第五章氨基酸工藝學(xué)

1、第五章第五章 氨基酸工藝學(xué)氨基酸工藝學(xué) 1 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 1.1氨基酸發(fā)酵工業(yè)是利用微生物的生長和代謝活動(dòng)生產(chǎn)各種氨基酸的現(xiàn)代工業(yè)。氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵。由發(fā)酵所生成的產(chǎn)物氨基酸，都是微生物的中間代謝產(chǎn)物，它的積累是建立于對微生物正常代謝的抑制。也就是說，氨基酸發(fā)酵的關(guān)鍵，取決于其控制機(jī)制是否能被解除，能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為的控制微生物的代謝。氨基酸發(fā)酵的成功，把代謝控制發(fā)酵技術(shù)引入微生物工業(yè)，使微生物工業(yè)能在DNA分子水平上改變、控制微生物的代謝，使有用產(chǎn)品大量生成、積累。 2 1.1.1氨基酸生產(chǎn)的歷史 1820年 水解蛋白質(zhì)開始 1850年在實(shí)驗(yàn)室合成了氨

2、基酸 1866年（德）H.Ritthausen（立好生）博士利用硫酸水解小麥面筋，分離到一種酸性氨基酸，依據(jù)原料的取材，稱之為谷氨酸。 1908年日本制造味之素。 1909年用水解法生產(chǎn)谷氨酸。 1936年（美）從甜菜廢液（司蒂芬廢液）中提谷氨酸。 1954年多田、中山倆博士報(bào)告了直接發(fā)酵谷氨酸（L-GA） 1957年發(fā)酵法生產(chǎn)味精商業(yè)性生產(chǎn)。 3 從從20世紀(jì)初期，氨基酸實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，世紀(jì)初期，氨基酸實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，氨基酸生產(chǎn)大體有蛋內(nèi)質(zhì)水解法、化學(xué)合成氨基酸生產(chǎn)大體有蛋內(nèi)質(zhì)水解法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶法四種生產(chǎn)方法。法、微生物發(fā)酵法和酶法四種生產(chǎn)方法。 蛋白質(zhì)水解法：早期

3、味精生產(chǎn)、復(fù)合氨基酸；蛋白質(zhì)水解法：早期味精生產(chǎn)、復(fù)合氨基酸； 化學(xué)合成法：化學(xué)合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨丙氨酸；酸； 酶法：酶法：L-丙氨酸、丙氨酸、L-色氨酸、色氨酸、L-絲氨酸；絲氨酸； 微生物發(fā)酵法：生產(chǎn)微生物發(fā)酵法：生產(chǎn)60%以上的氨基酸，包以上的氨基酸，包括直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。括直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。 前三種方法成本高，工藝復(fù)雜，難以達(dá)到工前三種方法成本高，工藝復(fù)雜，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)目的。業(yè)化生產(chǎn)目的。 4 發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸是現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，也是氨基酸生產(chǎn)的重大革命，同時(shí)大大推動(dòng)了其它氨基酸研究和生產(chǎn)的發(fā)展。逐步形成了用發(fā)酵法制

4、造氨基酸的新型發(fā)酵工業(yè)部門。 生產(chǎn)氨基酸的大國為日本和德國。 日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸,可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。 日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家,生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。 5 我國從1958年開始篩選谷氨酸生產(chǎn)菌，同時(shí)進(jìn)行了大量的谷氨酸發(fā)酵的基礎(chǔ)性研究，1964年分離選育出北京棒狀桿菌As1.299和鈍齒桿菌As1.542二株谷氨酸生產(chǎn)菌。后進(jìn)行其它的基礎(chǔ)性研究，陸續(xù)發(fā)表了賴、纈、亮、異亮、色、天冬的發(fā)酵研究報(bào)告，建立了自己的發(fā)酵工業(yè)。 6 國內(nèi)生產(chǎn)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無

5、論生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量還難于與國外抗衡。 在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,主要廠家有無錫華瑞,北京費(fèi)森尤斯,昆明康普萊特,但生產(chǎn)原料都依賴進(jìn)口。 2000年,世界氨基酸產(chǎn)值達(dá)45億美元,占生物技術(shù)市場的7%,國內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元,占全國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。71.2氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展的歷史回顧 所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為培養(yǎng)基中的主要原料培養(yǎng)微生物,積累特定的氨基酸。 這些方法成立的一個(gè)重要原因是使用選育好的氨基酸生物合成高能力的菌株。8菌株的育種是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之一 從自然界中篩選有產(chǎn)酸能力的菌株,

6、并建立其培養(yǎng)條件. 在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)制的基礎(chǔ)上發(fā)展為營養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。 隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展,接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建生產(chǎn)菌株的嘗試。 隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長足的發(fā)展。 蘇氨酸等的生產(chǎn)菌株被成功地構(gòu)建并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。91.2.1用野生株的方法 這是從自然界獲得的分離菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)的一種方法。 典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。 改變培養(yǎng)條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵 101.2.2用營養(yǎng)

7、缺陷變異株的方法 這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反應(yīng)阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停止，不讓最終產(chǎn)物起控制作用。 這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。 11121.2.3類似物抗性變異株的方法 用一種與自己想獲得的氨基酸結(jié)構(gòu)相類似的化合物加入培養(yǎng)基內(nèi)，使其發(fā)生控制作用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培養(yǎng)基中能夠生長的變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機(jī)制的，能夠生成過量的氨基酸。 利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 13高絲氨酸脫氫酶141.2.4 體內(nèi)及體外基因

8、重組的方法 基因工程包括細(xì)胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。 體內(nèi)基因重組在應(yīng)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞融合等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的局部二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組現(xiàn)象。 細(xì)胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺點(diǎn)是，現(xiàn)在只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進(jìn)行并較難成功。 15 代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，應(yīng)用重組DNA技術(shù)可以改變代謝途徑分支點(diǎn)上的流量或引入新的代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。 其主要步驟為: 鑒定目標(biāo)代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶); 取得酶基因，必要時(shí)可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，基因剪

9、接等，使蛋白具有新的特點(diǎn)(增強(qiáng)活性或穩(wěn)定性、解除反饋抑制等); 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)節(jié)元件一起克隆進(jìn)目標(biāo)生物; 使調(diào)節(jié)元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 通過基因工程技術(shù)，構(gòu)建理想的工程菌株1.2.5基因工程菌161.2.5.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達(dá)的研究 1.2.5.1.1受體的獲得 目前使用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是通過誘變選育出的基礎(chǔ)產(chǎn)率較高的菌株。 大腸桿菌遺傳背景研究得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為應(yīng)用帶來困難。 棒狀桿菌能克服這兩個(gè)缺點(diǎn)，但載體受體系統(tǒng)研究較晚且有限制修飾系統(tǒng)的障礙

