細胞培養(yǎng)考試重點整理

1、第一章 緒論體外培養(yǎng)（in vitro culture）：是將活體結(jié)構(gòu)成分（如活體組織、活體細胞或活體器官等）甚或活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下使之存活和生長發(fā)育的方法。 按照體外培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)成分，可將體外培養(yǎng)人為分為： 組織培養(yǎng)（tissue culture）指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養(yǎng)的方法。 細胞培養(yǎng) （cell culture）指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養(yǎng)的方法。 器官培養(yǎng) （organ culture）指從生物體內(nèi)取出活的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或者器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。單

2、一化現(xiàn)象 組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)組織不能在體外長期維持其結(jié)構(gòu)和功能，培養(yǎng)的時間長，經(jīng)過反復(fù)傳代，細胞出現(xiàn)單一化現(xiàn)象趨向單一類型的細胞最終成為細胞培養(yǎng)。體內(nèi)培養(yǎng)（in vivo culture)：將活體結(jié)構(gòu)成分（如活體組織、活體細胞、活體器官等）甚至活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在其他生物體內(nèi)讓其生長和發(fā)育的方法。最常見的體內(nèi)培養(yǎng)方式就是移植（trans-plantation）。體外培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)立代表性的人或者實驗Harrison的工作，較為完善地建立了體外培養(yǎng)活體組織的培養(yǎng)體系，第一次較為系統(tǒng)地觀察了體外培養(yǎng)活體組織的結(jié)果。被公認為是體外培養(yǎng)技術(shù)的的開始。標(biāo)志著體外培養(yǎng)技術(shù)的創(chuàng)立，標(biāo)志著蓋玻片

3、懸滴培養(yǎng)法的建立，標(biāo)志著神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的開始，也標(biāo)志著神經(jīng)突起是由神經(jīng)細胞長出的這一重大理論的誕生。Carrel對體外培養(yǎng)的貢獻： 將無菌操作觀念引入體外培養(yǎng)過程中。 將培養(yǎng)組織包埋技術(shù)、營養(yǎng)供應(yīng)以及繼續(xù)培養(yǎng)（也稱傳代或繼代培養(yǎng)）等許多重要的培養(yǎng)條件和方法引入蓋玻片懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)，從而完善了Harrison的方法。 發(fā)現(xiàn)雞胚浸液能明顯地促進多種細胞的體外生長。 設(shè)計卡氏培養(yǎng)瓶減少了污染，擴大了細胞生存空間?，F(xiàn)在一般認為體外培養(yǎng)技術(shù)是從Harrison和Carrel真正開始的。兩位美國科學(xué)家和最先試用已知成分的合成培養(yǎng)基取代不能準(zhǔn)確確定其成分的天然培養(yǎng)基，由于他們和其它許多科學(xué)家在此后30多年的

4、努力，最終發(fā)展出許多合成培養(yǎng)基?，F(xiàn)代組織培養(yǎng)的三個階段：第一階段 懸滴培養(yǎng)第二階段 單層培養(yǎng)第三階段 三維培養(yǎng)（立體培養(yǎng)）現(xiàn)代組織培養(yǎng)的重要標(biāo)志： 培養(yǎng)液的改變 培養(yǎng)容器的改變 培養(yǎng)方法的改進：液體培養(yǎng)基的應(yīng)用; 單細胞分離培養(yǎng)法 細胞培養(yǎng)用的多種材料都已商品化、規(guī)范化和系列化。 低溫冷凍技術(shù)的應(yīng)用，可將已建立的多種細胞系和細胞株長期凍存。 細胞培養(yǎng)技術(shù)更加廣泛地用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究.對體外培養(yǎng)技術(shù)的評價 能長時間直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動，是多學(xué)科進行科學(xué)研究的對象和工具，如細胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等。 供研究的細胞種類極為廣泛，從低等生物到人，或正常組織或腫瘤組織細胞，而且便

5、于記錄（通過攝影、閉路電視和攝電影等方式） 易施加理化因素和生物因素進行實驗研究。如研究某種實驗因素對細胞的生物學(xué)作用 ，只需在培養(yǎng)液中有針對性地加入或刪除該成分即可。 可同時方便獲得大量細胞類型單一、細胞周期同步、生物學(xué)性狀基本相同并對實驗因素反應(yīng)一致的細胞群。能夠進行大規(guī)模生物制品的生產(chǎn)。利用體外培養(yǎng)技術(shù)可以大量繁殖動物細胞或微生物以生產(chǎn)生物制品。 與體內(nèi)環(huán)境相比，體外培養(yǎng)細胞在一定程度上失去了組織聯(lián)系及相互作用，缺乏在體內(nèi)時的血運和神經(jīng)體液調(diào)節(jié)作用，因此不能將體外實驗結(jié)果一并推至體內(nèi)，即不能輕易下結(jié)論。組織培養(yǎng)常用術(shù)語Anchorage-dependent cells or cultur

6、es（貼壁依賴性細胞或培養(yǎng)物）：體外培養(yǎng)的細胞只有貼附在不起化學(xué)作用的物體的表面時才能生長、生存或維持功能。Apoptosis（細胞凋亡）：是指細胞內(nèi)死亡程序的啟動而導(dǎo)致細胞自殺的過程，因此也常稱為程序性細胞死亡（programmed cell death)。細胞凋亡與機體正常發(fā)育、形態(tài)形成以及多余細胞的清除等生理過程密切相關(guān)，所以被認為是一種積極的生理性死亡。Cell culture（細胞培養(yǎng)）：細胞在體外條件下的生長。Cell fusion（細胞融合）：體外培養(yǎng)條件下，經(jīng)化學(xué)試劑、病毒或物理方法誘發(fā)，使同種或不同種的2個或2個以上體細胞融合產(chǎn)生雜交細胞的過程。cell generation

