臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控

1、存在的問(wèn)題存在的問(wèn)題l概念不清l不知道具體怎么做l不會(huì)寫(xiě)室內(nèi)質(zhì)控的SOPl不知道如何選擇室內(nèi)質(zhì)控物l不會(huì)分析室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果第二頁(yè)，共53頁(yè)。室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控SOP存在的問(wèn)題存在的問(wèn)題l責(zé)任人不清。l質(zhì)控物的來(lái)源及濃度不清或不全，并且通常沒(méi)有說(shuō)明陰性質(zhì)控物的來(lái)源。有些是自制，但制備方法不規(guī)范，沒(méi)有任何的質(zhì)量檢驗(yàn)，定量結(jié)果沒(méi)有溯源性。l沒(méi)有明確所選用的質(zhì)控方法。對(duì)前20次的測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控沒(méi)有解決方法。l沒(méi)有明確的失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，只是做了一些失控的含糊敘述。并且一般都沒(méi)有陰性失控的判斷方法。l沒(méi)有失控后的分析及處理措施。 第三頁(yè)，共53頁(yè)。室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（Internal Quality

2、Control,IQC)的概念的概念l由由實(shí)驗(yàn)室工作人員實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測(cè)和監(jiān)測(cè)和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測(cè)定結(jié)確定測(cè)定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作。l可概括為可概括為: :(1)(1)執(zhí)行者執(zhí)行者：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；：實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員；(2)(2)目的目的：監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的重復(fù)性；監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的重復(fù)性；(

3、3)(3)功能功能：決定了當(dāng)批：決定了當(dāng)批測(cè)定的有效性，報(bào)告可否發(fā)出。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定測(cè)定的有效性，報(bào)告可否發(fā)出。是對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的的即時(shí)性評(píng)價(jià)即時(shí)性評(píng)價(jià)。 第四頁(yè)，共53頁(yè)。室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)量控制（IQC）的基本內(nèi)容）的基本內(nèi)容l主要包括三個(gè)方面：（1）測(cè)定前的質(zhì)量控制；（2）統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制；（3）質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)。第五頁(yè)，共53頁(yè)。測(cè)定前的質(zhì)量控制l實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理l理想的試劑和操作方法 l人員培訓(xùn) 第六頁(yè)，共53頁(yè)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理實(shí)驗(yàn)室設(shè)施、儀器設(shè)備及管理l實(shí)驗(yàn)室空間及工作流程的設(shè)計(jì)l實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件的控制：溫濕度控制設(shè)備、穩(wěn)壓或不間斷電源第七頁(yè)，共53頁(yè)。理想的理想的

4、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)A產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)第八頁(yè)，共53頁(yè)。產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)理想的理想的PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)B第九頁(yè)，共53頁(yè)。臨床PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一般原則l各區(qū)獨(dú)立l注意風(fēng)向l因地制宜l方便工作“十六字口訣十六字

5、口訣”第十頁(yè)，共53頁(yè)。產(chǎn)物分析區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間專(zhuān)用走廊專(zhuān)用走廊工作流向工作流向擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗第十一頁(yè)，共53頁(yè)。臨床臨床PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的特點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的特點(diǎn) l“無(wú)基因”概念 l實(shí)驗(yàn)室要有嚴(yán)格的人員進(jìn)入限制和程序 l使用合格的試劑和消耗品 第十二頁(yè)，共53頁(yè)。PCR實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室“污染污染”的主要來(lái)的主要來(lái)源源l臨床標(biāo)本中存在的大量待測(cè)微生物l科研中得到的質(zhì)?？寺以前分析研究的特定微生物l大量存在于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的特定微生物l以前擴(kuò)增產(chǎn)

6、物的殘留污染。這也是PCR實(shí)驗(yàn)室最容易產(chǎn)生的將造成假陽(yáng)性的“污染”。 第十三頁(yè)，共53頁(yè)。PCR實(shí)驗(yàn)室的重要防實(shí)驗(yàn)室的重要防“污染污染”措施措施l實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)格分區(qū)及工作程序的嚴(yán)格遵守 l化學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面可使用10的次氯酸鈉（漂白劑）清洗 ；有些物品比如放置擴(kuò)增反應(yīng)管的盤(pán)必須從污染區(qū)轉(zhuǎn)回到清潔區(qū)時(shí)，在轉(zhuǎn)回之前，應(yīng)將其置于210的次氯酸鈉溶液中過(guò)夜，并充分沖洗。l紫外照射：實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室空間lUNG第十四頁(yè)，共53頁(yè)。儀器設(shè)備及管理儀器設(shè)備及管理lPCR儀、離心機(jī)、加樣器、恒溫設(shè)備等應(yīng)建立技術(shù)檔案，并定期維護(hù);PCR儀、加樣器、恒溫設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)第十五頁(yè)，共53頁(yè)。理想的試劑理想