10、，所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_(dá)且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待解決的問題。 171.2.5.1.2載體的構(gòu)建 有效的載體需要有在受體菌中可啟動(dòng)的復(fù)制起始位點(diǎn)，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得; 載體所需的篩選標(biāo)記及外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，可從常用的克隆載體中獲得。 181.2.5.1.3基因轉(zhuǎn)移手段 由于棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，CaCl2轉(zhuǎn)化法對它不適用。 通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法，由于受到原生質(zhì)體再生條件的局限，效率不高; 電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛使用，目前它的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的1001000倍。 接合轉(zhuǎn)移

11、可用于基因在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 191.3氨基酸發(fā)酵的代謝控制是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二是氨基酸代謝控制發(fā)酵的基本策略之二 菌種的代謝調(diào)控: 控制發(fā)酵的條件 控制細(xì)胞滲透性 控制旁路代謝 降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛?消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成201、控制發(fā)酵環(huán)境條件 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改變代謝途徑和產(chǎn)物。212、控制細(xì)胞滲透性生物素、油酸和表面活性劑，引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改變。細(xì)胞內(nèi)生物素水平高，Glu不能通過細(xì)胞膜青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞面內(nèi)外的滲透壓而泄露出來。表面活

12、性劑增加細(xì)胞膜通透性氨基酸發(fā)酵必須考慮的重要因素22細(xì)胞透性的調(diào)節(jié) 細(xì)胞透性的調(diào)節(jié)，一般通過向培養(yǎng)基中添加化學(xué)成分（如生物素、油酸、甘油、表面活性劑、青霉素等，達(dá)到抑制磷脂、細(xì)胞膜的形成或阻礙細(xì)胞壁的正常生物合成，使谷氨酸生產(chǎn)菌處于異常生理狀態(tài)，解除細(xì)胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。 生物素：影響磷脂的合成及細(xì)胞膜的完整性。 油酸：直接影響磷脂的合成及細(xì)胞膜 甘油：甘油缺陷型菌株喪失-磷酸甘油脫氫酶，不能合成-磷酸甘油和磷脂。限量供應(yīng)， 控制了細(xì)胞膜中與滲透性直接關(guān)系的磷脂含量，使谷氨酸排出胞外而積累。 表面活性劑：對生物素有拮抗作用，拮抗不飽和脂肪酸的合成，導(dǎo)致磷脂合成不足，影響細(xì)胞膜的完整

13、性，提供細(xì)胞膜對谷氨酸的滲透性。 青霉素：抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的后期合成，形成不完整的細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜失去保護(hù)，使胞內(nèi)外的滲透壓差導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理損傷，增大谷氨酸向胞外漏出的滲透性23生物素阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成表面活性劑對生物素有拮抗阻斷脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成在對數(shù)生長期添加青霉素抑制細(xì)胞壁合成細(xì)胞膜損傷甘油缺陷型磷脂的合成受阻影響細(xì)胞膜的合成油酸缺陷型阻斷不飽和脂肪酸的合成影響細(xì)胞膜的合成243、控制旁路代謝254、降低反饋?zhàn)饔梦锏臐舛?利用營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸的量。限制瓜氨酸的濃度可解除反饋抑制，實(shí)現(xiàn)鳥氨酸的生物合成。265、消除終產(chǎn)物的反饋抑制

14、與阻遏作用 使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法或者通過選育營養(yǎng)缺陷型菌株。6、促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 ATP的積累可促進(jìn)氨基酸的生物合成27 迄今，日已有22種氨基酸可用發(fā)酵法生產(chǎn)。 但生產(chǎn)上不一定非用生物合成。根據(jù)經(jīng)濟(jì)、資源的合理性，利用不同方法生產(chǎn)氨基酸。如蛋氨酸、鳥氨酸用化學(xué)合成法，胱氨酸可用提取法水解。但化學(xué)合成為D型，右旋。生物合成為L型，左旋。水解法污染厲害。因而總的來說，氨基酸生產(chǎn)要用生物合成。 28 今后的發(fā)展是育出從遺傳角度解除了反饋調(diào)節(jié)和遺傳性穩(wěn)定的更理想菌種。提高產(chǎn)酸。采用過程控制，加強(qiáng)種子管理、連續(xù)化、自動(dòng)化、穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)、探索新工藝、新設(shè)備，以提高產(chǎn)率和收

15、得率、研究微生物生理、生化、遺傳變異和發(fā)酵機(jī)制等問題，以便能更好地控制氨基酸這樣微生物中間代謝產(chǎn)物的發(fā)酵。 29 二、氨基酸的應(yīng)用 （一）醫(yī)藥 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由各種氨基酸構(gòu)成的，所以各種氨基酸及其衍生物可治療各種不同的疾病。 如消化系統(tǒng)經(jīng)手術(shù)后，或燒傷、創(chuàng)傷病例需大量補(bǔ)充蛋白質(zhì)營養(yǎng)時(shí)，可注射各種氨基酸，配比接近雞蛋的配比為佳。八種必須氨基酸（異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸） 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。 30 （二）食品 1調(diào)味用的氨基酸 味精（Glu-Na） 其與肌苷酸鈉或鳥苷酸鈉同時(shí)使用，具協(xié)同作用，可提高鮮味。 天冬氨酸鈉 用

16、量僅次于味精的調(diào)味品，具強(qiáng)烈鮮味。 甘氨酸 甜味為砂糖的0.8倍。在果汁中加0.02%0.4%的甘氨酸，可去除糖精的苦味。31 DL-丙氨酸。甜味為砂糖的1.2倍。 D-色氨酸。甜味為砂糖的35倍。用于牙膏、糖尿病人及肥胖病人。 天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯。甜味為砂糖的150倍。但其水溶液不耐熱，7080就分解，加熱至100就失去甜味。 2提高食品的營養(yǎng)價(jià)值。 8種人體必須氨基酸，不能在體內(nèi)合成，而各種食品又缺乏某一特定的必須氨基酸，添加之可提高蛋白質(zhì)的利用率。如。魚缺色氨酸。 強(qiáng)化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中)32 （三）農(nóng)業(yè) 1增加飼料的營養(yǎng)率。 如，谷類缺賴氨酸，豆類缺蛋氨酸。 甲硫

17、氨酸等必需氨基酸可用于制造動(dòng)物飼料。 2氨基酸農(nóng)藥 如，水稻孕穗期使用氨基酸脂肪酸農(nóng)藥N-月桂酰-L-異戊氨酸能防止稻瘟病，提高水稻蛋白質(zhì)的含量，改進(jìn)稻米的風(fēng)味和品質(zhì)。33 （四）工業(yè)原料 1人造革 D-谷氨酸聚合生成聚合谷氨酸（PLG） 2洗滌劑 十二烷?；劝彼幔ˋGS）肥皂以及用月桂酰氨與D/L-GA制成的肥皂，其洗凈力，起泡力，乳化力，分散力均好。 3潤膚劑 （焦谷氨酸鈉）脫一分子水形成NPCA-Na。保濕性比甘油好。 34 請寫出從葡萄糖到谷氨酸的合成途徑，并說明與合成效率有關(guān)的機(jī)制35第二節(jié) 谷氨酸發(fā)酵機(jī)制 一、工藝過程 谷氨酸發(fā)酵工藝流程谷氨酸發(fā)酵工藝流程 36等電點(diǎn)提取谷氨酸工

