤差，因此不能準(zhǔn)確的與其他計量單位互換。用與其他計量單位互換。用PFUPFU計量病毒的方法叫作計量病毒的方法叫作PFUPFU法。法。 第53頁/共105頁1、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 2、反向PCR 3、復(fù)合PCR 4、不對稱PCR 5、嵌套PCR6、3Full RACE7、5Full RACE8、實時定量PCR2022-5-755二、PCR技術(shù)的主要類型技術(shù)的主要類型第54頁/共105頁 1、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) 是指以mRNA在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合

26、成cDNA第一鏈為模板進(jìn)行的PCR。 用于測定基因表達(dá)的強(qiáng)度和鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變,呈現(xiàn)mRNA多態(tài)性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫。2022-5-756第55頁/共105頁2022-5-757反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于反轉(zhuǎn)錄酶具有依賴于RNA的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和RNA酶酶H活性，活性， AMV(42)和和MMLV（37）。）。第56頁/共105頁雙向外切雙向外切DNA-RNADNA-RNA雜合鏈中的雜合鏈中的RNARNA鏈鏈2022-5-758第57頁/共105頁2022-5-75953AAAAA535335533553RT-

27、PCR 原理原理mRNA1st cDNA反反轉(zhuǎn)錄酶、轉(zhuǎn)錄酶、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特異特異 PCR 產(chǎn)物產(chǎn)物5533經(jīng) 30 個循環(huán)，產(chǎn)生 230 個分子拷貝5533第58頁/共105頁2022-5-760MLV RT催化催化的的 cDNA合成合成第59頁/共105頁RT-PCR引物選擇第60頁/共105頁第61頁/共105頁2022-5-7632、反向反向PCR (reverse PCR) 是用反向引物對某個已知是用反向引物對某個已知DNA片段兩側(cè)未知片段兩側(cè)未知序列進(jìn)行的序列進(jìn)行的PCR。 可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)

28、行分析可對未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接如探索鄰接已知已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的片段的序列；用于僅知部分序列的全長全長cDNA的克隆的克隆,擴(kuò)增基因文庫的插入擴(kuò)增基因文庫的插入DNA。已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列第62頁/共105頁2022-5-764已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶連接酶連接酶第63頁/共105頁2022-5-7653、復(fù)合、復(fù)合PCR(或稱多重或稱多重PCR)在一個反應(yīng)體系加入多對不同的在一個反應(yīng)體系加入多對不同的PCRPCR引物同時擴(kuò)增，引物同時擴(kuò)增，獲得多個獲得多個PCRPCR產(chǎn)物，這種產(chǎn)物，

29、這種PCRPCR稱為復(fù)合稱為復(fù)合PCRPCR。用于檢測。用于檢測特定基因序列的存在或缺失。特定基因序列的存在或缺失。電電泳泳第64頁/共105頁2022-5-7664、不對稱、不對稱PCR 是指用不等量的一對引物產(chǎn)生大量單鏈?zhǔn)侵赣貌坏攘康囊粚σ锂a(chǎn)生大量單鏈DNA的的PCR。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01 0.5M,關(guān)鍵是關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。限制性引物的絕對量。 用途：用途： 制備核酸序列測定的模板制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針制備雜交探針 基因組

30、基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究結(jié)構(gòu)功能的研究第65頁/共105頁2022-5-767 高濃度引物低濃度引物第66頁/共105頁5、嵌套、嵌套PCR(或稱巢式或稱巢式PCR)u是指先后用兩套引物進(jìn)行擴(kuò)增的PCRPCR。u用第一套引物擴(kuò)增15153030個循環(huán)；u再用擴(kuò)增DNADNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15153030個循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增。2022-5-768第67頁/共105頁6 6、3 3Full RACEFull RACE第68頁/共105頁7、5Full RACE第69頁/共105頁第70頁/共105頁第71頁/共105頁第72頁/共105頁第73頁/共105頁5-fl