7、 time（細胞一代時間）：是指單個細胞兩次連續(xù)分裂的時間間隔。可借助顯微鏡電影照相術(shù)來精確確定。cell line（細胞系）：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成為細胞系。Clone（克隆）：單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體，他們的遺傳特性相同。Confluence（匯合）：指在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細胞彼此匯合形成單層，注意與細胞融合的區(qū)別。Contact inhibition（接觸抑制）：當(dāng)一個貼壁生長的體外正常細胞生長至與另一個細胞相互接觸時，便停止了分裂增殖，相互雖然緊密接觸，但不形成交叉重疊生長，也不再進入S期。HeLa cell 來源于子宮頸癌組織（美國黑人婦女Henrietta Lac

8、ks）的上皮細胞系，為體外最早建立的人類癌細胞系。In vitro malignant transformation（體外惡性轉(zhuǎn)化）：細胞在體外培養(yǎng)過程中獲得了致瘤性，當(dāng)把這種細胞接種于適當(dāng)?shù)膭游铮梢援a(chǎn)生腫瘤，即異種動物接種致瘤實驗。In vitro transformation （體外轉(zhuǎn)化）：細胞在體外培養(yǎng)過程中發(fā)生與原代細胞形態(tài)、抗原、增殖或其他特性的可遺傳的變化，但不一定具有致瘤性。Minimal medium(最低限度培養(yǎng)基)：能滿足大多數(shù)細胞生長增殖需要的最簡單的培養(yǎng)基。Organ culture（器官培養(yǎng)）：是指維持整個器官或器官的一部分在體外生存和生長，并一定程度上保持原來的結(jié)

9、構(gòu)和功能的方法。Passage（Subculture，傳代或傳代培養(yǎng)）：將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到更多培養(yǎng)瓶的過程。Primary culture（原代培養(yǎng)）：是指直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。Saturation density（飽和密度）：在特定條件下，培養(yǎng)容器能達到的最高細胞數(shù)，當(dāng)細胞達到飽和密度后細胞群體停止增殖。在貼壁培養(yǎng)中以每平方厘米的細胞數(shù)表示，而懸浮生長的細胞則以每立方厘米的細胞數(shù)表示。Suspension culture（懸浮培養(yǎng)）：細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖的一種培養(yǎng)方法。Tissue culture （組織培養(yǎng)）：組織在體外條件下保存或生長。借此組織

10、結(jié)構(gòu)或功能得以在體外保持，亦可能在體外維持其分化。Transfection （轉(zhuǎn)染）：用生物學(xué)的、物理的或化學(xué)的方法將目的基因轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)細胞內(nèi)的實驗方法。Lipofectin：一種常用的細胞轉(zhuǎn)染試劑，用該試劑包裹DNA可形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，再通過細胞膜融合可將DNA轉(zhuǎn)染入哺乳動物細胞。Cell cycle：指細胞從前一次分裂結(jié)束開始至本次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時相過程。分4個時期，即DNA合成期（S期）、有絲分裂期（M期）、有絲分裂完成至DNA合成開始的間隙期（G1期）以及DNA復(fù)制結(jié)束至有絲分裂開始的間隙期（G2）。若某種原因細胞不再沿細胞周期運行，而進入休眠狀態(tài)稱為G0期。細胞株（cell

11、 strain）：是由具有某些特性與標(biāo)志的細胞選擇或克隆化而派生的亞系，這些特性或標(biāo)志在爾后的培養(yǎng)中必須保持下去。惡性轉(zhuǎn)化（malignant transformation）：不受時間或空間的控制向正常組織侵襲能力的形成，也可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性生長。群體密度（population density）：培養(yǎng)器皿內(nèi)，每單位面積或體積中的細胞數(shù)，多用細胞數(shù)/cm2表示。Stem cell（干細胞）：具有繼續(xù)增殖與分化潛能的細胞，其中胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC)可形成機體所有各種類型的組織和細胞，甚至發(fā)育成一個完整的胚胎，故又稱全能性（totipotency）干細胞。隨著細胞分化

12、，這種分化潛能逐漸受到局限，只能分化形成有限細胞類型的細胞稱為多能性(multipotency)干細胞，最終成為單能干細胞（Monopotency stem cell )或定向干細胞(directional).第二章 體外細胞培養(yǎng)的基本要求體外培養(yǎng)的生存條件一、嚴(yán)格的無污染（無菌無毒）環(huán)境無化學(xué)物質(zhì)污染無微生物污染無對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（抗體、補體等）二、合適的生存環(huán)境恒定適宜的溫度 人和動物（哺乳）培養(yǎng)細胞適合溫度是3537，鳥類細胞溫度要求較高，為38.5。 細胞對低溫的耐受比高溫的耐受強。 培養(yǎng)細胞置4下數(shù)小時后，恢復(fù)到37細胞仍能良好生長。 低溫冷凍技術(shù)可長期保存細胞。

13、氣相環(huán)境 細胞生存所需的氣體主要有O2和 CO2 多數(shù)細胞缺O(jiān)2不能生存，但高氧環(huán)境對細胞毒性作用較大。 CO2主要維持培養(yǎng)液的PH，細胞代謝產(chǎn)生的CO2，釋放至培養(yǎng)液使培養(yǎng)液變酸。為維持培養(yǎng)液PH值的恒定，常在培養(yǎng)用液中加入NaHCO3。 PH 多數(shù)細胞適宜的PH為7.27.4，細胞耐酸比耐堿強，在偏酸性環(huán)境中更有利于生長。液相環(huán)境（滲透壓）： 指各種平衡鹽溶或培養(yǎng)液的等滲狀態(tài)，細胞必須生活在等滲的環(huán)境中，不同細胞的理想滲透壓不同。人血漿滲透壓約290mOsm/kg，可視為培養(yǎng)人體的理想滲透壓。對大多數(shù)哺乳類動物細胞，滲透壓在260320mOsm/kg的范圍均適宜。三、合適的營養(yǎng)條件營養(yǎng)成分

