紫外可見分光光度技術

1、紫外紫外-可見分光光度技術可見分光光度技術設備設備可移動機械狹縫型分光光度計可移動機械狹縫型分光光度計二級管陣列型分光光度計二級管陣列型分光光度計可移動機械狹縫型分光光度計可移動機械狹縫型分光光度計光源光源單色器單色器檢測器檢測器光源光源紫外光區(qū)（紫外光區(qū)（180-400nm180-400nm）用氘燈）用氘燈400nm400nm以上的可見光區(qū)用鎢燈以上的可見光區(qū)用鎢燈市場上也有采用鹵素燈的產(chǎn)品市場上也有采用鹵素燈的產(chǎn)品單色器單色器從混合光獲得單色光的光學元件從混合光獲得單色光的光學元件通常用棱鏡或衍射光柵作為光的色散元通常用棱鏡或衍射光柵作為光的色散元件件然后通過狹縫結構獲得波長范圍盡可能然后

2、通過狹縫結構獲得波長范圍盡可能狹窄（如約狹窄（如約1nm1nm）的單色光束）的單色光束通過狹縫結構的移動可以選擇不同波長通過狹縫結構的移動可以選擇不同波長的單色光的單色光檢測器檢測器接受單色透射光的元件接受單色透射光的元件由光電倍增管構成由光電倍增管構成它可以接受光信號，并將透射光的強度它可以接受光信號，并將透射光的強度轉換成電信號。轉換成電信號。模擬信號（模擬信號（Analog signalAnalog signal）數(shù)字信號（數(shù)字信號（Digital signalDigital signal）以透射光強度的變化作為波長的函數(shù)得以透射光強度的變化作為波長的函數(shù)得到的平面圖既吸收光譜，或稱掃描

3、圖。到的平面圖既吸收光譜，或稱掃描圖。雙光束型分光光度計雙光束型分光光度計其光源產(chǎn)生的兩束光同時通過樣品池與其光源產(chǎn)生的兩束光同時通過樣品池與參比池參比池這兩個透射光束之間強度的差別則反映這兩個透射光束之間強度的差別則反映了樣品吸收光的強度。了樣品吸收光的強度。單光束分光光度計單光束分光光度計單一光束通過樣品池。單一光束通過樣品池。如果用這種儀器進行定量分析，在將樣如果用這種儀器進行定量分析，在將樣品池放入光束中讀出其吸收值之前，必品池放入光束中讀出其吸收值之前，必須將只含溶劑的參比池放入光束中，通須將只含溶劑的參比池放入光束中，通過調(diào)整使其光吸收值為零來進行校準。過調(diào)整使其光吸收值為零來進行

4、校準。結構結構光源光源狹縫狹縫棱鏡棱鏡狹縫狹縫樣品池樣品池入射光入射光透射光透射光光電倍增管光電倍增管信號記錄信號記錄 光源光源 狹縫狹縫 棱鏡棱鏡 狹縫狹縫 樣品池樣品池 入射光入射光 透射光透射光 光電倍增管光電倍增管 二級管陣列型分光光度計二級管陣列型分光光度計 一種依靠光電二級管陣列一種依靠光電二級管陣列（Photodiode Array，PDA）采）采集光信號的分光光度計。集光信號的分光光度計。工作原理工作原理光源整個光譜范圍的光全部穿過樣品光源整個光譜范圍的光全部穿過樣品然后將透射光色散然后將透射光色散經(jīng)過色散的全波長的光同時落在光電二級管經(jīng)過色散的全波長的光同時落在光電二級管陣列

5、上陣列上任何非常狹窄的波帶被置于適當位置上的各任何非常狹窄的波帶被置于適當位置上的各個二級管接受，并轉換成電信號。個二級管接受，并轉換成電信號。同時收集所有光電二極管輸出的信號同時收集所有光電二極管輸出的信號可在非常短的時間（微秒）內(nèi)記錄樣品的全可在非常短的時間（微秒）內(nèi)記錄樣品的全波程吸收光譜。波程吸收光譜。意義意義PDA的出現(xiàn)是對紫外的出現(xiàn)是對紫外可見吸收光譜可見吸收光譜技術來說，是一個革命性的突破。技術來說，是一個革命性的突破。它最突出的優(yōu)點是可以迅速提供被檢它最突出的優(yōu)點是可以迅速提供被檢測組分在一定波長范圍內(nèi)的掃描圖。測組分在一定波長范圍內(nèi)的掃描圖。結構結構光源光源狹縫狹縫棱鏡棱鏡樣

6、品池樣品池入射光入射光透射光透射光光電二極管陣列光電二極管陣列 光源光源 狹縫狹縫 棱鏡棱鏡 樣品池樣品池 入射光入射光 透射光透射光 光電二極管陣列光電二極管陣列 儀器參數(shù)儀器參數(shù)波長范圍波長范圍帶寬帶寬量程量程基線漂移基線漂移儀器的校正儀器的校正光源光源波長波長吸光度吸光度比色杯比色杯光源校正光源校正發(fā)射能量的降低發(fā)射能量的降低狹縫的調(diào)節(jié)狹縫的調(diào)節(jié)單色性單色性波長的校正波長的校正紫外光區(qū)紫外光區(qū)無水乙醇：無水乙醇：229.2nm233.9nm 238.9nm 243.3nm 248.5nm 260.6nm 268.4nm吸光度的校正吸光度的校正確定化合物確定化合物確定濃度確定濃度不同波長不