7、的試劑:試劑的質(zhì)檢試劑的質(zhì)檢l核酸提取或標(biāo)本處理方法的抗干擾能力（能否 有效地去掉PCR抑制物）l測(cè)定下限(Detection limit)（定性測(cè)定）l測(cè)定準(zhǔn)確性和線性范圍l批內(nèi)變異和批間變異l試劑批間的一致性l有否污染l其他：外包裝、試劑的完整性、有效期、說(shuō)明書(shū)等第十六頁(yè)，共53頁(yè)。理想的操作方法l按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作即可嗎?l操作中影響測(cè)定結(jié)果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)l寫(xiě)出具有可操作性的SOP第十七頁(yè)，共53頁(yè)。人員培訓(xùn)人員培訓(xùn)l培訓(xùn)所涉及的范圍:儀器設(shè)備使用、維護(hù)和校準(zhǔn)；試劑、方法原理；質(zhì)量管理體系；相關(guān)法律法規(guī)、相關(guān)領(lǐng)域的新技術(shù)、新理念和新進(jìn)展；實(shí)驗(yàn)操作技能等。l如何培訓(xùn)：講座、討論、自學(xué)和參加培

8、訓(xùn)班等。l培訓(xùn)的評(píng)估：書(shū)面考試、實(shí)驗(yàn)考核、討論心得、論文、綜述等。第十八頁(yè)，共53頁(yè)。統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法l質(zhì)控物濃度的選擇l每次（批）測(cè)定質(zhì)控物的數(shù)量及放置l質(zhì)控規(guī)則lLevey-Jennings質(zhì)控圖方法 l“即刻法”質(zhì)控方法 l“假陽(yáng)性”的統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法第十九頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控物濃度的選擇質(zhì)控物濃度的選擇l定量測(cè)定：測(cè)定線性范圍內(nèi)的高、中、低三種濃度l定性測(cè)定：接近方法測(cè)定下限的濃度l陰性質(zhì)控物第二十頁(yè)，共53頁(yè)。每次（批）測(cè)定質(zhì)控物的數(shù)量及放每次（批）測(cè)定質(zhì)控物的數(shù)量及放置置l標(biāo)本數(shù)量如小于30，弱陽(yáng)性和陰性質(zhì)控各1份，標(biāo)本數(shù)量增加，質(zhì)控物數(shù)量相應(yīng)按比例增加l均勻分散于臨床標(biāo)本中，與臨床標(biāo)本一同

9、處理（核酸提?。﹍擴(kuò)增時(shí)的排列順序，可排于標(biāo)準(zhǔn)品或校準(zhǔn)品之后，臨床樣本之前。但在擴(kuò)增儀中的位置，不應(yīng)永久性的固定的在一個(gè)孔，而應(yīng)在每次擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的順延，以使在一定的時(shí)間內(nèi)，可以盡可能的監(jiān)測(cè)每一個(gè)孔的擴(kuò)增有效性。第二十一頁(yè)，共53頁(yè)。陰性質(zhì)控樣本的種類(lèi)陰性質(zhì)控樣本的種類(lèi)l陰性原血清樣本l實(shí)驗(yàn)過(guò)程中帶入的空管l僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管第二十二頁(yè)，共53頁(yè)。陰性原血清樣本的功能陰性原血清樣本的功能l監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室的以前擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”l由實(shí)驗(yàn)操作所致的標(biāo)本間的交叉污染。具體地說(shuō)，如強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本氣溶膠經(jīng)加樣器所致的污染、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)操作者的手所致的污染、使用翻蓋離心管核酸提取時(shí)在較高溫孵育時(shí)蓋子崩

10、開(kāi)等l擴(kuò)增反應(yīng)試劑的污染。 第二十三頁(yè)，共53頁(yè)。核酸提取過(guò)程中帶入的空管核酸提取過(guò)程中帶入的空管l監(jiān)測(cè)核酸提取過(guò)程中的實(shí)驗(yàn)室“污染”的存在（在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，開(kāi)口放置于核酸提取的操作臺(tái)面區(qū)域內(nèi)，最后以水為基質(zhì)，進(jìn)行擴(kuò)增 ）第二十四頁(yè)，共53頁(yè)。僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管僅含擴(kuò)增反應(yīng)混合液的管l監(jiān)測(cè)試劑的“污染”第二十五頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 l質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式 l質(zhì)控規(guī)則的功能 l常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義 第二十六頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式l通常質(zhì)控規(guī)則以符號(hào)AL來(lái)表示，其中A為質(zhì)控測(cè)定中超出質(zhì)量控制限的測(cè)定值的個(gè)數(shù)，L為控制限，通常用均值或均值13SD來(lái)表示。 l當(dāng)質(zhì)控