14、：與體內(nèi)基本相同，主要包括： 1. 氨基酸 所有細胞都需要以下12種必需氨基酸：精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸，這些氨基酸均為型。 此外，所有細胞都需要谷氨酰胺，谷氨酰胺在細胞代謝過程中具有重要作用，所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的來源，也是合成磷酸腺苷所需的基本物質(zhì)。 2. 單糖 主要為六碳糖，是細胞代謝的能量來源，也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料，細胞對各種糖的吸收能力不同，葡萄糖最高，半乳糖最低。 3. 無機離子與微量元素：基本元素和微量元素，非培養(yǎng)液固定成分，實驗研究中，通常加入不同微量元素，觀察對培養(yǎng)細胞的影響。

15、 4. 維生素：在細胞代謝過程中主要扮演輔酶、輔基的作用，必不可少。 促生長因子及激素：主要來源于血清，對于維持細胞功能、保持細胞狀態(tài)十分重要。各種生長因子的作用明顯并具有特異性，激素類物質(zhì)也具有促進細胞生長增殖的作用。 促細胞貼附物質(zhì)：體外貼附型細胞在生長過程中，多需要促細胞貼附物質(zhì)，不同種類的促細胞貼附物質(zhì)具有不同的促細胞貼附特性。水和平衡鹽溶液培養(yǎng)用水：體外培養(yǎng)細胞對水質(zhì)特別敏感，對水的純度要求較高。常用的BSS是Hanks液和Earle液： Hanks：NaHCO3量較少，緩沖能力較弱，宜利用空氣平衡。 Earle液：含有高濃度NaHCO3，緩沖能力較強，需用5%CO2維持平衡。 注意

16、：配制離散細胞用的消化液和細胞洗滌液時，宜采用無Ca 2+、Mg 2+的D-Hanks液血清的種類： 牛血清：胎牛血清 剖宮產(chǎn)的胎牛 新生牛血清 出生24h內(nèi) 小牛血清 出生10-30天 人血清、馬血清 雞血清、兔和羊血清（同種細胞的特殊培養(yǎng)） 單牛血清、混合血清血清使用中注意的問題： 血清中補體成分對某些細胞有毒性作用，應(yīng)56，30 min滅活。 血清長期保存應(yīng)在-20以下。 分裝成小瓶使用，避免反復(fù)凍融。 使用濃度： 合成培養(yǎng)基不加血清能維持細胞短期生存 維持液（25%血清） 細胞生長液（1020%血清） 不明成分對分析實驗結(jié)果增加了困難 無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用。體外培養(yǎng)基 是根據(jù)細胞在體內(nèi)生

17、存的條件，將細胞體外生長所需物質(zhì)的種類按一定量嚴(yán)格配制而成。DMEM（Dulbeccos modified Eagles medium）：為諾貝爾獎金獲得者Dulbecco R.改良的Eagle培養(yǎng)基，多用于哺乳動物與人細胞系的培養(yǎng)。分為高糖型和低糖型。RPMI-1640：最初是由Moor等為小鼠白血病細胞培養(yǎng)而設(shè)計，開始的配方特別適合懸浮細胞的生長，主要針對淋巴細胞，經(jīng)幾次改良，從RPMI-1630、RPMI-1634，最后至RPMI-1640。其組分較為簡單，后來發(fā)現(xiàn)適用于多種細胞的生長，如腫瘤細胞或正常細胞、原代細胞或傳代培養(yǎng)的細胞，是目前應(yīng)用最為廣泛的培養(yǎng)基之一。無血清培養(yǎng)基（Seru

18、m free medium，SFM）：不需要添加血清就可維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。 使用方法：細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基需要一個過程，在逐步降低血清的過程中要注意觀察是否發(fā)生變化，是否有部分細胞發(fā)生死亡。注意觀察存活細胞是否保持原有的生物學(xué)特性。細胞在轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)之前應(yīng)保存種細胞，按常規(guī)培養(yǎng)與含血清培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。胰蛋白酶溶液 pH8.0，37時作用能力最強（注意調(diào)整pH）。用D-Hanks液配制，因鈣、鎂離子可降低其活性。 熱消化 37 1h 0.25% 冷消化 4 1220h 0.125%EDTA溶液（Versen液）配置時應(yīng)使用用無Ca2+、Mg

19、2+液體溶解，高壓蒸汽滅菌，4保存。pH調(diào)整液：NaHCO3。附著底物：細胞貼附在底物上生長的性質(zhì)呈錨著依賴性。凡對細胞無毒性的物質(zhì)都可用作底物。常用附著底物如下：（一）玻璃 最常用（二）一次性塑料：（三） 微載體：（由聚苯乙烯或聚丙烯酰氨制成的小球體，附著面大，利于大量繁殖細胞）（四） 飼細胞（Feeder cells）：也稱滋養(yǎng)細胞，通常成纖維細胞或其他細胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細胞失去增殖能力，但仍能存活并有代謝活動?？勺鳛橹С治?，然后接種上其他細胞，飼細胞的代謝產(chǎn)物利于其他細胞生長，用于某些特殊難培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱，可恒定地提供一定濃度的CO2（2%5%），維持培

20、養(yǎng)液較穩(wěn)定的pH值，采用NaHCO3- CO2緩沖系統(tǒng)。應(yīng)用CO2培養(yǎng)箱須注意： 維持一定的CO2濃度 保證開放式培養(yǎng)（通氣） 定期消毒（內(nèi)置紫外燈、酒精） 一定的濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)第三章 體外培養(yǎng)細胞生物學(xué)體內(nèi)、外細胞的增殖方式相同，均依賴于有絲分裂，其差異的關(guān)鍵在于細胞的分化，細胞分化是檢測細胞差異的核心問題。細胞離體的變化 1不適應(yīng)：表現(xiàn)為細胞原有的分化特性減弱或不顯。是因生存條件的改變使分化發(fā)生抑制。 2. 去分化或脫分化（Dedifferentiation):即細胞失掉發(fā)生分化的能力?？赡苁腔蜃儺愃?。 3體外培養(yǎng)細胞具有分化潛能。很多細胞仍呈現(xiàn)一定程度的分化表達現(xiàn)象。與體內(nèi)條件

