細(xì)胞電生理學(xué)及膜片鉗技術(shù)

1、cell electrophysiology & patch clamp techniques 1991 Nobel基金會(huì)的頒獎(jiǎng)評(píng)語： 膜片鉗技術(shù)點(diǎn)燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，為細(xì)胞生理學(xué)的研究帶來了一場(chǎng)革命性的變化，它和基因克隆技術(shù)并駕齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用 3、離子通道藥理學(xué)、離子通道藥理學(xué)1、細(xì)胞電生理學(xué)、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE 細(xì)胞電生理學(xué)細(xì)胞電生理學(xué) Electrophysiology細(xì)胞生理學(xué)：揭示細(xì)胞的生理過程，用電生細(xì)胞生理學(xué)：揭示細(xì)胞的生理過程，用電生理方法記錄生物電活動(dòng)理方法記錄生物電活

2、動(dòng)測(cè)量測(cè)量離子、離子通道離子、離子通道細(xì)胞興奮細(xì)胞興奮生物電信號(hào)生物電信號(hào)細(xì)胞生理學(xué)細(xì)胞生理學(xué)膜的膜的“流動(dòng)鑲嵌模型流動(dòng)鑲嵌模型”細(xì)胞膜和離子學(xué)說建立（細(xì)胞膜和離子學(xué)說建立（Hodgkin，et al . 1946年年 ）磷脂雙層的磷脂雙層的屏蔽作用屏蔽作用Na-K 泵泵K+o Na+i離子通道 (ion channels)(ion channels) 離子通道是細(xì)胞膜上的一種特殊整合蛋白，對(duì)某離子通道是細(xì)胞膜上的一種特殊整合蛋白，對(duì)某些離子（些離子（K K+ +、NaNa+ +、CaCa2+2+等等）能）能選擇通透選擇通透，其功能是，其功能是細(xì)細(xì)胞生物電活動(dòng)胞生物電活動(dòng)的基礎(chǔ)。的基礎(chǔ)。 特性

3、：特性：通透性（permeation） 選擇性（selectivity） 門控性（gating） 研究技術(shù)：研究技術(shù)： 膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù)膜片鉗技術(shù)和分子克隆技術(shù) 配體門控通道配體門控通道 陽(yáng)離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體陽(yáng)離子通道：乙酰膽堿、谷氨酸、五羥色胺受體 陰離子通道：甘氨酸和陰離子通道：甘氨酸和氨基丁酸受體氨基丁酸受體 乙酰膽堿受體乙酰膽堿受體 電壓門控通道電壓門控通道：鉀、鈉、鈣離子通道鉀、鈉、鈣離子通道電壓門控鉀離子通道電壓門控鉀離子通道 環(huán)核苷酸門控通道環(huán)核苷酸門控通道 氣味分子與氣味分子與G蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，蛋白偶聯(lián)型受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)

4、化酶，產(chǎn)生產(chǎn)生cAMP，開啟，開啟cAMP門控陽(yáng)離子通道（門控陽(yáng)離子通道（cAMP-gated cation channel），引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)），引起鈉離子內(nèi)流，膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，最終形成嗅覺或味覺。沖動(dòng)，最終形成嗅覺或味覺。 機(jī)械門控通道機(jī)械門控通道 一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏一類是牽拉活化或失活的離子通道，另一類是剪切力敏感的離子通道，前者幾乎存在于所有的細(xì)胞膜，研究較多感的離子通道，前者幾乎存在于所有的細(xì)胞膜，研究較多的有血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及內(nèi)耳中的毛細(xì)胞等，后的有血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及內(nèi)耳中的毛細(xì)胞等，后者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞和心肌

5、細(xì)胞者僅發(fā)現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞 水通道水通道 2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)： Pete Agre、 Roderick MacKinnon2、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用、膜片鉗技術(shù)及其應(yīng)用3、離子通道藥理學(xué)、離子通道藥理學(xué) 1、細(xì)胞電生理學(xué)、細(xì)胞電生理學(xué)OUTLINE 電生理學(xué)研究簡(jiǎn)史： 二千年前，觀察到電鰩魚放電現(xiàn)象。 1825年，Nobili發(fā)明了電流計(jì)，用其證實(shí)了肌肉有電流存在。 1912年，Bridge 確定了AP的“全或無”現(xiàn)象。同年，Oxford提出了突觸的概念及反射弧的生理學(xué)研究，獲1932年Nobel獎(jiǎng)。 1937年，Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨大神經(jīng)軸突細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)

