大腸菌群的檢測

1、大腸菌群的檢測大腸菌群的檢測大腸菌群的定義大腸菌群的定義: 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。 大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學方面的要求，提出的與糞便污染有關的細菌，即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致。根據(jù)進一步的生化試驗，可將這群細菌再分為大腸艾希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群基本形態(tài)：大腸菌群基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多

2、數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。實驗原理實驗原理 大腸菌群指一群能大腸菌群指一群能發(fā)酵乳糖發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需需氧和兼性厭氧氧和兼性厭氧的的革蘭氏陰性無芽孢桿菌革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，推斷食污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，推斷食品有否被腸道致病菌污染。品有否被腸道致病菌污染。 食品中大腸菌群以食品中大腸菌群以100ml 檢樣內大腸菌檢樣內大腸菌群最可能數(shù)（群最可能數(shù)（MPN）表示。表示

3、。實驗器材實驗器材 蒸汽滅菌物品：蒸汽滅菌物品： 1.乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基試管10支 2.9mL蒸餾水試管5支 干熱滅菌物體：干熱滅菌物體： 10mL移液管1支 1mL移液管5支實驗試劑實驗試劑乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨 20.0g 0.04%溴甲酚指示液25mL乳糖 10.0g 牛膽鹽5.0g 水1000mL除0.04%溴甲酚指示液外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節(jié)PH值為7.2-7.6，加入0.04%溴甲酚指示液，根據(jù)要求的用量分裝于含倒管的試管中，滅菌。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基大腸菌群及大腸桿菌測定 MPN法檢驗流程實驗內容與步驟實驗內容與步驟1）檢樣稀釋）檢樣稀

4、釋（無菌操作）無菌操作）將將25mL（或或g）檢樣置于含檢樣置于含225mL滅菌生理鹽水的滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用滅菌玻璃瓶，充分振搖（固體檢樣用勻漿器，用800010000r/min的速度處理的速度處理1 min）制成制成1：10的均的均勻稀釋液。勻稀釋液。用用1mL滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1：10稀釋液稀釋液1mL，注入含有注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內，混勻，制成滅菌生理鹽水的試管內，混勻，制成1 ：100的的稀釋液。稀釋液。另取另取1mL滅菌試管，按操作依次做滅菌試管，按操作依次做10倍遞增稀釋倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支液，每稀釋一次，換用一

5、支1 mL滅菌試管。滅菌試管。 2）乳糖發(fā)酵實驗）乳糖發(fā)酵實驗 接種接種1mL待檢樣品于乳糖膽鹽發(fā)酵管內。待檢樣品于乳糖膽鹽發(fā)酵管內。接種接種3個稀釋度，每一稀釋度接種個稀釋度，每一稀釋度接種3管，置管，置（36土土1)溫箱內培養(yǎng)（溫箱內培養(yǎng)（24士士2) h。如所有乳如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸桿糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸桿菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。3）分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉接在伊紅美藍將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉接在伊紅美藍瓊脂平板上，置（瓊脂平板上，置（36士士1)恒溫箱內培養(yǎng)恒溫箱內培養(yǎng)18一一24

6、 h。取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。氏染色和證實試驗。4）證實試驗證實試驗 在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1一一2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置（管，置（36士士1)恒溫箱內培養(yǎng)（恒溫箱內培養(yǎng)（24士士2) h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽袍桿菌，即可報告為大染色為陰性的無芽袍桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。腸菌群陽性。實驗報告實驗報告 根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表

7、，報告每檢索表，報告每100mL（或或g）大腸大腸菌群的菌群的MPN。革蘭氏染色革蘭氏染色 基本原理：基本原理： 革蘭氏染色的機理主要是利用兩類細菌的細胞壁成分和結構的不同。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多的類脂質，而肽聚糖的含量較少。當用酒精或丙酮酸脫色時，類脂質被溶解，增加了細胞壁的通透性，使初染后的結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細胞被脫色，經(jīng)復染后，又染上復染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細胞仍保留初染時的顏色。步驟：結果: 陽性菌陽性菌紫色紫色 陰性菌陰性菌紅色紅色結晶紫初染碘液媒染乙醇

8、脫色蕃紅復染涂片固定革蘭氏染色法（革蘭氏染色法（Gram Stain）革蘭氏染色革蘭氏染色法操作步驟法操作步驟1、涂片涂片：取大腸桿菌制成涂片，干燥，固定。：取大腸桿菌制成涂片，干燥，固定。2、染色染色：用草酸銨結晶紫染色：用草酸銨結晶紫染色1min , ,用水沖洗。用水沖洗。3、媒染媒染：滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆：滴加革蘭氏碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋蓋1min，用水沖去碘液。用水沖去碘液。4、乙醇脫色乙醇脫色：斜置載玻片于一燒杯上，滴加：斜置載玻片于一燒杯上，滴加95%乙乙醇，并輕輕搖動載片，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色時停醇，并輕輕搖動載片，至乙醇液不呈現(xiàn)紫色時停止（約止（約0.5min）

9、。）。立即用水沖凈乙醇并用濾紙輕立即用水沖凈乙醇并用濾紙輕輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關鍵，必須嚴格掌輕吸干。脫色是革蘭氏染色的關鍵，必須嚴格掌握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染握乙醇的脫色程度。若脫色過度則陽性菌被誤染為陰性菌；而脫色不夠時陰性菌被誤染為陽性菌。為陰性菌；而脫色不夠時陰性菌被誤染為陽性菌。5、復染復染：蕃紅染液復染：蕃紅染液復染1min ,水洗。水洗。6、吸干并鏡檢吸干并鏡檢：若研究工作中要確證未知：若研究工作中要確證未知菌的革蘭氏反應時，則需同時用已知菌進菌的革蘭氏反應時，則需同時用已知菌進行染色作對照。行染色作對照。 細菌經(jīng)細菌經(jīng)結晶紫結晶紫初染染成初染染成紫色紫色。 革蘭氏染色陽性菌革蘭氏染色陽性菌（G+）細胞壁肽聚糖層數(shù)多，細胞壁肽聚糖層數(shù)多，為空間網(wǎng)狀結構，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結構更為致為空間網(wǎng)狀結構，再經(jīng)乙醇脫水，網(wǎng)狀結構更為致密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為密，染料復合物不易從細胞內漏出，仍為紫色紫色。 革蘭氏染色陰性菌革蘭氏染色陰性菌