18、藝流程等電點(diǎn)提取谷氨酸工藝流程37谷氨酸制味精的工藝流程谷氨酸制味精的工藝流程 3839 國內(nèi)用糖蜜發(fā)酵，要加吐溫（表面活性劑） 國外用糖蜜發(fā)酵，日本加青霉素，法國不用青霉素、吐溫、是由其菌特點(diǎn)所決定 Glu生長水平好壞有關(guān)因素： 菌種、工藝、設(shè)備條件協(xié)同配和 正常條件下，菌體產(chǎn)生Glu在發(fā)酵液中為1mg/ml(1) 谷氨酸代謝調(diào)節(jié)，細(xì)胞膜透性調(diào)節(jié)與環(huán)境條件協(xié)同配和。40第二節(jié) 谷氨酸生物和成途徑 代謝控制發(fā)酵是用遺傳學(xué)或其他生物化學(xué)的方法，人為 地在分子水平上改變和控制微生物的代謝，打破微 生物正常的代謝調(diào)節(jié)，使有用產(chǎn)物大量生成和積累。 氨基酸發(fā)酵是典型的代謝控制發(fā)酵，發(fā)酵技術(shù)的關(guān)鍵是打破微

19、生物的正常代謝調(diào)節(jié)，人為控制微生物的代謝。 葡萄糖經(jīng)糖酵解葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP途徑途徑)和己糖磷酸支路和己糖磷酸支路(HMP途徑途徑)生生成丙酮酸，再氧化成成丙酮酸，再氧化成 乙酰乙酰CoA，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，再通過乙醛酸循環(huán)、再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用，生成固定作用，生成-酮戊二酸，酮戊二酸，-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，存在的條件下，生成谷氨酸。生成谷氨酸。HOOC CH 2 CH 2 CH COOHNH241由葡萄糖生物合成谷氨酸由葡萄糖生物合成谷氨酸42 二、 氨的導(dǎo)入 還原氨基化反應(yīng) （GDH）

20、轉(zhuǎn)氨反應(yīng)（AT） 谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng) 431、谷氨酸生物合成中的幾個(gè)途徑（正常途徑）（1）糖酵解途徑 （EMPEMP）（2）磷酸已糖途徑 （HMP)HMP)（3）三羧酸循環(huán)(TCA環(huán)) （4）乙醛酸循環(huán) （DCA環(huán)）（5）二氧化碳固定反應(yīng) PEP+CO2+GTP 草酰乙酸+GDP 丙酮酸+CO2+NADH 蘋果酸+NAD 草酰乙酸 CO2 NAD+ NADH+H+（6）-KGA的還原氨基化反應(yīng) PEPPEP羧化酶羧化酶蘋果酸酶蘋果酸酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶C6H12O6 + NH3 + O2 C5H9O4N + CO2 + 3H2O在GA產(chǎn)生菌菌體內(nèi)CO2固定反應(yīng)有以下兩條途徑：

21、44蘋果酸酶蘋果酸酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇丙酮磷酸烯醇丙酮 酸羧化酶酸羧化酶CO2固定反應(yīng)固定反應(yīng)(丙酮酸羧化支路丙酮酸羧化支路)452、GA生物合成的理想途徑（1）GA產(chǎn)生菌必須具備以下條件（內(nèi)在因素 ）-酮戊二酸脫氫酶的活性微弱或缺失TCA環(huán)阻斷， -酮戊二酸積累琥珀酸輔酶A TCA環(huán)正常 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH的氧化能力欠缺或喪失積累NADPH，抑制KGA的脫羧氧化46 GA產(chǎn)生菌體內(nèi)必須有乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶通過該酶酶活性調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)DCA循環(huán)的封閉，GA 發(fā)酵積累 菌體有強(qiáng)烈的L谷氨酸脫氫酶活性KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP

22、提供NADPH,用于還原-酮戊二酸生成谷氨酸，形成氧化還原共扼體系該反應(yīng)的關(guān)鍵是與異檸檬酸脫羧氧化相偶聯(lián) 47 3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A + 乙酰輔酶A檸檬酸 則有： 3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4N+ 4 CO2 產(chǎn)率：147 /（180*3/2） = 54.4% CO2 谷氨酸 在前述GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上，體系不存在CO2固定反應(yīng)，則有：體系存在CO2的固定反應(yīng)結(jié)論通過DCA環(huán)提供C4二羧酸時(shí)谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率僅為54.4%在谷氨酸發(fā)酵中，DCA環(huán)可以作為TCA循環(huán)有缺陷時(shí)C4二羧酸的補(bǔ)充 48

23、.在前述GA 合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（封閉乙醛酸循環(huán)）存在CO2固定反應(yīng)，則有：Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2則有： C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + CO2 （來自何方）產(chǎn)率：147 / 180 = 81.7%乙酰輔酶A + C4二羧酸 CO2 草酰乙酸（草酰乙酸羧化酶）蘋果酸（蘋果酸激酶）檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）谷氨酸49四碳二羧酸的來源在生產(chǎn)菌中檢出CO2固定反應(yīng)酶活性磷酸烯醇丙酮酸(PEF)羧化酶和蘋果酸酶 谷氨酸對糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.7%C6H12O6+NH3+1.5O2 C5H9O4N+CO2+3H2O需要Mn2+做催化劑，所以，在GA發(fā)

24、酵過程中需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充Mn2+實(shí)際上，發(fā)酵過程中不可能控制檸檬酸合成所需的C4二羧酸完全來自于CO2固定反應(yīng)，體系也不可能完全不存在CO2固定反應(yīng)，因此，GA 發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率應(yīng)在：54.4%81.7%。目前，國內(nèi)的GA生產(chǎn)企業(yè)的糖酸轉(zhuǎn)化率通常都在50%以內(nèi)：50 提高GA的潛力是很大的，具體表現(xiàn)在： （1）強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)，具體措施：Mn2+ ，生物素， （2）控制溶氧濃度是非常重要的 低的溶氧濃度，則丙酮酸向乳酸方向轉(zhuǎn)化 高的溶氧濃度，則NADPH 有被氧化的可能，51氨的導(dǎo)入 還原氨基化反應(yīng)為主導(dǎo)性反應(yīng) 由谷氨酸脫氫酶（GDH）所催化 轉(zhuǎn)氨酶（AT）催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng) 利用已存在的其他

