實驗五 玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定

1、實驗五實驗五玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰玉米種子鹽溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定胺凝膠電泳鑒定 目的要求目的要求n通過本實驗，了解玉米種子鹽溶蛋白的通過本實驗，了解玉米種子鹽溶蛋白的提取方法、電泳程序、染色和鑒別方法。提取方法、電泳程序、染色和鑒別方法。試液配制l凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制 貯備液貯備液A（分離膠貯備液）（分離膠貯備液） 貯備液貯備液B（分離膠緩沖液）（分離膠緩沖液） 貯備液貯備液C（分離膠化學(xué)聚合催化劑（分離膠化學(xué)聚合催化劑1%APS） 貯備液貯備液D（濃縮膠貯備液）（濃縮膠貯備液） 貯備液貯備液E（濃縮膠緩沖液）（濃縮膠緩沖液） 貯備液貯備液F（濃縮膠聚合催化劑（濃縮膠聚合催化

2、劑1%過硫酸銨）過硫酸銨） 貯備液貯備液G（凝膠聚合加速劑）（凝膠聚合加速劑） 四甲基乙二胺（縮寫四甲基乙二胺（縮寫TEMED） 凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液A（分離膠貯備液）（分離膠貯備液）u稱取稱取Acr90g和和Bis3g，加入蒸餾水，加入蒸餾水350ml，攪拌，攪拌至完全溶解（約至完全溶解（約30min），并定容至），并定容至500mlu過濾入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。過濾入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液B（分離膠緩沖液）（分離膠緩沖液）u吸取含量吸取含量88%的甲酸的甲酸0.427mlu再稱取甲酸鈉（含再稱取甲酸鈉（含2個結(jié)晶水）個

3、結(jié)晶水）1.0456gu加入加入50ml蒸餾水，攪拌混勻，并定容到蒸餾水，攪拌混勻，并定容到100ml，并調(diào)節(jié)并調(diào)節(jié)PH至至3.2u倒入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。倒入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液C（分離膠化學(xué)聚合催化劑（分離膠化學(xué)聚合催化劑1%APS）u稱取稱取2gAPS，加入，加入100ml蒸餾水，攪拌至完全蒸餾水，攪拌至完全溶解溶解u再定容至再定容至200ml，倒入棕色瓶中，倒入棕色瓶中u放入冰箱低溫保存，僅能保存放入冰箱低溫保存，僅能保存1周。周。凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液D（濃縮膠貯備液）（濃縮膠貯備液）u稱取稱取9.3gAcr和

4、和0.31gBis，加入蒸餾水，加入蒸餾水30ml，攪，攪拌至完全溶解拌至完全溶解u并定容至并定容至50ml，倒入棕色瓶中，倒入棕色瓶中u放入冰箱低溫保存。放入冰箱低溫保存。凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液E（濃縮膠緩沖液）（濃縮膠緩沖液）u吸取含量為吸取含量為88%的甲酸的甲酸0.218ml，稱取甲酸鈉，稱取甲酸鈉0.5228g，加入，加入30ml蒸餾水溶解，并定容至蒸餾水溶解，并定容至50mlu調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)PH至至5.6，倒入棕色瓶中，倒入棕色瓶中u放入冰箱低溫保存。放入冰箱低溫保存。u或者先溶解甲酸鈉，然后用甲酸滴加，調(diào)節(jié)或者先溶解甲酸鈉，然后用甲酸滴加，調(diào)節(jié)PH至至5.6。凝膠溶液

5、的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液F（濃縮膠聚合催化劑（濃縮膠聚合催化劑1%過硫酸銨）過硫酸銨）u稱取稱取1gAPS，先用，先用60-70ml蒸餾水溶解，攪拌蒸餾水溶解，攪拌至完全溶解后至完全溶解后u定容至定容至100mlu倒入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。倒入棕色瓶中，放入冰箱低溫保存。u僅能保存僅能保存1周。周。凝膠溶液的配制凝膠溶液的配制貯備液貯備液G（凝膠聚合加速劑）（凝膠聚合加速劑） 四甲基乙二胺四甲基乙二胺（縮寫（縮寫TEMED）u吸取吸取TEMED 1ml，加蒸餾水，加蒸餾水9mlu定容至定容至10mlu放入冰箱低溫保存。放入冰箱低溫保存。試液配制l樣品提取液的配制樣品提取液的配制