21、越近似，細胞越易發(fā)生分化。 4細胞離體培養(yǎng)時間越長，分化能力越弱，二者呈反向關(guān)系。 5細胞惡變的本質(zhì)是細胞增殖和分化調(diào)控的失控，誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生分化是癌細胞逆轉(zhuǎn)的表現(xiàn)。體外培養(yǎng)細胞的形態(tài)學(xué) 與體內(nèi)細胞基本相同，形態(tài)趨化單一化，依據(jù)大體形態(tài)可分為： 1懸浮型 2貼附型體外培養(yǎng)細胞的增殖能力 體外培養(yǎng)細胞的兩大生命特征是分化增殖和生長發(fā)育。 1培養(yǎng)細胞的增殖能力一般與該種細胞在體內(nèi)的增殖能力相仿。 2胚胎細胞成年組織細胞。 3高度分化的細胞通常增殖能力較弱。 4惡性腫瘤細胞可在體外無限傳代。體外培養(yǎng)細胞的 生長類型一、貼附型細胞：1成纖維細胞型：2上皮型細胞：起源于內(nèi)胚層和外胚層的細胞，體外培養(yǎng)時都

22、可呈現(xiàn)上皮型。如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等組織。 上皮型細胞的三個形態(tài)學(xué)特征：呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞緊密相連成單層膜，細胞增殖數(shù)量多時，生長時整塊膜隨之移動；處于上皮膜邊緣的細胞多與膜相連，很少脫落細胞群單獨活動?！颁伮肥瘶印保杭毎o密排列時，細胞呈多角形或六角形； “拉網(wǎng)現(xiàn)象”（Netting）：在構(gòu)成上皮細胞膜狀生長的細胞群中一些細胞常相互分離卷曲，致使上皮細胞膜中形成網(wǎng)眼狀空洞?？赡芘c細胞分泌透明質(zhì)酸酶有關(guān)。3 游走型細胞： 如單核巨噬細胞系統(tǒng)的細胞，如淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞以及某些腫瘤細胞屬之。二、懸浮型細胞傳代（passage）：細胞增殖

23、達到一定密度時，需要分離出部分細胞并更換新營養(yǎng)液，適應(yīng)細胞的繼續(xù)生長和增殖，這一過程稱為傳代。原代培養(yǎng)期（primary culture）即初代培養(yǎng)，是指從活體內(nèi)取出組織細胞開始體外培養(yǎng)到第1次進行傳代之前的時期，一般持續(xù)14周。 特點： 1細胞群是異質(zhì)性的（heterogeneous），即各細胞的遺傳性狀互不相同，相互依存性強。 2細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛，細胞的結(jié)構(gòu)和功能與體內(nèi)仍很相似。 3克隆形成率低 4. 多呈二倍體核型。 5. 是檢測藥物很好的實驗對象。永生性（也稱不死性）或惡性性， 即細胞獲得持久增殖能力，稱無限細胞系（Infinite cell line）或連續(xù)細

24、胞系（Continuous cell line）。二倍體細胞系：正常細胞在培養(yǎng)條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，這種細胞稱二倍體細胞系（Diploid cell line）。細胞“一代”指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，是細胞培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，與細胞倍增一代的含義不同。 在細胞一代中，細胞能倍增36次。細胞傳“一代”，通常經(jīng)歷三個階段：1. 潛伏期(latent phage)：2. 指數(shù)增生期：3. 停滯期：指數(shù)生長期內(nèi)細胞分裂相數(shù)量（即細胞增殖活性）可以作為判斷細胞生長是否旺盛的重要標(biāo)志。一般以細胞分裂指數(shù)（Mitotic Index，MI）和細胞群體倍增時間表示

25、。 MI即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。 細胞群體倍增時間是指培養(yǎng)物中細胞數(shù)量翻倍的平均時間。一般細胞的MI約為0.1%0.5%；原代培養(yǎng)物的MI比傳代培養(yǎng)物的MI低；連續(xù)細胞系和腫瘤細胞的MI較高，可達3%5%（腫瘤細胞偏高）。接觸抑制（Contact inhibition）：正常細胞指數(shù)增生期持續(xù)35天，細胞相互接觸能抑制細胞進一步的運動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制，彼此連接成片，生長面積消失。而惡性細胞無接觸抑制現(xiàn)象，可繼續(xù)移動和增殖，細胞向三維空間運動，發(fā)生細胞堆積（piled up），因此接觸抑制可作為區(qū)別正常細胞和癌細胞的標(biāo)志之一。密度抑制（Density inhibition）

26、：細胞發(fā)生接觸抑制后，只要營養(yǎng)充分，仍能進行增殖分裂，但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。永生化和惡變(immortalization and malignancy)：前者也稱不死性，是細胞獲得體外持續(xù)生長增殖能力的特性，可惡變；后者指細胞不僅能無限增殖生長，而且具有異體接種致瘤性。兩者是細胞兩種不同的性狀。群體依賴性(PD，Population Dependence) 單個細胞不是細胞永久存在的形式，不能長期生存。一個有活力的細胞終需經(jīng)過繁殖形成群體，只有群體細胞才是培養(yǎng)細胞的基本存在形式。單個細胞雖能生