25、氨基酸，經(jīng)過轉(zhuǎn)氨酶的作用，將其它氨基酸與 生成L-谷氨酸 谷氨酸合成酶（GS）催化的反應(yīng) 以 -酮戊二酸為基質(zhì)不能生成Glu，從此可看出H2來自 酮戊二酸2NADPH52氨的導(dǎo)入合成谷氨酸的反應(yīng)有3種：-酮戊二酸 + 天冬氨酸或丙氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶AT谷氨酸-酮戊二酸+-酮戊二酸+谷氨酰胺NADPH+2谷氨酸NADP+谷氨酸合成酶GS-酮戊二酸NH4+NADPH谷氨酸H2ONADP+谷氨酸脫氫酶GHD+53（2）影響谷氨酸合成的外在因素a、生物素對糖代謝的影響生物素參與糖代謝作用：增加糖代謝的速度(對TCA有促進(jìn)作用）乳酸積累碳源利用率降低，發(fā)酵液的pH值下降。而丙酮酸氧化脫羧的速度未改變丙酮酸

26、積累A、生物素對GA發(fā)酵的影響主要影響糖降解速度，不影響EMP與HMP途徑的比率。生物素充足的條件下，丙酮酸以后的氧化活性雖然也得到提高，但由于糖降解速度顯著提高，打破了糖降解速度與丙酮酸氧化速度之間的平衡，丙酮酸趨于生成乳酸的反應(yīng)，引起乳酸的溢出。5455研究表明，異檸檬酸裂解酶活性 為醋酸誘導(dǎo) 受琥珀酸的阻遏，抑制當(dāng)VH缺乏時(shí)： （1）丙酮酸的有氧氧化就會(huì)減弱，則：乙酰輔酶A的生成量就會(huì)少，醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；通過控制生物素亞適量，幾乎看不到異檸檬酸裂解酶的活性（2）VH對TCA循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)

27、；乙醛酸循環(huán)基本上是封閉的，代謝流向異檸檬酸-酮戊二酸谷氨酸的方向高效率地移動(dòng)兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。b、控制VH的濃度，以實(shí)現(xiàn)對于乙醛酸循環(huán)的封閉56c、生物素對氮代謝的影響VH豐富時(shí)，出現(xiàn)“只長菌，不產(chǎn)酸只長菌，不產(chǎn)酸”的現(xiàn)象 GA發(fā)酵過程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。結(jié)論氨的導(dǎo)入時(shí)生物素缺乏， NH4+影響糖代謝速度：提高糖代謝速度高效合成谷氨酸生物素充足時(shí)， NH4+不影響糖代謝速度57關(guān)于氮代謝的調(diào)節(jié)： 控制谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵之一就是降低蛋白質(zhì)的合成能力，

28、使合成的谷氨酸不能轉(zhuǎn)化成其他氨基酸或參與蛋白質(zhì)合成。在生物素亞適量的情況下，幾乎沒有異檸檬酸裂解酶，琥珀酸氧化能力弱，蘋果酸和草酰乙酸脫羧反應(yīng)停滯，在銨離子適量存在下，生成積累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通過轉(zhuǎn)氨作用生成其他氨基酸和合成蛋白質(zhì)。在生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性增強(qiáng)，琥珀酸氧化能力增強(qiáng)，丙酮酸氧化力加強(qiáng)，乙醛酸循環(huán)的比例增加，草酰乙酸、蘋果酸脫羧反應(yīng)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)，谷氨酸減少，合成的谷氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用生成的其他氨基酸量增加。 58d、VH對菌體細(xì)胞膜通透性的影響通常谷氨酸發(fā)酵采用的菌種都是VH-，而VH又是菌體細(xì)胞膜合成的必須物質(zhì)，因此，可以通過控制VH的濃度（干擾磷脂

29、中的脂肪酸的生物合成）干擾磷脂中的脂肪酸的生物合成）來實(shí)現(xiàn)的來實(shí)現(xiàn)對菌體細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié) 。葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰輔酶A 乙酰輔酶 乙酰輔酶A羧化酶（輔酶是VH ）CO2 丙二酰輔酶A 丙二酰輔酶A C4 C6 CO2 培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi)AA 92% 胞外 培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi)AA 12% 胞外 CO2 59 Glu生產(chǎn)菌大多是生物素缺陷型，發(fā)酵時(shí)控制生物素亞適 量，使細(xì)胞變形拉長，改變了細(xì)胞膜的通透性引起代謝失 調(diào)使Glu得以積累。 生物素貧乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的Glu含量少而且容易析出，而培 養(yǎng)基中積累大量的Glu；生物素豐富時(shí)，培養(yǎng)基中幾乎不 積累Glu，而細(xì)胞內(nèi)卻含有

30、大量的Glu，且不易被析出。 這說明生物素對細(xì)胞膜通透性有重要影響。這說明生物素對細(xì)胞膜通透性有重要影響。 谷氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵在于發(fā)酵培養(yǎng)期間谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生特異性變化，使細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變成有利于谷氨酸向膜外滲透的形態(tài)，使終產(chǎn)物不斷排出細(xì)胞外，胞內(nèi)谷氨酸不能積累到引起反饋調(diào)節(jié)的濃度，胞內(nèi)谷氨酸源源不斷被優(yōu)先合成，分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中積累。60B、供氧濃度 過量：NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使-KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA 的生成。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。C、NH4+濃

31、度 （1）影響到發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)： 過低，不利于-KGA的還原氨基化；過高，產(chǎn)生谷氨酰胺。 NH4+的供給方式： （1）液氨 （2）流加尿素61D、磷酸鹽 過量：（1）促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之 間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等 （2）產(chǎn)生并積累Val， Glucose 丙酮酸 丙酮酸 + 活性乙醛 -乙酰乳酸 Val Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 （2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率 （3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴(yán)重的影響GA 的結(jié)晶、提出 62n 研究證明：研究證明： 谷氨酸生產(chǎn)菌種存在EMP途徑的全部酶和HMP途徑 的酶有關(guān)

32、TCA循環(huán)中的檸檬酸、順烏頭酸、異檸檬酸能定量地生 成谷氨酸，其相應(yīng)的酶與谷氨酸合成有關(guān) 以醋酸和乙醇為原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，DCA循環(huán)是C4 二羧酸的唯一補(bǔ)充來源；但是以葡萄糖為原料時(shí)，在谷 氨酸生成期此循環(huán)應(yīng)關(guān)閉 谷氨酸菌存在CO2固定生成草酰乙酸的PEP羧化酶和蘋果 酸酶，與谷氨酸得率正相關(guān)63 一. 控制細(xì)胞膜透性的方法 1. 化學(xué)控制方法 通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中的化學(xué)成分,達(dá)到控制磷脂,細(xì)胞膜的形成或阻礙細(xì)胞壁正常的生物合成,使谷氨酸生產(chǎn)菌處于異常的生理狀態(tài),以解除細(xì)胞對谷氨酸向胞外漏出的滲透障礙。64 控制磷脂的合成,導(dǎo)致形成磷脂合成不足的不完全的細(xì)胞膜 (1) 生物素缺陷型 使用生

