酶免疫測(cè)定技術(shù)

1、酶免疫測(cè)定技術(shù)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科廖偉嬌概述1 標(biāo)記免疫技術(shù)：將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，不必測(cè)定抗原抗體復(fù)合物本身，而是測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，這種免疫技術(shù)，稱為標(biāo)記免疫技術(shù) 2 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類：按標(biāo)記物分類：同位素標(biāo)記 熒光素 酶標(biāo)記 等等按檢測(cè)對(duì)象分類：免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫測(cè)定技術(shù) 酶免疫測(cè)定技術(shù)概述：1.酶免疫測(cè)定技術(shù)的概念：將試劑抗原或試劑抗體用酶進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的酶，這種免疫技術(shù)，稱為酶標(biāo)記免疫技術(shù)。 2.分類：酶免疫組化 酶免疫測(cè)定 均

2、相法 異相法 固相酶免疫測(cè)定 液相酶免疫測(cè)定均相法：不需分離復(fù)合物與游離標(biāo)記物即可直接測(cè)定的方法。異相法 則需分離后測(cè)定均相酶免疫測(cè)定 ：1.EMIT(酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)): 2.克隆酶供體免疫測(cè)定 ：位阻EDEDEAEAEDAbAb活性酶標(biāo)本中Ag酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 第一節(jié)ELISA的原理和類型一、基本要求：1. 使Ag(或Ab)結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。 免疫吸附劑2. 使Ag(或Ab)與某種酶結(jié)合，既保持免疫活性，又有酶的活性。 酶結(jié)合物3. 標(biāo)本、酶標(biāo)記物能按一定的次序與固相載體表面的Ag(或Ab)結(jié)合，加入酶的底物后能產(chǎn)生有色反應(yīng)。 底物二、必備試劑：1.

3、固相的Ag或Ab-免疫吸附劑2. 酶標(biāo)記的Ab或Ag-結(jié)合物3. 酶反應(yīng)的底物-底物三、方法類型：1. 夾心法2. 間接法3. 競(jìng)爭(zhēng)法4. 捕獲法測(cè)IgM抗體標(biāo)本標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色有色為陽性顯色有色為陽性酶標(biāo)二抗底物3.競(jìng)爭(zhēng)法 Ag AgAb + Ab Ag(標(biāo)本) (定量) AgAb E E終止液標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色顯色固相固相標(biāo)本酶標(biāo)二抗底物 1.夾心法2.間接法 第二節(jié) ELISA的技術(shù)要點(diǎn)一、試劑制備 免疫吸附劑 酶標(biāo)記抗原或抗體二、反應(yīng)條件的選擇 酶標(biāo)二抗?jié)舛冗x擇 包被抗原濃度的選擇三、操作標(biāo)準(zhǔn)化一、試劑制備： 免疫吸附劑1. 固相載體 要求： 吸附力強(qiáng) 能保持Ag或Ab活性 不參

4、與化學(xué)反應(yīng) 載體性能比較 載體材料：+、- 結(jié)果差別大 ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)20孔的OD，要求CV10%。 常用載體： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板2. Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3. 免疫吸附劑(固相Ag或Ab)： 包被：將Ag或Ab固相化的過程 包被緩沖液、包被方法 封閉：包被后在用15%小牛血清白蛋白再包 被，以消除非特異吸附的干擾。 酶結(jié)合物：1. 酶的要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定。2. ELISA常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3. 酶的底物：

5、HRP可溶性底物及呈色： 鄰苯二胺(OPD)：橙紅(429nm) 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：黃色(450nm) 5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm) 魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色： DAB(棕黃色) -萘酚(紅色)， 3-氧基-9-乙基卡唑(紅色) 4-氯-1-萘酚(灰藍(lán)色) AP可溶性底物及呈色： 對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm) 4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光 Ap不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 堅(jiān)固紅和萘酚ASMX混合液：紅色 -半乳糖苷酶： 4-甲基傘基-半乳糖苷：熒光4. 酶結(jié)合物的制備： 戊二醛交聯(lián)法 過碘酸鹽

6、氧化法二、反應(yīng)條件的選擇1. 酶標(biāo)二抗?jié)舛龋?00ug/L IgG，加稀釋的酶標(biāo)二抗，取OD=0.8者。2. 包被Ag或Ab濃度：棋盤滴定法3. 溫度、時(shí)間等三、操作標(biāo)準(zhǔn)化 1 加樣 2 保溫 3 洗滌 4 比色 四、影響ELISA測(cè)定的因素： 1試劑盒因素2實(shí)驗(yàn)操作中的影響試劑盒因素：A 固相材料：孔間不均B 抗原或抗體：純化(天然但干擾多)、合成(多肽分子較小，常有空間位阻)和基因抗原(與片段的選擇和制備水平有關(guān))C 酶結(jié)合物D 色原底物：OPD:致Ca，不穩(wěn)定(避光) TMB：水溶性差(商品：配好)E 運(yùn)輸儲(chǔ)存操作中的注意事項(xiàng)：1 標(biāo)本的收集和保存2試劑的準(zhǔn)備3加樣4溫育5洗板6顯色7比

7、色8結(jié)果判斷樣品的收集和保存： 1. 溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用 于HRP的輔基)。 2. 細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-” (破壞Ag或Ab)或假“+”(非特異蛋白) 。 3. 反復(fù)凍融可使抗體效價(jià)下降而假“-”。 4. 陳舊標(biāo)本可使IgG聚集，引起間接法本 底增 加。 5. 標(biāo)本用NaN3防腐，可出現(xiàn)假“-”。試劑的準(zhǔn)備： 注意不同地區(qū)冬、夏溫差，可造成達(dá)到37的時(shí)間差異，對(duì)弱陽性結(jié)果有很大影響。加樣： 總體積約360ul，包被和封閉均為100ul， 未封閉部分可吸附非特異蛋白溫育：14過夜最佳， 372h較好， 4320min可造成弱“+”假“-”2 水浴較溫箱等空氣浴均勻洗板： 手洗效果最佳 自動(dòng)洗板要注意殘留液量。顯色對(duì)HRP，顯色完全需30min, 15min只達(dá)80%,易造成弱“+”假“-”比色：?jiǎn)尾ㄩL比色需設(shè)空白孔： OD=OD樣品-OD空白雙波長比色不需設(shè)空白： OD=OD450nm-OD630nm結(jié)果判斷： 1 注意夾心法假“-” 2 用cut-off(CO)值判斷 3 “灰區(qū)”時(shí)建議動(dòng)態(tài)觀察 4 結(jié)合臨床用藥：例如抑制劑對(duì)HBsAg五. ELISA出現(xiàn)“一片黃”的原因： 酶結(jié)合物濃度過高 底物不新鮮 洗