27、長繁殖，但不如群體細胞生存能力強，細胞量多時比少時易于培養(yǎng)，說明細胞之間能相互溝通信息，呈現(xiàn)著相互依存性或群體依賴性。（正常細胞群PD比轉(zhuǎn)化細胞大，轉(zhuǎn)化細胞和惡性細胞PD小，即PD與細胞惡性成反比關(guān)系，惡性細胞獨立生存能力增大。）提高細胞在體外培養(yǎng)的成功率的關(guān)鍵在于初代培養(yǎng)。影響培養(yǎng)成功的因素：一、供體年齡 1成活率，胚胎幼年成年。 2同一個體的組織，分化低的組織細胞高分化的組織細胞。 3組織細胞的異質(zhì)性，個別細胞優(yōu)勢生長 4干細胞非干細胞。二、培養(yǎng)條件 1不同細胞對培養(yǎng)基需求不同，應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基，尤其是正常細胞。 2無限細胞系和腫瘤細胞系適應(yīng)性強，可在各種培養(yǎng)基中生存。三、貼附底物 1貼

28、附細胞：貼附是細胞增殖生長的條件， 只有細胞貼附到底物上才能增殖，初代培養(yǎng)尤為重要。不同細胞對附著底物要求不同。 2 一旦成為細胞系后，多能順利貼壁。（ 特殊細胞培養(yǎng)，如：神經(jīng)元鼠尾膠原處理，乳腺上皮、大腸上皮細胞飼細胞）四、培養(yǎng)方法（酶的應(yīng)用） 不同消化分散組織的方法對細胞的貼壁和生長增殖有影響，膠原纖維多的組織用膠原酶消化，上皮細胞適用胰蛋白酶消化。選擇適宜消化法和培養(yǎng)法是培養(yǎng)成功不可忽視的條件。已鑒定的細胞（Certified Cells） 各種已被命名Cell line和經(jīng)過細胞生物學(xué)鑒定Cell Strain具有以下特征：形態(tài)均一；生長增殖穩(wěn)定；生物學(xué)性狀清楚，即已鑒定的細胞（Cer

29、tified Cells），可用于各種實驗研究和生產(chǎn)生物制品。細胞克?。簭囊粋€經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞克隆。NIH3T3（小鼠胚胎成纖維細胞）：美國國立衛(wèi)生研究所建立，每3天傳代一次，每次接種3105cells/ml。 高溫濕熱滅菌 以壓力蒸汽滅菌最為常用，壓力蒸汽滅菌器消毒好的物品應(yīng)注意烘干。第五章 細胞培養(yǎng)技術(shù)幾種組織分離方法 1離心分離法：適用于血液、羊水、胸腹水等細胞的培養(yǎng)。 2切割分離法：用眼科剪或手術(shù)刀。 組織塊培養(yǎng)時，剪切成1mm3大小的組織塊，所取組織多為1cm3，注意用Hanks液漂洗。 3機械分散法：適用于軟組

30、織（如腦組織、胚胎 及一些腫瘤組織等） 壓擠法，用注射器粉碎組織。 不銹鋼篩網(wǎng)（1mm、100m、20m網(wǎng)眼） 鈍物壓取法 僅適用于處理軟組織。 4消化分散法：在組織剪切成較小體積基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進一步分散組織的方法最終使被處理的組織分散成細胞團或單個細胞制成細胞懸液進一步培養(yǎng)。細胞容易生長增殖。 根據(jù)組織的不同，可選用特定的消化手段。（1） 胰蛋白酶消化法： Ca2+、Mg2+對胰蛋白酶的活性有一定的抑制作用，故需用D-Hanks液配制。血清可抑制胰蛋白酶的活性，因此細胞傳代時，用胰蛋白酶消化細胞后，不必用Hanks沖洗。 使用濃度0.01%-0.5%，以0.25%最常用，pH8-

31、9 兩種消化方法 溫消化：37，1h 冷消化：4 ，1220h（2）膠原酶（Collagenase）消化法： Collagenase是一種由細菌提取出的酶，適用消化纖維組織、癌組織和上皮組織。消化作用緩和，無需振蕩。 (3) EDTA消化法：EDTA消化細胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，血清對其無中和作用，而培養(yǎng)環(huán)境中殘留的EDTA對細胞生長有不良影響。 Trypsin Collagenase 消化特性 適應(yīng)于消化軟組織 消化纖維多的組織使用濃度 0.010.5% 0.10.3mg/ml消化時間 0.52h 112hpH 89 6.57.0作用強度 強烈 緩和細胞影響 時間過長有影響 無大

32、影響血清抑活 有 無Ca2+和Mg2+ 有影響 無影響 細胞凍存的基本原理不附加任何條件下，直接凍存細胞時，細胞內(nèi)外環(huán)境的水會結(jié)成冰晶， 能導(dǎo)致細胞發(fā)生一系列變化，如機械損傷、電解質(zhì)升高，滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質(zhì)變性等 細胞死亡。如向細胞培養(yǎng)液中加入保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前滲出細胞外，避免細胞損傷。細胞凍存的原則 （1）為保存細胞最大存活率，一般都采用慢凍快融的方法，掌握好凍存速度。凍存速度1/min存活率最高（程序凍存儀），凍存管置15-20mm厚泡沫盒再放入-70冰箱，可保持該速率，在轉(zhuǎn)移至液氮前，-70過夜更安全

33、。 （2）凍存一年后，應(yīng)再復(fù)蘇培養(yǎng)1次，然后繼續(xù)凍存。-196 保存時間數(shù)年數(shù)十年，-70數(shù)月。 （3）待凍存細胞應(yīng)具有較高的活力，即處于對數(shù)生長期的細胞。 （4）常溫下DMSO對細胞有毒副作用，因此凍存液需在4下放置4060min后使用。復(fù)蘇效果取決于復(fù)溫速度，細胞在-50最易受損，速融可迅速通過該溫度，避免細胞損傷。必須在12min內(nèi)使凍存液完全融化。二倍體細胞培養(yǎng)法 是指培養(yǎng)的細胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀的培養(yǎng)方法。正常細胞的原代培養(yǎng)即為二倍體細胞，但長期旺盛地增殖生長，并保持二倍體性狀并非易事。l措施： 低溫凍存：采用妥善的培養(yǎng)方法：1.嚴(yán)格控制pH，最好CO2培養(yǎng)箱。 2.換液時間間