33、物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí),必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度. a. 作用機(jī)制: 生物素作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶的輔酶,參與了脂肪酸的合成,進(jìn)而影響磷脂的合成.當(dāng)磷脂合成減少到正常量的1/2左右時(shí),細(xì)胞變形、谷氨酸向膜外漏出,積累于發(fā)酵液中。 65 b. 控制的關(guān)鍵 為了形成有利于谷氨酸向外滲透的磷脂合成不足的細(xì)胞膜,必須亞適量控制生物素(5-10ug/l)發(fā)酵初期(0-8h)菌體正常生長,菌體形態(tài)為單個(gè) 成對 八字形 棒形 橢圓 短桿形,當(dāng)生物素耗盡后,在菌的再次倍增期間,開始出現(xiàn)異常形態(tài)的細(xì)胞,菌體伸長,膨大乃至不規(guī)則形,邊緣有折縐,稍模糊電鏡觀察似皰疹樣

34、，完成谷氨酸非積累型細(xì)胞向積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變,形成磷脂合成不足的不完全的細(xì)胞膜.谷氨酸高產(chǎn)。若生物素過剩,就會(huì)只長菌不產(chǎn)酸或長菌好產(chǎn)酸低。66 (2) 添加表面活性劑(如吐溫60)或是飽和脂肪酸(C16-18) 使用生物素過量的糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸時(shí)通過添加表面活性劑(吐溫60)或高級(jí)飽和脂肪酸(C16-18)及其親水聚酸脂類,同樣能清除滲透障礙物，積累谷氨酸 a. 作用機(jī)制 表面活性劑 、高級(jí)飽和脂肪酸的作用,并不在于它的表面效果,而是在不飽和脂肪酸的合成過程中,作為抗代謝物具有抑制作用,對生物素有拮抗作用,通過拮抗脂肪酸的生物合成導(dǎo)致磷脂合成不足,結(jié)果形成磷脂不足的細(xì)胞膜,提高了細(xì)胞膜對谷

35、氨酸的滲透性67 b. 影響產(chǎn)酸的關(guān)鍵,必須控制好添加表面活性劑.飽和脂肪酸的時(shí)間與濃度,必須在藥劑添加后.在這些藥劑存在下,再次進(jìn)行細(xì)菌的分裂繁殖.形成處于異常生理狀態(tài)的產(chǎn)酸型細(xì)胞,即完成谷氨酸非積累型細(xì)胞向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變.例如,以甜菜糖蜜為原料,采用高生物素 高吐溫工藝。一般于發(fā)酵對數(shù)生長期的早期(4-6h),添加0.2吐溫60，之后OD值與菌體重約凈種增一倍,剩余生長太多,意味著谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞不能完成有效的生理學(xué)變化，剩余生長不足,意味著谷氨酸生產(chǎn)菌沒有機(jī)會(huì)完成這種轉(zhuǎn)變.68 (3) 油酸缺陷 使用油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí),必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸的濃度，由于油酸缺陷型突

36、變株切斷了油酸的后期合成,喪失了自身合成油酸的能力69 (4) 甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí),必須限制發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的濃度 阻礙谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁的合成 作用機(jī)制:添加青霉素是抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁的后期合成，進(jìn)而導(dǎo)致形成不完全的細(xì)胞膜。 影響產(chǎn)酸關(guān)鍵：70 2、物理控制方法： 利用溫度敏感突變株 突變位置：發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個(gè)堿基為另一個(gè)堿基所置換，這樣為基因所指導(dǎo)譯出的酶，在高溫時(shí)失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。 影響產(chǎn)酸關(guān)鍵：控制溫度轉(zhuǎn)換的時(shí)間（30提高到40 的時(shí)間），并要在溫度轉(zhuǎn)換之后進(jìn)行適度的剩余生長。

37、71第四節(jié) GA生產(chǎn)菌的特征 育種及擴(kuò)大培養(yǎng)一、谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征與菌學(xué)性質(zhì)1. 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)主要是四個(gè)屬 短桿菌科 短桿菌屬(Brevibacteriaceea) (Brevibacterium) 1.棒狀桿菌屬(Corgnebacferium) 棒桿菌科 2.小桿菌屬(Microbacterium)(Corgnebacteriaceae) 3.節(jié)桿菌(Arthrobacter) 72 2. 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 這些菌曾分屬四個(gè)屬,但它們在形態(tài)及生理方面仍有許多共同的特征 （1）細(xì)胞形態(tài)為球形、 棒形以至短桿形 （2） G+無芽孢， 無鞭毛,不能運(yùn)動(dòng) （3）都是需氧型微生物 （

38、4）都是生物素缺陷型 （5）脲酶強(qiáng)陽性 （6）不分解淀粉 、纖維素、 油脂 、酪蛋白及明膠等73 （7）發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化,同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化 （8）CO2固定酶系活力強(qiáng) （9）異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱,乙醛酸循環(huán)弱 （10） 氧化能力缺失或微弱 （11）還原性輔酶進(jìn)入呼吸鏈能力弱 （12）檸檬酸合成酶 、烏頭酸酶 、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng) （13）能利用醋酸,不能利用石蠟 （14）具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力 （15）不分解利用谷氨酸,并能耐高濃度的谷氨酸,產(chǎn)生谷氨酸5以上酮戊二酸74 二. 國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌及其比較 國內(nèi)谷氨酸發(fā)酵已有40年歷史.目前使用

39、的菌株主要有: 北京棒桿菌(AS.1299) 7338 S-941 WTH-1 鈍齒棒桿菌(AS1.542) 、HU7251 、B9 B9-17-36 F-263 天津短桿菌(T6-13) FM-8207 FM-415 U-9 CMTC6282 TG-3 TG-866 D85等菌株 多數(shù)廠家常用 : B9 T6-13 7338等75（一）、北京棒桿菌（7338）與鈍齒棒桿菌（B9）的比較在實(shí)際生產(chǎn)中，7338菌株與B9菌株的主要區(qū)別如下：細(xì)胞大小與細(xì)胞形態(tài)B9的細(xì)胞明顯大于7338菌 在發(fā)酵液提取GA上容易與菌分離，提取容易，發(fā)酵穩(wěn)定。而7338因菌體細(xì)胞小，相對受噬菌體污染稍輕。B9菌在發(fā)酵

40、過程中有明顯的菌體形態(tài)變化，菌體發(fā)生伸長 膨大，而7338菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化，相對不夠明顯。76 菌體本身的等電點(diǎn)不同 7388在PH4.2-3.0。特別3.5-3.0菌大量沉降，同GA等電點(diǎn) 菌分離困難，而B9不在此范圍，易分離 菌落顏色 7338 乳白色 B9為草黃色 發(fā)酵過程分泌色素少77 脲酶 7388 B9 活力低 耐受力強(qiáng) 活力高 耐受低 初尿可達(dá)1.8-2.0 初尿 0.8 流尿 2-3次 流尿 4-6次 生物素用量 要求范圍狹窄 4-5ug/l 較粗放5-8ug/l （由初糖定） 生長因子 都以生物素為必需生長因子， 7388還需要硫胺素78 發(fā)酵周期 7388后勁足 ，