6、細(xì)胞內(nèi)電記錄，獲1963年Nobel獎(jiǎng)。 1946年，凌寧和Gerard創(chuàng)造拉制出尖端直徑小于1m的玻璃微電極，并記錄了骨骼肌的電活動(dòng)。玻璃微電極的應(yīng)用使的電生理研究進(jìn)行了革命性的變化。 Voltage clamp（電壓鉗技術(shù)）由Cole和Marmont 發(fā)明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正開始了定量研究，建立了HH模型（膜離子學(xué)說),是近代興奮學(xué)說的基石。 1948年，Katz利用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)記錄到了終板電位；1969年，又證實(shí)NM接觸后的Ach以“量子式”釋放，獲1976年Nobel獎(jiǎng)。 1976年，德國(guó)的Neher和Sakmann發(fā)明Patch Clamp（膜片鉗）。

7、并在蛙橫紋肌終板部位記錄到乙酰膽堿引起的通道電流。 1980年，Sigworth、 Hamill、Neher等在記錄電極內(nèi)施加負(fù)壓吸引，得到了10100 G的高阻封接(giga seal)，大大降低記錄噪聲，實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜電位又記錄單通道電流。獲1991年Nobel獎(jiǎng)。History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens應(yīng)用電壓鉗(Voltage clamp)在研究神經(jīng)軸突膜對(duì)鉀離子通透性時(shí)發(fā)現(xiàn)，放射性鉀跨軸突膜的運(yùn)動(dòng)很像是通過許多狹窄空洞的運(yùn)動(dòng)，并提出了“通道”的概念。 1963年，描述電壓門控動(dòng)力學(xué)的Hodgkin-Huxley模型（簡(jiǎn)稱

8、H-H模型），榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎(jiǎng)。 1976年，Neher和Sakmann建立膜片鉗(Patch clamp)技術(shù)。 1983年10月，Single-Channel Recording一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。 1991年， Neher和Sakmann的膜片鉗技術(shù)榮獲諾貝爾醫(yī)學(xué)/生理學(xué)獎(jiǎng)。1963年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑神經(jīng)細(xì)胞膜的周邊和中央部分與興奮和抑制有關(guān)的離子機(jī)制制有關(guān)的離子機(jī)制艾克爾斯艾克爾斯Sir John Carew Eccles澳大利亞澳大利亞澳大利亞國(guó)家大學(xué)澳大利亞國(guó)家大學(xué)1903年年-1997年年 霍奇金霍奇金A

9、lan Lloyd Hodgkin英國(guó)英國(guó)英國(guó)劍橋大學(xué)英國(guó)劍橋大學(xué)1914年年-1998年年赫克斯利赫克斯利Andrew Fielding Huxley英國(guó)英國(guó)英國(guó)倫敦大學(xué)英國(guó)倫敦大學(xué)1917年年-The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991) Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr Biophysikalisc

10、he Chemie, Goettingen, Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr medizinische Forschung, Heidelberg, Federal Republic of Germany b. 1944b. 1942膜片鉗技術(shù) 膜片鉗技術(shù)：從一小片(約幾平方微米) 膜獲取電子學(xué)方面信息的技術(shù)，即保持跨膜電壓恒定電壓鉗位，從而測(cè)量通過膜離子電流大小的技術(shù)。通過研究離子通道的離子流， 從而了解離子運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等信息。基本原理 利用負(fù)反饋電子線路,將微電極尖端所吸附的一個(gè)至幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜的電位固定在一定水