34、隔不能太長，部分換液。3.高質(zhì)量血清和培養(yǎng)基，盡量維持不變。每次傳代均一分為二（細胞數(shù)量、營養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶空間和面積不變）。4.傳代期不能過長，掌握好傳代時機，細胞不能過于密集，應(yīng)及時傳代。5.傳代后如細胞不用于實驗，立即低溫凍存。單細胞分離（克?。┡囵B(yǎng)又稱細胞克隆，即把單個細胞從群體內(nèi)分離出來單獨培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個新的細胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。 細胞群體單細胞培養(yǎng)新的細胞群體純系，稱細胞株 不論用什么方法克隆細胞，都必須保證分離出來的細胞確為一個而不是兩個或更多。這是進行細胞克隆時應(yīng)遵守的最基本原則。克隆形成率（Coloning Efficiency）： 細胞群中單個細胞形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱克

35、隆形成率。細胞制成懸液后，以低密度（25個細胞/cm2)接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群（克?。┑陌俜?jǐn)?shù)稱接種存活率（克隆形成率），除表示細胞活力外，主要表示細胞增殖能力。 克隆形成率=形成克隆數(shù)接種細胞數(shù)100%提高克隆形成率的措施1.培養(yǎng)基：自制適應(yīng)性培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基是一種不含細胞而已被細胞生活過或同化過的培養(yǎng)基。 2.血清：胎牛血清小牛血清馬血清，用時先做克隆形成率實驗，選最佳者使用。滅活處理56，0.5h.3.激素：含110u/ml的胰島素培養(yǎng)液能促進很多細胞克隆的形成。地塞米松4.CO2：CO2對絕大多數(shù)細胞克隆形成率都有提高，多用5%，成纖維細胞和膠質(zhì)細胞2%.5.適應(yīng)

36、性底物：無限細胞系塑料底物；原代培養(yǎng)細胞膠原層或血漿纖維蛋白層。6.飼細胞：不分裂，但生存并同化營養(yǎng)液。稀釋法_微孔板克隆培養(yǎng) 注意：稀釋法克隆生長過程中的換液,每周一次補充營養(yǎng)但增加污染，兩周換液合理，半量換液.軟瓊脂培養(yǎng)（ soft agar culture）主要應(yīng)用雙層軟瓊脂培養(yǎng)（也可單層瓊脂），檢測轉(zhuǎn)化細胞和惡性細胞最常用的方法，與細胞惡性程度有很大的符合率。第六章 組織培養(yǎng)的污染、檢測和排除真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲霉、孢子霉、毛霉菌、白念珠菌和酵母菌。細菌污染：最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌、白色葡萄球菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌

37、，其中又以白色葡萄球菌較常見。支原體污染：是細胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺和干擾實驗結(jié)果的一種污染。是細胞培養(yǎng)研究中重點預(yù)防對象。熒光染色法是現(xiàn)有檢測方法中最方便和最有效的一種。熒光顯微鏡下可見支原體呈顆粒或纖絲熒光染色，散在細胞周圍，或附于細胞表面。第七章 個別細胞核組織的培養(yǎng)上皮組織特征性生長狀態(tài)：1.膜狀生長（細胞緊密相連），細胞數(shù)量多時最為明顯；2.不規(guī)則多角形，呈鋪路石樣；3.以及“拉網(wǎng)”現(xiàn)象（Netting）。上皮細胞培養(yǎng)的3個要點： 需特殊底物； 需特殊培養(yǎng)基：多用DMEM和HamF12純化和延長上皮細胞生存期是上皮細胞培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。表皮細胞培養(yǎng)的要點: 皮膚是表皮細胞培養(yǎng)來源，

38、小兒包皮、早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚組織最為理想，也可采用乳腺或腹部皮膚。16歲好，不要超過60歲，注意消毒。 培養(yǎng)液：DMEM/F12(3:1，V/V)、10%FBS、胰島素、 轉(zhuǎn)鐵球蛋白、氫化可的松、霍亂毒素、腺嘌呤、促表皮生長因子(EGF)等。采用膠原底物或NIH3T3為飼養(yǎng)層細胞表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細胞。胰蛋白酶-EDTA冷消化法（使表皮和真皮結(jié)合松散）；膠原酶消化效果較好，對結(jié)締組織有較強消化作用，對表皮細胞損傷小。排除成纖維細胞的處理： (1)酶消化法 在消化培養(yǎng)細胞時，常是成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當(dāng)長的時間才脫壁，特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯，因而可以利

39、用這種差異采用多次差別消化方法將上皮細胞和成纖維細胞分開。 （2）機械劃除法 原代培養(yǎng)成功后，上皮細胞和成纖維細胞混雜生長，常常分區(qū)成片，每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械刮除的方法去除不需要的細胞。（3）反復(fù)貼壁法 成纖維細胞貼壁過程快（10-30min），而上皮細胞大部分在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細胞。 （4）克隆法 采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，選擇出所需要的克隆。 （5）培養(yǎng)及限定方法 某些細胞在生長過程中必須存在或去除某種物質(zhì)，否則無法生長，可以利用這種技術(shù)來純化細胞。如選用不含血小板

40、生長因子的無血清培養(yǎng)基可去除表皮細胞中的成纖維細胞。 （6）流式分選亦可用全皮消化法或組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)，但表皮細胞和成纖維細胞混合生長，難以純化。 表皮細胞采用角蛋白的特異性抗體鑒定。 3T3飼養(yǎng)層上，3-5d形成細胞集落，10d左右開始匯集融合，進而形成整片細胞皮片，細胞增殖減緩（細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底的70%-80%時需傳代）。復(fù)合培養(yǎng)時，能形成棘細胞層、顆粒細胞層和角質(zhì)細胞層等皮膚各層結(jié)構(gòu)。巨噬細胞培養(yǎng)技術(shù)要點 M屬免疫細胞，具有多種生物學(xué)功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要實驗工具。1. 來源于人胸水、腹水、血液和透析液等。若欲獲取多量M，可于取材前向小鼠腹腔注射刺激物，通常取細