41、而前期卻不明顯， 周期稍長 噬菌體類型 不同 ，不交叉感染 ，可相調(diào)換 酯酶譜帶 蛋白酶譜帶 ，代謝產(chǎn)物都不盡相同 。79 天津短桿菌（T6-13）與純齒棒桿菌（B9）的比較 細(xì)胞大小 ： 小且多，泡沫稍大 提取比B9困難 菌體形態(tài) 斜面淡白色 草黃色 發(fā)酵中形態(tài)變化比B9大前期細(xì)胞比較短，圓滾滾，16h后拉長3倍以上 發(fā)酵溫度 前 32-34 前 30-32 中后 36-38 中后 34-35 （有利于夏天降溫條件差的工廠）80 脲酶活力 更強(qiáng) 初尿0.5-0.6 宜少量多次 生物素用量 比B9低20左右 糖酸轉(zhuǎn)化率不同 45%以上 40-45% 噬菌體類型 相同 膠體量 分泌膠體較多 會(huì)干

42、擾等電點(diǎn)GA結(jié)晶和菌體分離 菌體本身等電點(diǎn) 接近谷氨酸等電點(diǎn) 提取收率較高為4.2-3.0之間81三、谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化 在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)GA生產(chǎn)菌發(fā)酵過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)明顯的菌體形態(tài)的變化。在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)有明顯的變化時(shí)，正是產(chǎn)GA的激增時(shí)間。 但在發(fā)酵培養(yǎng)基含有過剩生物素的培養(yǎng)條件下，菌體形態(tài)則沒有明顯變化，卻呈現(xiàn)耗糖 長菌 不產(chǎn)谷氨酸的異常發(fā)酵。82 種子的菌體形態(tài) 將斜面和一、 二級(jí)種子培養(yǎng)的菌體，用結(jié)晶紫染色，經(jīng)顯微觀察，發(fā)現(xiàn)B9菌，在一 、二級(jí)種子和斜面種子培養(yǎng)的不同培養(yǎng)條件下，細(xì)胞形態(tài)基本形似，稍有差異。 斜面菌稍小，一 、二級(jí)種子菌體大而粗壯，革蘭氏染色深 。 0

43、.7-0.91.03.4um 折斷分裂成V字形 ，為谷氨酸非積累型細(xì)胞。83 谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 生物素為VB的一種，也叫做或輔酶R ，參與脂肪酸生物合成限速反應(yīng)的關(guān)鍵酶，乙酰CoA羧 化酶的輔酶 ，參與脂肪酸合成。 通過控制生物素亞適量，使發(fā)酵7-10h后，生物素處于貧乏狀態(tài)。16-20h后，生物素消耗完，完成谷氨酸非積累型細(xì)胞向積累型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為OD值穩(wěn)定，GA產(chǎn)量直線上升，直至發(fā)酵結(jié)束。 84 從GA發(fā)酵中菌形態(tài)變化來看，可分為三個(gè)時(shí)期： 以發(fā)酵30-36h的正常GA發(fā)酵為例： 發(fā)酵0-8h或0-10h為長菌型細(xì)胞，形態(tài)與二級(jí)種子相似短桿至棒狀菌呈單個(gè)、 成對或“V”字型

44、發(fā)酵8-18h或10-20h為轉(zhuǎn)移期細(xì)胞，此階段細(xì)胞形態(tài)急劇變化。細(xì)胞開始伸長、 膨大。從GA非積累型細(xì)胞向GA積累型細(xì)胞（產(chǎn)酸型細(xì)胞）轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移期有長菌型細(xì)胞，也有產(chǎn)酸型細(xì)胞，產(chǎn)酸速度逐漸加快。85 發(fā)酵16-20h后為產(chǎn)酸型細(xì)胞，細(xì)胞為含磷脂不足的異常形態(tài)，呈現(xiàn)伸長、 膨大 、不規(guī)則， 缺乏“V”字型排列，有的呈彎曲形，邊緣顏色淺，稍模糊，有的邊緣折縐及至殘缺不齊，但菌體形態(tài)基本清楚。在發(fā)酵后期，細(xì)胞較長，多呈現(xiàn)有明顯的橫隔（1-3個(gè)或更多）的多節(jié)細(xì)胞，類似花生狀，產(chǎn)酸高，在糖酸轉(zhuǎn)化率高時(shí)尤甚。 86 GA發(fā)酵感染噬菌體后的形態(tài) 感染噬菌體 形態(tài)也會(huì)發(fā)生改變。 感染噬菌體時(shí)期不同 改變也不

45、同 1. 前期染噬菌體 鏡檢可見細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞不規(guī)則、發(fā)圓、發(fā)胖、 缺乏“V”字形排列 視野中有明顯的細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)蛛絲、 拉網(wǎng)， 互相堆在一起。幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞，類似蛛網(wǎng)或魚鱗狀，生產(chǎn)上表現(xiàn)為排氣口CO2迅速下降，相繼出現(xiàn)OD值下跌PH上升或不上升，耗糖緩慢等異常發(fā)酵，應(yīng)立即停止發(fā)酵進(jìn)行救治。872、發(fā)酵中、 后期感染噬菌體的菌體形態(tài)菌體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則 ，邊緣不整齊 有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西。有細(xì)胞碎片，不同于正常發(fā)酵的產(chǎn)酸細(xì)胞。一般說在生產(chǎn)上中 、后期感染噬菌體，OD值雖下降，也常伴有泡沫多、黏度大、耗糖緩慢等異?，F(xiàn)象，但及時(shí)補(bǔ)加適量營養(yǎng)物，一般仍可完成發(fā)酵，產(chǎn)酸在

46、4左右，但需注意，由于噬菌體侵染細(xì)胞后會(huì)使細(xì)胞內(nèi)GA溢出，有時(shí)產(chǎn)酸會(huì)反而偏高，會(huì)使噬菌體忽視，這很危險(xiǎn)。仍需注意采取措施加以防治。88 四 谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種 1. 日常菌種工作 定期分純小劑量誘變刺激：可淘汰生長微弱的菌株。高產(chǎn)菌制做安培瓶。 2. 選育耐高滲透壓菌株 耐高糖 選育在20-30葡萄糖的平板上生長好的突變株。 耐高谷氨酸 選育在15-20味精的平板上生長好的突變株。 耐高糖 、高谷氨酸選育在20葡萄糖，加15味精的平板上生長好的突變株。89 3. 選育不分解利用谷氨酸的突變株 使用不分解利用GA，切斷 繼續(xù)向下氧化的反應(yīng)，即選育以谷氨酸為唯一碳源，菌體不長或生長微弱的突變