11、平上,對(duì)通過通道的微小離子電流作動(dòng)態(tài)或靜態(tài)觀察,從而研究其功能。 膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)膜電位固定的關(guān)鍵是在玻璃微電極尖端邊緣與細(xì)胞膜之間形成高阻（ 10 ）密封,使電極尖端開口處相接的細(xì)胞膜片與周圍環(huán)境在電學(xué)上隔離,并通過外加命令電壓鉗制膜電位。 由于玻璃微電極尖端管徑很小,其下膜面積僅約12,離子通道數(shù)量很少,一般只有一個(gè)或幾個(gè)通道,經(jīng)這一個(gè)或幾個(gè)通道流出的離子數(shù)量相對(duì)于整個(gè)細(xì)胞來講很少,可以忽略,也就是說電極下的離子電流對(duì)整個(gè)細(xì)胞的靜息電位的影響可以忽略,那么,只要保持電極內(nèi)電位不變,則電極下的一小片細(xì)胞膜兩側(cè)的電位差就不變,從而實(shí)現(xiàn)電位固定。膜片鉗技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 膜片鉗技術(shù)實(shí)現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻

12、封接的形成，由于高阻封接使背景噪聲水平大大降低，相對(duì)地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外,它還具有良好的機(jī)械穩(wěn)定性和化學(xué)絕緣性。而小片膜的孤立使對(duì)單個(gè)離子通道進(jìn)行研究成為可能。膜片鉗記錄的各種模式 根據(jù)膜片與電極之間的關(guān)系，可將膜片記錄主要分為種模式 。首先建立的單通道記錄法（Single channel recording）是細(xì)胞吸附式，其后又建立了膜內(nèi)面向外和膜外面向外的模式；還有一種是全細(xì)胞記錄法（hole cell recording）的全細(xì)胞式?，F(xiàn)在又發(fā)展了開放的細(xì)胞吸附式膜內(nèi)面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式 ，以及穿孔膜片的模式。細(xì)胞吸附膜片(cell-attached pat

13、ch mode) 一種將微電極吸附在細(xì)胞膜上對(duì)單離子通道電流進(jìn)行記錄的模式。優(yōu)點(diǎn)是不破壞細(xì)胞的完整性, 內(nèi)環(huán)境保持正常。缺點(diǎn)是不能人為直接地控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境條件，不能確切判明細(xì)胞內(nèi)電位。即使在浴液中加入刺激物質(zhì)，也不能到達(dá)與電極內(nèi)液接觸的膜片的細(xì)胞外面。但是，如果膜片離子通道對(duì)浴液中的刺激物有反應(yīng)，則可以說明這種刺激物是經(jīng)過某些細(xì)胞內(nèi)第二信使的介導(dǎo)間接地起作用。內(nèi)面向外膜片(inside-out patch) 在細(xì)胞吸附模式高阻封接形成后,將微管電極提起,使吸附的膜片從胞體上被切割下來，就得到“內(nèi)面向外”膜片。此種模式，可直接且自由地經(jīng)浴液介導(dǎo)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液的條件，并可在和細(xì)胞活動(dòng)無關(guān)的形式下觀

14、察到單一離子通道的活動(dòng)。但是，由于胞質(zhì)滲漏，可能丟失某種通道調(diào)控因子，離子通道活動(dòng)出現(xiàn)run-down （或run-up）現(xiàn)象。全細(xì)胞記錄式(hole-cell recording) 在細(xì)胞吸附模式下繼續(xù)以負(fù)壓抽吸使電極管內(nèi)細(xì)胞膜破裂,電極胞內(nèi)液與胞內(nèi)液直接相通,而與浴槽液絕緣,這種形式記錄膜片以外部位的全細(xì)胞膜的離子電流。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄,或?qū)⒉９苓B到標(biāo)準(zhǔn)高阻微電極放大器上記錄。外面向外膜片(outside-out patch) 在全細(xì)胞模式上將微管電極向上提起,可得到切割分離的膜片，斷端游離部分自行融合成脂質(zhì)雙層,此時(shí)高阻封接仍然存在。而膜外側(cè)

15、面接觸浴槽液。用這種模式，可自由改變細(xì)胞外液的情況下，記錄單一離子通道的電流活動(dòng)。開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)面向外模式（open cell-attached inside-out mode） 將細(xì)胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜進(jìn)行機(jī)械地破壞，經(jīng)破壞孔調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液，并在細(xì)胞吸附狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)面向外的單一離子通道記錄。這種方法的細(xì)胞體積越大，破壞部位離被吸附膜片越遠(yuǎn)或破壞孔越小，都可導(dǎo)致細(xì)胞因子外流變慢。穿孔膜片模式（perforated patch mode） 為克服全細(xì)胞模式的胞質(zhì)滲漏問題，Horn和Marty將與離子親和的制霉菌素（或二性霉素）經(jīng)膜片微電極灌流到含類甾醇的細(xì)胞膜片上，形成只允許一價(jià)離子