31、anking region of chicken ovalbumin gene 第74頁/共105頁8、實時熒光定量PCR(real-time PCR): 美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。 通過特定設(shè)計的PCR儀器檢測PCR擴(kuò)增過程每一輪循環(huán)產(chǎn)物標(biāo)記的熒光信號累積數(shù)量，從而進(jìn)行實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析,稱為實時熒光定量PCR。以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)K產(chǎn)物進(jìn)行分析或?qū)CR過過程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝數(shù)，稱為定量程進(jìn)行監(jiān)測，從而達(dá)到評估樣本中靶基因的拷貝

32、數(shù)，稱為定量PCR。 2022-5-776第75頁/共105頁（1） SYBR Green I 檢測模式 通過通過PCRPCR反應(yīng)生成雙鏈反應(yīng)生成雙鏈DNADNA，SYBRSYBR Green I Green I與雙鏈與雙鏈DNADNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測PCRPCR反應(yīng)液中的熒光信反應(yīng)液中的熒光信號強(qiáng)度，可以對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時還可以號強(qiáng)度，可以對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時還可以測定擴(kuò)增的目的測定擴(kuò)增的目的DNADNA片段的融解溫度。片段的融解溫度。 SYBR Green I SYBR Green I 的優(yōu)點：的優(yōu)點：SYBR Green I SYBR Gre

33、en I 的優(yōu)點是因的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈為其缺點產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈 DNADNA相結(jié)合，相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通所以對不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，用性較好，并且價格相對較低。這對科研是很有利的，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。第76頁/共105頁第77頁/共105頁2022-5-779（2） 水解探針模式（Taqman探針） 發(fā)射基團(tuán)發(fā)射基團(tuán)熒光淬滅基團(tuán)熒光淬滅基團(tuán)53該探針可與擴(kuò)增序列內(nèi)的該探針可與擴(kuò)增序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交模板發(fā)生特

34、異性雜交,探針探針的的5端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán)端標(biāo)以熒光發(fā)射基團(tuán),靠近靠近3端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán),探探針針3端被磷酸化端被磷酸化以防止探針在以防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。擴(kuò)增過程中被延伸。第78頁/共105頁2022-5-780第79頁/共105頁2022-5-781第80頁/共105頁 工作原理是利用Taq酶的53外切酶活性。 在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記探針，它與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交。 探針的5端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)(熒光發(fā)射峰值在518nm處)，3端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán) (熒光發(fā)射峰值在582nm處)且被磷酸化，以防止探針3端在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。

35、2022-5-782第81頁/共105頁 當(dāng)探針保持完整時，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測系統(tǒng)檢測到。 復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq酶隨引物延伸沿DNA模板移動，當(dāng)Taq酶移動到探針切斷,淬滅作用被解除，熒光信號釋放出來。 模板每復(fù)制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對一的關(guān)系,因此用該技術(shù)可對模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。2022-5-783第82頁/共105頁Lymphocyte IntestineKidneyHeartGill0204060

36、80Relative ExpressionTissues Control Lps ConA實時定量實時定量PCRPCR法檢測法檢測Lj-HMGB2Lj-HMGB2基因在各組織中含量基因在各組織中含量第83頁/共105頁2022-5-785三、PCRPCR技術(shù)應(yīng)用技術(shù)應(yīng)用1. 基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)研究基因或基因或 cDNA 克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因克隆：從基因數(shù)據(jù)庫中獲得某一基因或或 cDNA 核苷酸序列核苷酸序列, 用用 PCR 方法擴(kuò)增并克隆該基因方法擴(kuò)增并克隆該基因或或 cDNA?；虮磉_(dá)：用基因表達(dá)：用 RT-PCRRT-PCR檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

37、的表達(dá)。2. 醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)感染性疾病病原體的診斷：感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核桿菌、乙肝結(jié)核桿菌、乙肝病毒等。病毒等。遺傳病相關(guān)基因檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。遺傳病相關(guān)基因檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病。惡性腫瘤的診斷惡性腫瘤的診斷。第84頁/共105頁2022-5-7863. 法醫(yī)學(xué)中的基因和親子鑒定法醫(yī)學(xué)中的基因和親子鑒定DNA 指紋圖譜 19841984年英國萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家年英國萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家JefferysJefferys及其合及其合作者首次將分離的人源作者首次將分離的人源小衛(wèi)星小衛(wèi)星DNADNA用作基因探針，同用作基因探針，同人體核人體核DNADNA的酶切片段雜交，