47、株。 平板法：選育不長或生長微弱的菌。 搖瓶法：選育OD值凈增極少的菌。酮戊二酸90 4. 選育細(xì)胞膜滲透性好的突變株 抗VP類衍生物 選育溶菌酶敏感性突變株 選育二氨基庚二酸缺陷型突變株 二氨基庚二酸為細(xì)胞壁的組成成分 選育溫度敏感突變株91 5. 選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株 選育以琥珀酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長快 、大的菌株 選育氟丙酮酸敏感性突變株 氟丙酮酸是丙酮酸脫氫酶的抑制劑，菌種對氟丙酮酸越敏感，說明菌種丙酮酸向乙酰CoA的轉(zhuǎn)化反應(yīng)越弱，相對地固定反應(yīng)占的比例也就越大。92 6 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 四碳二羧酸是由CO2固定反應(yīng)和乙醛酸循環(huán)所提供的，減弱乙醛酸循環(huán)，固定反

48、應(yīng)所占的比例就會(huì)增大，谷氨酸的產(chǎn)率就高 選育琥珀酸敏感型突變型 琥珀酸是乙醛酸循環(huán)關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶的阻遏物，菌體對琥珀酸越敏感 ，異檸檬酸裂解酶的合成能力就越弱，乙醛酸循環(huán)就越弱。 選育不利用醋酸的突變株 。93 7. 選育強(qiáng)化TCA中從檸檬酸到 代謝的突變株 選育檸檬酸合成酶強(qiáng)的突變株 檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，強(qiáng)化該酶能加強(qiáng)GA的生物合成。 選育抗氟乙酸 、氟化鈉 、氮雜絲氨酸 、氟檸檬酸等突變株 這些物質(zhì)都是烏頭酸酶的抑制劑，抗這些物質(zhì)的突變株，可強(qiáng)化烏頭酸酶的活力酮戊二酸94 8. 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成 選育酮基丙二酸抗性突

49、變株 選育耐高谷氨酸突變株 選育抗谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物突變株 選育抗谷氨酰胺的突變株95 9. 選育強(qiáng)化能量代謝的突變株 GA高產(chǎn)菌的兩個(gè)顯著的特點(diǎn)是 繼續(xù)向下氧化的能力缺陷和乙醛酸循環(huán)微弱，使得GA菌能量代謝受阻，TCA前一段的代謝（檸檬酸合成到生成 ）減慢，強(qiáng)化能量代謝可補(bǔ)救上述兩個(gè)特點(diǎn)造成的不足，使TCA前一段的代謝加強(qiáng)，GA合成的速度加強(qiáng)。 抗呼吸鏈抑制劑突變株 如抗丙二酸 ，氧化丙二酸 ，氰化鉀等的突變株 抗ADP磷酸化抑制劑突變株，如抗2.4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等的突變株 抗抑制能量代謝抗生素的突變株，如抗纈氨霉素 、寡霉素等突變株酮戊二酸酮戊二酸96 10. 選育減弱HMP途徑后

50、段酶活性的突變株 通過HMP途徑也可生成核糖、核苷酸、莽草酸、芳香族氨基酸、輔酶Q、 葉酸等物質(zhì)。這些物質(zhì)生成消耗了葡萄糖，使谷氨酸的產(chǎn)率降低。如果削弱或切斷這些物質(zhì)的合成，就會(huì)使Glu的產(chǎn)率增加 選育莽草酸缺陷型或添加芳香族AA能促進(jìn)生長的突變株 選育抗嘌呤 、嘧啶類似物突變株 選育抗核苷酸類抗生素突變株，如抗德夸菌素 、狹霉素C等突變株。97 五 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和種子質(zhì)量要求 斜面菌株一級(jí)種子培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)發(fā)酵罐 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 斜面菌種的培養(yǎng) 有利于菌種生長而不長酸，并要求斜面菌種絕對純，不得有雜菌、 噬菌體 ，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少糖為原則。 斜面培養(yǎng)基 葡萄糖0.1 蛋白胨1

51、.0 牛肉膏1.0 氯化鈉0.5 瓊脂2.0-2.5 PH7.0-7.2 培養(yǎng)條件 7338 、B9 30-32 T6-13 33-34 培養(yǎng)18-21h 要求菌苔顏色、 邊緣正常 ， 斜面只移接三代 不宜多次移種。98 2. 一級(jí)種子培養(yǎng) 目的：培養(yǎng)大量繁殖活力強(qiáng)的菌體 培養(yǎng)基組分：少含糖分 ，多含有機(jī)氮 以有利長菌考慮 葡萄糖2.5 尿素0.5% 硫酸鎂0.04% 磷酸氫二鉀0.1% 玉米漿2.5-3.5%（按質(zhì)增減） FeSO42ppm MnSO4 2ppm PH7.099 培養(yǎng)條件1000ml三角瓶裝200ml ,滅菌后置于沖程7.6cm 頻率96次/min 往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h

52、 7338 B9 30-32 T6-13 33-34 一級(jí)種子質(zhì)量要求： 種齡12h PH值 6.40.1 光密度凈增OD值0.5以上 殘?zhí)?.5%以下 無菌檢查 噬菌體檢查：無 鏡檢：菌體生長均勻、 粗壯、 排列整齊 。100 3. 二級(jí)種子培養(yǎng) 種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和接種量比例 培養(yǎng)基組成 在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)菌體生長情況酌情增減生物素等用量，隨時(shí)調(diào)整培養(yǎng)基組成。 培養(yǎng)條件 接種量 0.8-1.0% 培養(yǎng)溫度32 （T6-13菌為33-34 ） 培養(yǎng)時(shí)間7-8h ） 101通風(fēng)量： 50l 種子罐 1：0.5 攪拌轉(zhuǎn)速340r/min 250l 種子罐 1：0.3 攪拌轉(zhuǎn)速 300

53、r/min 500l 種子罐 1：0.25 攪拌轉(zhuǎn)速 230r/min（ 通風(fēng)量： 空氣體積/單位體積發(fā)酵液單位時(shí)間 m3/m3.min)二級(jí)種子質(zhì)量要求 種齡7-8h PH7.2左右 OD值 凈增0.5左右 （OD 是 optical density(光密度) ） （DO 是dissolved oxygen;DO（溶解氧） ） 無菌檢查 噬菌體檢查（無） 殘?zhí)?.1%左右 鏡檢：生長旺盛 排列整齊 102 影響種子質(zhì)量的主要因素 培養(yǎng)基構(gòu)成 種子培養(yǎng)基要求含有豐富的N源，足夠的生物素 少量C源，以利于菌體生長，如糖太多，菌代謝活動(dòng)旺盛，產(chǎn)生有機(jī)酸 ，使PH降低菌易衰老。 溫度：幼齡菌對溫度變