41、胞前向動物腹腔內(nèi)注射510ml 4%硫代乙醇酸鹽，缺點是很多刺激物能激活吞噬細胞并被其吞噬，進行培養(yǎng)后，刺激物不能很快被消化掉，殘留在細胞內(nèi)，能干擾細胞代謝。全血可獲得大量單核細胞，缺點是混有血小板及其他白細胞。2.其他細胞（LC、NC、PC和成纖維細胞等）成分的排除，大多數(shù)單核巨噬細胞有極易附著玻璃表面的特性，可用附著分離法去除其他細胞成分，純度可達95%。3.巨噬細胞對胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之離壁，借此可與其他細胞相區(qū)別，也是淘汰其他細胞的方法。純利多卡因37 5分鐘可使細胞分離。4.正常M能附著瓶壁，胞質(zhì)延展，胞質(zhì)有皺褶，胞核呈特有的腎形，細胞較多時可形成單層，有時細胞呈多角

42、形并連接成網(wǎng)狀。5強烈的吞噬活動，如向培養(yǎng)中加入淀粉、乳膠粒和紅細胞等，可見巨噬細胞能吞噬5個以上的顆粒。6直接從腹腔獲取的巨噬細胞為靜止性細胞，呈圓形，偽足不明顯。經(jīng)硫代乙醇酸鹽誘導(dǎo)可獲得大量的炎性巨噬細胞，細胞多呈梭型，有較強的運動和吞噬能力。7. 巨噬細胞易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。但屬不繁殖細胞群，難以長期生存，多用作初代培養(yǎng)。8.狀態(tài)不良時，胞質(zhì)常不延展，胞體變圓，不透明，或脫離瓶壁漂浮在培養(yǎng)液中，失去吞噬能力。骨骼肌細胞培養(yǎng)特點 胚胎或幼體的大腿肌組織最好 胰蛋白酶消化，培養(yǎng)液中可加入1%胎汁以促進分化 膠原底物或明膠可促進分化 細胞生長開始呈紡錘形，50 52h后出現(xiàn)多核纖維

43、（細胞融合），數(shù)日后融合停止， 可見橫紋及收縮現(xiàn)象（融合后23天），有時可導(dǎo)致細胞從底物脫離 可進行傳代培養(yǎng)成為有限細胞系，但易失去分化現(xiàn)象；表現(xiàn)為肌細胞不發(fā)生融合， 從而不能形成多核肌纖維和出現(xiàn)收縮現(xiàn)象。胚胎干細胞 指從著床前的胚胎內(nèi)細胞團（桑椹胚）或原始生殖細胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細胞、同時可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細胞系。胚胎干細胞的體外培養(yǎng) 1.有飼養(yǎng)層（feeder layer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制備飼養(yǎng)細胞單層，主要是利用其分泌的生

44、長因子FGF和抑制干細胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細胞在體外克隆而不分化。2.無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。ES細胞的鑒定- 細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)- 核型分析- 堿性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫熒光標(biāo)記- 分化能力檢測 1.體外分化試驗2.體內(nèi)分化試驗3.嵌合體形成試驗4.核移植試驗成體干細胞 是成體組織內(nèi)具有自我更新及分化一種或一種以上子細胞的未成熟細胞。來源于成年組織或器官，一般具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織。為多能干細胞或單能干細胞，如造血干細胞和上皮干細胞等。成體干

45、細胞分離純化-利用細胞表面標(biāo)志分離單克隆抗體的特異性和多樣性使利用不同抗體的合理組合分離不同類型的細胞成為可能。陽性細胞分選法：從混雜細胞群體中獲得表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞群；陰性細胞分選法：除去表達與抗體相應(yīng)膜抗原的細胞，而收集其余的細胞群體，稱為陰性細胞分選法。 技 術(shù)：1.抗體/補體介導(dǎo)細胞溶解法：陰性細胞分選法2.流式細胞儀分選法3.平面粘附分離法4.免疫磁珠分離法 誘導(dǎo)式多能性干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS細胞）。 最初是日本人山中申彌（Shinya Yamanaka）于2006年利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4, Sox2, Klf

46、4 和c-Myc）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型。造血干細胞（hematopoietic stem cell , HSC）概念：是指存在于造血組織內(nèi)的一類能分化生成各種血細胞的原始細胞。造血干細胞不是純一的細胞群體，而是由不同年齡等級的干細胞組成。這些不同年齡等級的干細胞的表面抗原、免疫表型和粘附分子的表達不一，生物學(xué)特性也有一定的差異。造血干細胞的分離純化 通常先利用密度梯度離心等方法去除待分離物中的紅細胞和成熟粒細胞等成分，獲得單個核細胞。然后利用CD34等分子特異的抗體標(biāo)記單個核細胞，通過流式細胞分選、免疫吸附系統(tǒng)（包括淘洗技術(shù)、免疫吸附柱層析、

47、免疫磁珠等）等方法將被標(biāo)記細胞與未被標(biāo)記細胞分離開來。 另外，也可以利用造血干細胞大多處于靜止期，對活體染料拒染的特性對其進行富集純化。腫瘤干細胞（CSC） 存在于腫瘤組織中、數(shù)量稀少的、具有干細胞性質(zhì)的細胞群體，具有自我更新的能力，是形成不同分化程度腫瘤細胞和腫瘤不斷擴大的源泉。 生物學(xué)特性 1.自我更新；2.產(chǎn)生分化程度不同、表型特征不同、增殖潛能不同的細胞，以及構(gòu)成組織；3.激活抗凋亡途徑；4.遷移和轉(zhuǎn)移。分離和鑒定 CSC篩選最常用的手段是利用CSC細胞表面特異標(biāo)志物，通過流式細胞術(shù)或磁珠分選法分離得到CSC。根據(jù)腫瘤細胞中一群稱為SP細胞(side population cell)能