16、通過的孔，用此法在膜片上做很多導(dǎo)電性孔道借此對(duì)全細(xì)胞膜電流進(jìn)行記錄。因?yàn)榇四Ｊ降陌|(zhì)滲漏極為緩慢，局部串聯(lián)阻抗較全細(xì)胞模式高，所以鉗制速度很慢，故也稱為緩慢全細(xì)胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode) 穿孔膜片模式將電極向上提起，便在微電極尖端處形成一個(gè)膜囊泡（膜內(nèi)面向外膜片斷端融合封閉而成）。如果條件較好，此膜囊泡內(nèi)不僅有細(xì)胞質(zhì)因子還可有線粒體等細(xì)胞器存在。所以在有比較接近正常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞條件和代謝條件的基礎(chǔ)上，可能記錄到膜外面向外模式的單一離子通道。 過去認(rèn)為，膜片鉗只能在培養(yǎng)細(xì)胞或酶解的細(xì)胞上進(jìn)行，這樣得到的細(xì)胞膜表面比

17、較光滑，才能夠形成高阻封接，但缺點(diǎn)是組織的正常三維結(jié)構(gòu)被破壞，并且對(duì)神經(jīng)中樞內(nèi)突觸特有的傳遞機(jī)能的研究無法展開。于是，一些學(xué)者建立了組織切片膜片鉗技術(shù)（Slice patch），就能在哺乳動(dòng)物腦片制備上做全細(xì)胞記錄。組織切片膜片鉗技術(shù)（Slice patch） 1992年，在腦片膜片鉗技術(shù)上，美國(guó)Ferster 實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道在在體貓的視皮層用膜片鉗全細(xì)胞記錄研究了視刺激誘發(fā)的興奮性和抑制性突觸后電位相互影響及節(jié)律性膜電位的變化規(guī)律。 1993年，德國(guó)的Dodt和Sakmann合作，利用紅外電視顯微鏡監(jiān)視，使得膜片鉗記錄不但能夠在神經(jīng)元胞體及其樹突上進(jìn)行，而且可同時(shí)在這兩個(gè)不同的部位作膜片鉗記

18、錄。 為研究化學(xué)門控性通道性質(zhì)，我國(guó)學(xué)者秦達(dá)意采用 oil-gate concentration jump method，配合膜片鉗記錄和分析離子通道在各種化學(xué)條件下的開放與關(guān)閉以及激活與失活的動(dòng)態(tài)過程。膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用 分辨單通道電流,直接觀察通道的開閉過程; 區(qū)分離子通道的離子選擇性及其門控特性(如區(qū)分電壓、化學(xué)或門控性通道),發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型; 在記錄單個(gè)通道電流()和全細(xì)胞電流()的基礎(chǔ)上,可分別計(jì)算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)()和開方概率(),依公式=; 用以檢測(cè)某些遞質(zhì)能否打開通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的調(diào)控(內(nèi)面向外膜片); 研究腺苷酸環(huán)化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性變化,以及細(xì)胞膜上信使物質(zhì)二酰甘油花生四烯酸等對(duì)離子通道型受體的調(diào)節(jié)機(jī)制(應(yīng)用全細(xì)胞鉗或外面向外膜片); 研究受體的激活態(tài)、失活態(tài)和靜息態(tài)的功能； 研究不同離子強(qiáng)度對(duì)通道特性的影響及細(xì)胞內(nèi)信使物質(zhì)如1,4,5-三磷酸肌醇、環(huán)腺苷酸(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)、Ca2+等對(duì)離子通道型受體的調(diào)節(jié)機(jī)制(內(nèi)面向外膜片)。 研究藥物對(duì)電壓和化學(xué)內(nèi)控性通道的影響。 Neher等首創(chuàng)將膜片鉗技術(shù)與Fura 2 熒光測(cè)鈣技術(shù)結(jié)合,同時(shí)進(jìn)行如細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞膜離子通道電流及細(xì)胞膜電容等多指標(biāo)變化的快速交替測(cè)定,這樣便可得出同一事件過程中,多種因素