54、化敏感 ，應(yīng)避免溫度過高和波動(dòng)過大。 PH值：零小時(shí)時(shí)PH值不宜過高，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)PH值不宜過低 ， PH上升后有所下降時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間已接近結(jié)束。 溶解氧：長菌階段對氧要求比發(fā)酵時(shí)低， 溶氧水平過高， 抑制長菌。 接種量：以1%為宜。 培養(yǎng)時(shí)間：78h。103第五節(jié)淀粉水解糖制備 一、意義及要求： 1、意義：碳源是構(gòu)成谷氨酸的碳架（主要作用），同時(shí)產(chǎn)生能量。 可用于谷氨酸發(fā)酵是淀粉糖、糖蜜，還有醋酸，這些原料一般要預(yù)處理; 因?yàn)楣劝彼岙a(chǎn)生菌不能直接利用淀粉，因而必水解之。 糖蜜的預(yù)處理:目的是降低生物素的含量，因?yàn)楹羞^量的生物素會(huì)影響谷氨酸的積累。處理方法有：活性炭處理、水解活性炭處理、樹脂處理

55、。104磷酸鹽、玉米漿、鎂鹽等分過濾器發(fā)酵灌調(diào)和配料預(yù)處理（水解）發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)pH連消菌種罐粗谷氨酸中和搖瓶菌種原料種子培養(yǎng)基空氣斜面尿素貯罐空氣凈化系統(tǒng)脫色結(jié)晶濃縮成品味精 谷氨酸發(fā)酵工藝流程谷氨酸發(fā)酵工藝流程105淀粉 葡萄糖糖蜜 稀釋蜜配 料 種子罐玉米漿糖 蜜磷酸二氫鉀硫酸鎂無菌空氣Fe2+ 、Mn2+NH3菌種發(fā)酵罐106等電提取中 和除 鐵脫 色濃縮、結(jié)晶離 心干 燥味味 精精發(fā)酵罐Na2CO31072、淀粉水解糖液必須具備要求：滿足以下條件：含糖量16%糖液清凈糖液不含糊精糖液不變質(zhì)透光率：90%以上 轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率：90%90%左右左右 水解糖液數(shù)量（升）水解糖液數(shù)量（升） 含

56、糖量（含糖量（% %） 100%100%轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率= = 投入淀粉量（公斤）投入淀粉量（公斤） 原料淀粉中含純淀粉原料淀粉中含純淀粉% % 1.11 1.11DE值即葡萄糖值。用以表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是葡萄糖（所有測定的還原糖權(quán)當(dāng)作葡萄糖來計(jì)算）占干物資的百分率。即：DE值= 100% 還原糖用斐林氏法或碘量法測定，干物質(zhì)用阿貝折光儀測定。在此值得注意的是，阿貝折光儀所測出的濃度是指100g糖液中所含有的干物質(zhì)的克數(shù)；而還原糖含量是指100ml糖液中所含有的還原糖的克數(shù)。因此，DE值實(shí)際還應(yīng)除以糖液的相對密度。干物質(zhì)還原糖108 DX值：糖化液中的葡萄糖含量占干物質(zhì)的百分率稱為D

57、X值。 DX值=葡萄糖含量（%）/干物質(zhì)含量（%）糖液相對密度100% DE值與DX值的區(qū)別：葡萄糖的實(shí)際含量稍低于葡萄糖值，因?yàn)檫€有少量的還原性低聚糖存在。隨著糖化程度的增高，兩者的差別減少。109 二、淀粉水解糖的制備方法 1、酸解法： 原理：以無機(jī)酸或有機(jī)酸為催化劑，在高溫高壓下將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。 特點(diǎn)：生產(chǎn)方便，設(shè)備簡單，水解時(shí)間短，設(shè)備生產(chǎn)能力大。 要求設(shè)備耐腐蝕、耐高溫、耐高壓，對原料要求嚴(yán)格、易發(fā)生付反應(yīng)、淀粉轉(zhuǎn)化率低。 110 淀粉的淀粉的水解反應(yīng)水解反應(yīng) 淀粉水解總的趨勢是大分子向小分子轉(zhuǎn)化，隨著淀粉水解程度淀粉水解總的趨勢是大分子向小分子轉(zhuǎn)化，隨著淀粉水解程度的增加

58、，糖化液的還原性不斷增加。的增加，糖化液的還原性不斷增加。淀粉淀粉(amylum)糊精糊精(dextrin)低聚糖低聚糖(oligosaccharides )葡萄糖葡萄糖(glucose) 淀粉水解的化學(xué)反應(yīng)可簡單表示如下：淀粉水解的化學(xué)反應(yīng)可簡單表示如下： （C6H10O5)n+nH2O n (C6H12O6) 由于有水參與，反應(yīng)結(jié)果有化學(xué)增重。由于有水參與，反應(yīng)結(jié)果有化學(xué)增重。 理論上，淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為理論上，淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為 180.16/162.14 100%=111.1% 實(shí)際轉(zhuǎn)化率只有實(shí)際轉(zhuǎn)化率只有90%。 當(dāng)葡萄糖值超過當(dāng)葡萄糖值超過60時(shí)，由于葡萄糖復(fù)合分解

59、反應(yīng)產(chǎn)生時(shí)，由于葡萄糖復(fù)合分解反應(yīng)產(chǎn)生其他有味物質(zhì)（龍膽二糖有苦味）及有色物質(zhì)。其他有味物質(zhì)（龍膽二糖有苦味）及有色物質(zhì)。 111 淀粉水解的副反應(yīng)淀粉水解的副反應(yīng) 葡萄糖的復(fù)合反應(yīng)葡萄糖的復(fù)合反應(yīng) 水解水解 熱、酸熱、酸 -1，6 鍵聚合成異麥芽糖鍵聚合成異麥芽糖淀粉淀粉 葡萄糖糖苷鍵聚合葡萄糖糖苷鍵聚合 -1，6鍵聚合成龍膽二糖鍵聚合成龍膽二糖 復(fù)合反應(yīng)有害，降低葡萄糖收率。多數(shù)復(fù)合糖不能被微生復(fù)合反應(yīng)有害，降低葡萄糖收率。多數(shù)復(fù)合糖不能被微生物利用。殘?zhí)嵌?，產(chǎn)物提取精制困難。物利用。殘?zhí)嵌?，產(chǎn)物提取精制困難。112 葡萄糖的分解反應(yīng)葡萄糖的分解反應(yīng) 水解水解 熱、酸熱、酸 淀粉淀粉 葡萄

60、糖葡萄糖 分解分解 5-羥甲基糠醛羥甲基糠醛 甲酸、乙酰丙酸、有色物質(zhì)。甲酸、乙酰丙酸、有色物質(zhì)。 在淀粉的酸水解過程中，葡萄糖因分解損失的在淀粉的酸水解過程中，葡萄糖因分解損失的量在量在1%，但，但5-羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增羥甲基糠醛是產(chǎn)生色素的根源，增加精制的困難。加精制的困難。 5-羥甲基糠醛的含量高，則色素的形成量增多。羥甲基糠醛的含量高，則色素的形成量增多。反應(yīng)中形成的氨基糖，也對發(fā)酵有影響。反應(yīng)中形成的氨基糖，也對發(fā)酵有影響。113 2、酶解法（酶酸法）： 原理：先將淀粉乳用-淀粉酶液化，然后用酸將其水解成葡萄糖。 適用性：適于大米或粗淀粉原料，可省去其精制過程，避免淀粉在