7、同波長不同吸光度不同吸光度比色杯的校正比色杯的校正不同杯的比較不同杯的比較測量條件的選擇測量條件的選擇波長波長狹縫狹縫量程量程定性分析定性分析光譜特征光譜特征最大吸收峰最大吸收峰峰形峰形細微結構細微結構定性結論定性結論歸納推理歸納推理-0.100.100.300.500.700.90250300350400450500550Wavelength nmResponse V0IIIII化合物純度的鑒定化合物純度的鑒定類胡蘿卜素順式異構體類胡蘿卜素順式異構體-0.100.100.300.500.700.901.102622823023223423623824024224424624825025225

8、42Wavelength nmRelative response15Z-beta-caroteneall-E-beta-carotene結構推斷結構推斷原子吸收光譜原子吸收光譜E原子原子=E電子電子電子躍遷電子躍遷=能量吸收能量吸收原子吸收光譜原子吸收光譜分子吸收光譜分子吸收光譜E分子分子=E電子電子+ E震動震動+E轉動轉動分子能及躍遷分子能及躍遷=能量吸收能量吸收分子吸收光譜分子吸收光譜分子吸收光譜分子吸收光譜電子吸收光譜電子吸收光譜紫外紫外可見可見震動吸收光譜震動吸收光譜紅外紅外轉動吸收光譜轉動吸收光譜遠紅外遠紅外電子吸收光譜（電子吸收光譜（UV-VIS）分子的外層電子躍遷造成分子的外層

9、電子躍遷造成的吸收光譜的吸收光譜成鍵電子成鍵電子非鍵電子非鍵電子反鍵電子（能級最高）反鍵電子（能級最高）分子的外層電子躍遷分子的外層電子躍遷s s（sigma）-s-s* *n-s-s* *n-p-p* *p-pp-p* *s-ss-s* *躍遷躍遷s s* *反鍵軌道反鍵軌道 200200nm真空紫外區(qū)真空紫外區(qū)飽和烷烴飽和烷烴甲烷：甲烷：125125nm乙烷：乙烷：135135nmn-s-s* *躍遷躍遷n-電子：非鍵軌道電子電子：非鍵軌道電子=孤對電子孤對電子躍遷能躍遷能 s-ss-s* *躍遷能躍遷能150-250150-250nm摩爾吸光系數(shù)：摩爾吸光系數(shù)：100-300100-30

10、0飽和烴類飽和烴類n-p-p* *和和p-pp-p* *躍遷躍遷n電子和電子和 p p電子比較容易激發(fā)電子比較容易激發(fā) 200200nm不飽和官能團不飽和官能團含有含有p p鍵鍵- -生色團生色團n-p-p* *躍遷：摩爾吸光系數(shù)躍遷：摩爾吸光系數(shù)=10-100=10-100p-pp-p* *躍遷：摩爾吸光系數(shù)躍遷：摩爾吸光系數(shù)=1000-=1000-1000010000單個單個不飽和官能團：不飽和官能團：摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)=104=104n-p-p* *和和p-pp-p* *躍遷躍遷溶劑極性增加：溶劑極性增加：n-p-p* *躍遷：紫移躍遷：紫移p-pp-p* *躍遷：紅移躍遷：紅移定

11、量分析定量分析根據(jù)根據(jù)Beer-Lambert定律，樣品液定律，樣品液(y毫升毫升)中樣品的量中樣品的量x 毫克能由下列公毫克能由下列公式計算：式計算：x=(Ay1000)/(A1%1cm100) A1%cm的定義為在的定義為在1厘米光程長的比厘米光程長的比色杯中色杯中1%（W/V）濃度溶質的理）濃度溶質的理論吸收值。論吸收值。 定量分析定量分析比色比色內(nèi)標內(nèi)標外標外標標準曲線標準曲線外界條件對光譜的影響外界條件對光譜的影響溶劑環(huán)境的影響溶劑環(huán)境的影響溫度的影響溫度的影響存在狀態(tài)的影響存在狀態(tài)的影響游離態(tài)游離態(tài)復合態(tài)復合態(tài)溶劑環(huán)境溶劑環(huán)境分子能級躍遷的能量與溶劑的折射分子能級躍遷的能量與溶劑的

12、折射率有關率有關當溶劑的折射率增加時，光譜會發(fā)當溶劑的折射率增加時，光譜會發(fā)生紅移。生紅移。當溶劑的折射率降低時，光譜會發(fā)當溶劑的折射率降低時，光譜會發(fā)生紫移。生紫移。類胡蘿卜素在不同溶劑中的類胡蘿卜素在不同溶劑中的max值值溶劑 紅移 (nm) hexane light petroleum ethanol diethyl ether acetonitrile acetone chloroform dichloroform benzene toluene pyridine carbon disulphide 0 0 0 0 0 2-6 10-20 10-20 18-24 18-24 18-24

13、 30-40 水的影響水的影響當含水量達到當含水量達到3050%時，類胡蘿卜素的時，類胡蘿卜素的光譜會出現(xiàn)一個新的強吸收峰，而通常的光譜會出現(xiàn)一個新的強吸收峰，而通常的主吸收帶的強度會減弱。主吸收帶的強度會減弱。新峰的位置通常在紫外區(qū)新峰的位置通常在紫外區(qū)番茄紅素：番茄紅素：354nm葉黃素：葉黃素：370nm玉米黃素：玉米黃素：380nm這個峰通常相當窄，并且無精細結構。這個峰通常相當窄，并且無精細結構。溫度的影響溫度的影響在低溫下，分子的紫外可見光譜形在低溫下，分子的紫外可見光譜形狀可能會發(fā)生根本性變化。狀可能會發(fā)生根本性變化。10-40nm的紅移的紅移光譜精細結構的改變光譜精細結構的改變通常還會伴隨有新的吸收帶出現(xiàn)。通常