48、將核酸染料Hoechst33342排出胞外的特性，通過流式細胞術(shù)來分選雖然一些SP細胞也具備自我更新和分化能力，但究竟是不是CSC還需進一步研究。根據(jù)CSC的克隆形成能力來篩選。將腫瘤細胞放在軟瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，CSC在無血清添加生長因子條件仍具有很強的自我更新和保持非分化狀態(tài)的能力，進而能形成克隆，而其他腫瘤細胞則在傳代過程中消亡。鑒定CSC細胞的金標(biāo)準(zhǔn)是看分選得到的CSC能否在移植動物體內(nèi)形成新腫瘤。將分離出來的各細胞亞群按不同細胞濃度梯度接種NODSCID小鼠比較各細胞群成瘤能力，從而篩選出優(yōu)勢細胞表面標(biāo)志，或者將幾種優(yōu)勢細胞表面標(biāo)志進行組合，篩出各種組合的細胞群，這一方法又稱系列原位移

49、植法。非粘附球囊分析法相比于系列原位移植法更簡便，逐漸被用來分選鑒定CSC，CSC細胞能在無血清添加生長因子的培養(yǎng)基中保持未分化狀態(tài)并形成致密球體，非CSC則貼壁緩慢生長，CSC得以富集。非粘附腫瘤細胞具備裸鼠體內(nèi)致瘤能力和分化能力。但非粘附腫瘤球囊細胞是否是由于滲人的正常干細胞引起的效應(yīng)還有待進一步證實。第八章 培養(yǎng)細胞生物學(xué)性狀的檢測單層細胞固定觀察的特點: 細胞層次少，固定穿透快，固定效果好。 單層細胞不需包埋和切片。常用固定液（與一般固定組織所用相同）分兩類： 簡單固定液：用單一化學(xué)物質(zhì)配制而成，主要有甲醇、乙醇、甲醛、丙酮、戊二醛等 。 混合固定液：用兩種或兩種以上的化學(xué)物質(zhì)配制而成

50、，如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液 、Carnoy固定液等。 幾種常用的固定液 4%甲醛-PBS（中性緩沖福爾馬林）： 甲醛是一種氣體，其飽和水溶液無色，約含40%甲醛。用40%甲醛水溶液：PBS1：9配方制備甲醛固定液，對細胞染色體、線粒體和高爾基體的固定效果較好。 4%多聚甲醛-PBS固定液：多聚甲醛為白色固體，該固定液適于固定纖維蛋白和細胞骨架蛋白，進行核酸原位雜交時多用此固定液。 丙酮：多用分析純的冷丙酮，固定細胞內(nèi)酶的效果較佳，免疫組化時多用。 戊二醛：對組織的滲透率高，與蛋白質(zhì)反應(yīng)快，能較好地保存蛋白質(zhì)，對微管和膜性結(jié)構(gòu)保存也比較好，透射電鏡分析時常用。

51、 甲醇/醋酸固定液：甲醇：醋酸為3：1的固定液，是應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)細胞固定劑，甲醇穿透力好、易于揮發(fā)，醋酸固定蛋白效果好，且有使細胞膨脹作用，兩者結(jié)合能使細胞形態(tài)固定不變。最適用于觀察染色體，注意該固定液宜現(xiàn)用現(xiàn)配。 常用的染色方法 (1) Giemsa染色： 是最常用的方法之一，簡便、快速，適用于多種細胞和染色體的染色。 (2) 蘇木精-伊紅(HE)染色法 (3) Feulgen染色法 ( 4)丫啶橙（acridine orange，AO）熒光染色法丫啶橙是一種常用熒光染料，與細胞內(nèi)的DNA和RNA都有親和力，但結(jié)合后卻發(fā)出不同顏色的熒光，DNA呈翠綠色，而RNA呈橘紅色至火紅色。該法簡便

52、快捷，有一定的特異性，對活細胞毒性小，既可染活細胞進行熒光顯微鏡觀察（但不持久），又可染固定細胞（效果更好）。 (5) 甲基綠-派若寧(methyl green-pyronin method)染色法:透射電鏡 培養(yǎng)細胞透射電鏡觀察（戊二醛固定）免疫熒光技術(shù)【原理】用熒光素標(biāo)記已知抗體或抗原，檢測細胞內(nèi)或組織標(biāo)本中相應(yīng)的抗原或抗體。 在熒光顯微鏡下，抗原抗體特異性結(jié)合部位的熒光素受激發(fā)光照射而發(fā)出明亮的熒光。根據(jù)熒光物存在的位置和強度，可以確定抗原抗體在組織細胞的部位和數(shù)量。 【注意事項】 需熒光顯微鏡觀察，在暗視野下完成。 應(yīng)立刻觀察，熒光容易衰退，標(biāo)本不能長期保存，應(yīng)及時照相記錄。 非特異性

53、熒光對結(jié)果的影響，細胞內(nèi)某些物質(zhì)的自發(fā)熒光以及在免疫染色中產(chǎn)生的非特異性染色。 每次實驗均需做陰、陽性對照。原位雜交 【特點】 1.應(yīng)用廣泛，如可對染色體中特定DNA序列精確定位、RNA雜交可觀察組織細胞中特定基因的表達水平等。 2.不需從組織細胞中提取核酸，對組織細胞中含量極低的靶序列有極高的敏感性。 3.可完整地保持組織與細胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映細胞的功能關(guān)系。 4.能在復(fù)雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其它成分的影響，尤其適于那些細胞數(shù)量少且散在與其它組織中的細胞內(nèi)DNA或RNA的研究。 細胞增殖情況檢測 細胞增殖生長力是判定細胞活力的重要指標(biāo)。 1. 細胞計數(shù)：是測定細胞絕對增長數(shù)值常用的最簡單的方法。