6、l電極緩沖液的配制電極緩沖液的配制 l蛋白質(zhì)染色液配制蛋白質(zhì)染色液配制l凝膠貯備液配制凝膠貯備液配制 樣品提取液的配制樣品提取液的配制 u稱取稱取0.2928gNaCl，20g蔗糖和蔗糖和0.04g甲基甲基綠，加蒸餾水溶解，充分?jǐn)嚢柚寥芙饩G，加蒸餾水溶解，充分?jǐn)嚢柚寥芙鈛定容至定容至100ml。電極緩沖液的配制電極緩沖液的配制u吸取含量為吸取含量為88%的甲酸溶液的甲酸溶液8.54ml，稱取甘氨，稱取甘氨酸酸6.006g，先用，先用1600ml蒸餾水溶解，最后定容蒸餾水溶解，最后定容至至2000mlu混勻并調(diào)節(jié)混勻并調(diào)節(jié)PH至至3.45備用備用u可重復(fù)使用可重復(fù)使用5次（或先將甘氨酸溶解，然后

7、滴次（或先將甘氨酸溶解，然后滴加甲酸，調(diào)至加甲酸，調(diào)至PH3.45）蛋白質(zhì)染色液配制蛋白質(zhì)染色液配制u稱取稱取1g考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R-250，先用，先用95%酒精溶解至酒精溶解至100ml，再配再配10%三氯醋酸溶液，然后吸取三氯醋酸溶液，然后吸取1%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)3.5ml，再加，再加10%TCA100ml，配成一塊凝膠板染色液。，配成一塊凝膠板染色液。u或者將考馬斯亮藍(lán)或者將考馬斯亮藍(lán)R-250配成配成0.5%（W/V）的乙醇溶）的乙醇溶液，用濾紙過濾，放入試劑瓶中備用。液，用濾紙過濾，放入試劑瓶中備用。u另用蒸餾水配制另用蒸餾水配制10%（W/V）的三氯乙酸溶液。使用）的三氯乙

8、酸溶液。使用時，取時，取5ml考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)R-250的乙醇溶液，加到的乙醇溶液，加到200ml三氯乙酸溶液中，混勻三氯乙酸溶液中，混勻 u 注：該染色液具有固定和染色兩種功能，必須在放入注：該染色液具有固定和染色兩種功能，必須在放入凝膠染色前再混合。凝膠染色前再混合。操作技術(shù)l樣品制備樣品制備取單粒玉米種子，在單粒樣品磨上粉碎后，收取單粒玉米種子，在單粒樣品磨上粉碎后，收集到集到1.5ml離心管中，按約離心管中，按約1：1的量用洗瓶或滴的量用洗瓶或滴管加入管加入樣品提取液樣品提取液，搖勻，自然沉降，搖勻，自然沉降30min后，后，取上清液即可。取上清液即可。一般加樣一般加樣30-50l

9、,如加的提取液太少則可補加。如加的提取液太少則可補加。l凝膠制備凝膠制備 l電泳槽準(zhǔn)備電泳槽準(zhǔn)備先將玻璃裝入橡膠封條中，然后插入有機玻璃制成的先將玻璃裝入橡膠封條中，然后插入有機玻璃制成的電泳槽中，擰緊螺栓，固定好膠模。電泳槽中，擰緊螺栓，固定好膠模。注意：注意：玻璃板必須洗干凈，而且要干燥，手指不能接玻璃板必須洗干凈，而且要干燥，手指不能接觸玻璃板表面，操作時用手拿住玻璃棱，另外，膠模觸玻璃板表面，操作時用手拿住玻璃棱，另外，膠模在電泳槽中要放平，位置合適，以防漏水。在電泳槽中要放平，位置合適，以防漏水。 操作技術(shù)操作技術(shù)l配膠配膠 從冰箱中取出從冰箱中取出凝膠貯備液凝膠貯備液。按表按表1比

10、例取出一定體積的分離膠各貯備液混勻比例取出一定體積的分離膠各貯備液混勻同樣取出濃縮膠溶液，混勻同樣取出濃縮膠溶液，混勻G號液先不加入。號液先不加入。將各貯備液再放回冰箱。將各貯備液再放回冰箱。貯備液編號貯備液編號分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠配比配比一塊板取液量一塊板取液量配比配比一塊板取液量一塊板取液量A520mlB14mlC28mlD11mlE11mlF22mlG6l30l10l10l表表1 凝膠配比凝膠配比 注意：取貯備液用的移液管要分別使用，不能混用。注意：取貯備液用的移液管要分別使用，不能混用。操作技術(shù)l封底縫封底縫 灌制分離膠前必須先將底縫用膠封住灌制分離膠前必須先將底縫用膠封住根據(jù)底縫

