實(shí)驗(yàn)四-細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移

1、實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 李曉華李曉華 程國(guó)軍程國(guó)軍一：目的要求一：目的要求 了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的了解在自然條件下微生物遺傳信息傳遞的方式；方式； 掌握細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的原理和流程。掌握細(xì)菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的原理和流程。 二：基本原理二：基本原理 在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過(guò)程中，供體菌與受體菌在質(zhì)粒轉(zhuǎn)移過(guò)程中，供體菌與受體菌細(xì)胞通過(guò)結(jié)合作用緊密接觸，質(zhì)粒從細(xì)胞通過(guò)結(jié)合作用緊密接觸，質(zhì)粒從供體細(xì)胞向受體轉(zhuǎn)移，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒供體細(xì)胞向受體轉(zhuǎn)移，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)粒復(fù)制，這就是結(jié)合轉(zhuǎn)移的過(guò)程。按能復(fù)制，這就是結(jié)合轉(zhuǎn)移的過(guò)程。按能否自主轉(zhuǎn)移，將天然存在的質(zhì)粒分為否自主轉(zhuǎn)移，將天然存在的質(zhì)粒分為兩

2、大類。兩大類。 1轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒：多為低拷貝的大質(zhì)粒，含有完整：多為低拷貝的大質(zhì)粒，含有完整的轉(zhuǎn)移操縱子基因（的轉(zhuǎn)移操縱子基因（tra）和轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)。能在同）和轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)。能在同種或親緣關(guān)系近的菌體細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。例如：種或親緣關(guān)系近的菌體細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。例如： 大腸桿菌：大腸桿菌：F因子、因子、R1、R100、R6K、RP4 天藍(lán)色鏈霉菌：致育性因子天藍(lán)色鏈霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP2 2非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒非轉(zhuǎn)移型質(zhì)粒：多為高拷貝的小質(zhì)粒，如大腸：多為高拷貝的小質(zhì)粒，如大腸桿菌的桿菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因（tra），不能自主轉(zhuǎn)移，但

3、由于含有與），不能自主轉(zhuǎn)移，但由于含有與F質(zhì)粒類似質(zhì)粒類似的的bom（或（或nic）位點(diǎn)或誘動(dòng)基因）位點(diǎn)或誘動(dòng)基因mob（mobilization），因而能被帶有），因而能被帶有tra基因的轉(zhuǎn)移性基因的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒誘動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移質(zhì)粒誘動(dòng)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。 轉(zhuǎn)移子的篩選轉(zhuǎn)移子的篩選 篩選培養(yǎng)基為：篩選培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+抗生素抗生素； 供體和輔助大腸桿菌均營(yíng)養(yǎng)缺陷型，不能供體和輔助大腸桿菌均營(yíng)養(yǎng)缺陷型，不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)； 未轉(zhuǎn)化成功的受體菌不能在有抗生素的平未轉(zhuǎn)化成功的受體菌不能在有抗生素的平板上生長(zhǎng)。板上生長(zhǎng)。三：實(shí)驗(yàn)菌株三：實(shí)驗(yàn)菌株 供體菌：供體菌：E.coli

4、 DH5(pTR102) (TcR)，含有，含有 mob基因基因 ； 受體菌受體菌: 紫云英根瘤菌紫云英根瘤菌 ( TcS) ； 輔助菌輔助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），），含有含有tra基因?；颉?四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四：實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 準(zhǔn)備準(zhǔn)備將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期：將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期： 供體菌：供體菌：E.coli DH5(pTR102) (TcR)，LB + Tc 20g /ml，37震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)1夜；夜； 受體菌受體菌: Sinorhizobium fredii ( TcS)， TY, 28震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)2天；天； 輔助菌

5、輔助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），），LB + Spe 50 g/ml 37震震蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)1夜夜 用可調(diào)定量移液器吸取供體、輔助菌各用可調(diào)定量移液器吸取供體、輔助菌各 0.4ml，吸受體菌吸受體菌0.6ml，都加入同一，都加入同一eppdorf管內(nèi)（每個(gè)管內(nèi)（每個(gè)同學(xué)做同學(xué)做1管），放入離心機(jī)內(nèi)，管），放入離心機(jī)內(nèi)，10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min 離離心心1分鐘。分鐘。 倒上清，向沉淀加倒上清，向沉淀加 1ml 的的 TY液體，用液體，用 tip上下抽上下抽吸，洗滌菌體，再吸，洗滌菌體，再10000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/min離心離心1分鐘，倒上分鐘，倒上清，留清，留100l左右

6、用于懸浮菌體。左右用于懸浮菌體。 倒倒TY平板，然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準(zhǔn)備平板，然后用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準(zhǔn)備好的好的TY平板上（平板上（每每2個(gè)同學(xué)個(gè)同學(xué)1片，片，2-3片片/平板平板）。）。用用200l的的 tip 抽吸抽吸eppdorf管內(nèi)沉淀的菌體，打管內(nèi)沉淀的菌體，打散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平板，以免菌液流出濾紙片以外）板，以免菌液流出濾紙片以外）,吹干。吹干。 28培養(yǎng)培養(yǎng)2天。天。 操作步驟（第一天）操作步驟（第一天） 倒倒SM平板平板 將基本培養(yǎng)基（將基本培養(yǎng)基（SM）溶化，加千分之一的）溶化，加千分之一的維生素

7、混合液，然后加相應(yīng)量的四環(huán)素維生素混合液，然后加相應(yīng)量的四環(huán)素（15U/ml），每），每2人人1皿。皿。 另準(zhǔn)備另準(zhǔn)備1瓶基本培養(yǎng)基，不加抗生素，用于瓶基本培養(yǎng)基，不加抗生素，用于對(duì)照。對(duì)照。 將倒好的平板用報(bào)紙包好后放入將倒好的平板用報(bào)紙包好后放入4冰箱，冰箱，備用。（備用。（注：四環(huán)素在強(qiáng)光下易分解注：四環(huán)素在強(qiáng)光下易分解） 向滅菌青霉素瓶中加向滅菌青霉素瓶中加3ml無(wú)菌水，將已培養(yǎng)無(wú)菌水，將已培養(yǎng)的的TY平板上的濾紙片用無(wú)菌鑷子放入水中，平板上的濾紙片用無(wú)菌鑷子放入水中，在震蕩混勻器上洗菌體，充分打散在震蕩混勻器上洗菌體，充分打散。 向向1ml的的ep管加管加 0.9mL無(wú)菌水，取無(wú)菌水，取0.1ml菌菌液，混勻。液，混勻。 吸取吸取 200L涂皿。涂皿。 少數(shù)同學(xué)另取稀釋液，涂少數(shù)同學(xué)另取稀釋液，涂1板不加板不加Tc的的SM做對(duì)照做對(duì)照 。 平板放平板放28 培養(yǎng)培養(yǎng)4-6天后看結(jié)果。天后看結(jié)果。操作步驟（第三天）操作步驟（第三天） 五：實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容五：實(shí)驗(yàn)報(bào)告內(nèi)容轉(zhuǎn)移頻率轉(zhuǎn)移頻率=SM+Tc平板的單菌落數(shù)平板的單菌落