38、獲得了由多個位點上的的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個人完全相同，故稱為極少有兩個人完全相同，故稱為DNADNA指紋指紋 ，意思是，意思是它同人的指紋一樣是每個人所特有的。它同人的指紋一樣是每個人所特有的。第85頁/共105頁第86頁/共105頁AATG7 repeats8 repeatsAATGAATG引物引物引物引物簡單序列重復(fù)(SSR)實驗方法第87頁/共105頁第88頁/共105頁 現(xiàn)場 嫌疑人1 嫌疑人2 嫌疑人3法醫(yī)鑒定案例一案例一第89頁/共105頁親子鑒定案例二案例二第90頁/共

39、105頁4. 考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定考古學(xué)中生物種類間的親緣關(guān)系、進(jìn)化途徑判定5. 基因動、植物的檢測基因動、植物的檢測轉(zhuǎn)基因動物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因動物的檢測：檢測某一基因的遺傳穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。轉(zhuǎn)基因植物的檢測：玉米、大豆等。第91頁/共105頁 Human HMGB1 P09429 Mouse HMGB1 P63158 Chick HMGB1 Q9PUK9 Frog HMGB1 Q7SZ42 Human HMGB2 P26583 Mouse HMGB2 P30681 Chick HMGB2 P26584 Frog HMGB2

40、Q32NS7 Human HMGB3 O15347 Mouse HMGB3 O54879 Chick HMGB3 P40618 Frog HMGB3 O54879 Lj HMGB1 HQ615991 Amphi HMG1/2 Q6PUE4 Sea urchin HMG1 P406449981999998979989889492560.000.050.100.150.200.250.300.35物種進(jìn)化圖第92頁/共105頁2022-5-7941 1、要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體要求將下面基因片段克隆至表達(dá)載體pET-28apET-28a相應(yīng)位點上，并獲得此基因的表達(dá)。相應(yīng)位點上，并獲得此基

41、因的表達(dá)。 ATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAC CAT GGC CAT GGT TGG TAT TTA GCT T TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TT

42、T TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT C TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT

43、AGC GCA GGAAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA GGT TGC AAA AC

44、T AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA 2 2、限制性核酸內(nèi)切酶識別的堿基序列如下： BamHI:GGATCC, EcoRI:GAATTC, NcoI:CCATGG,HindIII:AAG

45、CTTBamHI:GGATCC, EcoRI:GAATTC, NcoI:CCATGG,HindIII:AAGCTT3 3、保護(hù)性堿基情況：BamHI:CGCGGATCCGCG, EcoRI:CCGGAATTCCGG, NcoI:CATGCCATGGCATG,HindIII:CCCAAGCTTGGGBamHI:CGCGGATCCGCG, EcoRI:CCGGAATTCCGG, NcoI:CATGCCATGGCATG,HindIII:CCCAAGCTTGGG回答如下問題：回答如下問題：1、設(shè)計、設(shè)計1對對PCR引物，寫出引物，寫出F和和R 的引物序列，并簡述的引物序列，并簡述PCR引物設(shè)計的基本原

46、則。引物設(shè)計的基本原則。2、如果用瓊脂糖凝膠電泳檢測、如果用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，應(yīng)該用多大濃度的瓊脂糖凝膠比較合適？產(chǎn)物，應(yīng)該用多大濃度的瓊脂糖凝膠比較合適？3、如果沒有得到、如果沒有得到PCR產(chǎn)物，可能存在哪些問題，如何解決？產(chǎn)物，可能存在哪些問題，如何解決？4、如果、如果PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)片狀，可能存在哪些問題，如何解決？產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)片狀，可能存在哪些問題，如何解決？5、如果、如果PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時，其特異性不夠，可能存在哪些問題，如何解決？產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳時，其特異性不夠，可能存在哪些問題，如何解決？第93頁/共105頁 在進(jìn)行在進(jìn)行PCR時，遇到一些問題時的解決辦法：時，遇到一些問題時的解決辦法： 1沒有得到所希望的沒有得到所希望的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物 確證是否加入酶，檢查酶是否有