11、大小，取根據(jù)底縫大小，取10ml分離膠混合液分離膠混合液，加入，加入10lG液液（用微量注射器加入），然后迅速搖勻，沿（用微量注射器加入），然后迅速搖勻，沿下槽玻板下槽玻板外壁外壁倒入，將底縫封住。倒入，將底縫封住。將電泳槽在實驗臺面上振動一下，使底縫封平。一般將電泳槽在實驗臺面上振動一下，使底縫封平。一般510min，分離膠就會將底縫封住。，分離膠就會將底縫封住。操作技術(shù)l灌分離膠灌分離膠 從分離膠混合液中取出一塊玻板的較量。從分離膠混合液中取出一塊玻板的較量。按比例加入按比例加入G號溶液，迅速搖勻，將電泳槽傾斜，將分離膠混合號溶液，迅速搖勻，將電泳槽傾斜，將分離膠混合液倒入兩玻板之間達一定

12、高度（距玻板上邊約液倒入兩玻板之間達一定高度（距玻板上邊約1.01.5cm）。）。灌膠后，用預(yù)先準(zhǔn)備好的注射器注水封住膠面，水封的動作要輕，灌膠后，用預(yù)先準(zhǔn)備好的注射器注水封住膠面，水封的動作要輕，不能沖壞膠面，當(dāng)水封后，分離膠和水層間有一界面，等一下界不能沖壞膠面，當(dāng)水封后，分離膠和水層間有一界面，等一下界面消失，再面消失，再出現(xiàn)界面時表明凝膠已成出現(xiàn)界面時表明凝膠已成，此時倒出封水，用濾紙吸，此時倒出封水，用濾紙吸干，干，注意濾紙不能接觸膠面。注意濾紙不能接觸膠面。 操作技術(shù)l灌濃縮膠灌濃縮膠 取適量濃縮膠混合液，按比例加入取適量濃縮膠混合液，按比例加入G號溶液號溶液，迅速搖，迅速搖勻，灌

13、入電泳槽中，插好事先準(zhǔn)備的樣品刷，用夾子勻，灌入電泳槽中，插好事先準(zhǔn)備的樣品刷，用夾子夾住。夾住。該凝膠聚合很快，故動作要快，樣品梳要插平。該凝膠聚合很快，故動作要快，樣品梳要插平。 操作技術(shù)l加樣加樣 濃縮膠聚合后，倒入電極緩沖液，濃縮膠聚合后，倒入電極緩沖液，上槽電極緩沖液面上槽電極緩沖液面要高于短玻板，要高于短玻板，然后小心拔出樣品梳。然后小心拔出樣品梳。用微量進樣器吸取用微量進樣器吸取2030l玉米蛋白提取液的上清液，玉米蛋白提取液的上清液，依次在樣品槽中點樣，每點一個樣要換一個槍頭。依次在樣品槽中點樣，每點一個樣要換一個槍頭。 操作技術(shù)l電泳電泳 點樣完畢，將電源正極結(jié)上槽，負(fù)極結(jié)下

14、槽，接通冷點樣完畢，將電源正極結(jié)上槽，負(fù)極結(jié)下槽，接通冷卻水，打開電泳儀電源開關(guān)，采用穩(wěn)壓方式，調(diào)節(jié)電卻水，打開電泳儀電源開關(guān)，采用穩(wěn)壓方式，調(diào)節(jié)電壓壓300600V。注意注意電源正負(fù)極不能接反電源正負(fù)極不能接反。甲基綠擴散至槽底部距膠。甲基綠擴散至槽底部距膠底部邊緣底部邊緣0.51.0cm處時，關(guān)閉電泳儀（一般電泳時間處時，關(guān)閉電泳儀（一般電泳時間為為1.01.5h）。）。操作技術(shù)l卸板卸板 倒出電極緩沖液，擰松固定螺桿。倒出電極緩沖液，擰松固定螺桿。將玻璃板和密封膠帶一同取出，卸下密封膠帶，用不將玻璃板和密封膠帶一同取出，卸下密封膠帶，用不銹鋼刀小心撬開玻板，剝離完后將凝膠板倒入染色液銹鋼刀小心撬開玻板，剝離完后將凝膠