11、測(cè)定值超出控制限L時(shí)，即可將該批測(cè)定判為失控。 l常用的13S質(zhì)控規(guī)則，其中1為原式中的A，3s為原式中的L，表示均值3s，其確切的含義為：在質(zhì)控測(cè)定值中，如果有一個(gè)測(cè)定值超出均值3s范圍，即可將該批測(cè)定判為失控。 第二十七頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控規(guī)則的功能 l簡(jiǎn)單地說(shuō)就是用于判斷測(cè)定批的失控還是在控。第二十八頁(yè)，共53頁(yè)。常用質(zhì)控規(guī)則的符號(hào)及定義 符符 號(hào)號(hào) 定定 義義l12S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出2s控制限。l13S 一個(gè)質(zhì)控測(cè)定值超出3s控制限。l22S 兩個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+2s或2s控制限。lR4S 同一批測(cè)定中，兩個(gè)不同濃度質(zhì)控物的測(cè)定值之間的 差值超出4s控制限。l41S 四個(gè)連

12、續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)超出+1s或1s控制限。l7T 七個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值呈現(xiàn)一個(gè)向上或向下的趨勢(shì)變 化。l10X 十個(gè)連續(xù)的質(zhì)控測(cè)定值同時(shí)處于均值（）的同一側(cè)。第二十九頁(yè)，共53頁(yè)。Levey-Jennings質(zhì)控圖方法l也稱(chēng)Shewhart質(zhì)控圖，是由美國(guó)的Shewhart于1924年首先提出，并用于工業(yè)產(chǎn)品的質(zhì)量控制。l二十世紀(jì)五十年代初，Levey-Jennings將其引入臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量控制 。經(jīng)Henry和Segalove的改良，即為目前常用的Levey-Jennings質(zhì)控圖。第三十頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控圖第三十一頁(yè)，共53頁(yè)。第三十二頁(yè)，共53頁(yè)。Levey-Jennings質(zhì)控圖質(zhì)控圖

13、基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義l穩(wěn)定條件下，在20個(gè)IQC結(jié)果中不應(yīng)有多于1個(gè)結(jié)果超過(guò)2SD（95.5%可信限）限度；在1000個(gè)測(cè)定結(jié)果中超過(guò)3SD（99.7%可信限）的結(jié)果不多于3個(gè)。l如以3s為失控限，假失控的概率為0.3%。 第三十三頁(yè)，共53頁(yè)?！凹纯谭ā辟|(zhì)控方法l“即刻法”質(zhì)控方法的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，即Grubs異常值取舍法 ；l只要有3個(gè)以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。第三十四頁(yè)，共53頁(yè)?！凹訇?yáng)性假陽(yáng)性”的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法l基于日常檢驗(yàn)的陽(yáng)性率比值(呈正態(tài)分布)l直接概率計(jì)算方法（不呈正態(tài)分布）第三十五頁(yè)，共53頁(yè)?；谌粘z驗(yàn)的陽(yáng)性率比值基于

14、日常檢驗(yàn)的陽(yáng)性率比值l半Levey-Jennings質(zhì)控圖法 第三十六頁(yè)，共53頁(yè)。質(zhì)控規(guī)則質(zhì)控規(guī)則l當(dāng)陰性質(zhì)控樣本為陽(yáng)性時(shí),不管陽(yáng)性率測(cè)定比值為何，均為失控，所有陽(yáng)性標(biāo)本須重新測(cè)定，并增加一倍陰性質(zhì)控樣本。l如果陰性質(zhì)控樣本為陰性，某次測(cè)定陽(yáng)性比值超出+3SD,則為失控,為1+3S規(guī)則。本次結(jié)果陰性結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性質(zhì)控樣本的情況,決定是否可以發(fā)出,所有陽(yáng)性樣本結(jié)果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽(yáng)性率增高的原因，并在增加一倍陰性質(zhì)控樣本的情況下重新檢測(cè)。第三十七頁(yè)，共53頁(yè)?？赡艿膸追N失控表現(xiàn)可能的幾種失控表現(xiàn) l曲線向上漂移：提示出現(xiàn)污染，污染可能是由于某一天操作上的失誤導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室被污染如標(biāo)本泄漏，產(chǎn)物泄

15、漏，試劑被污染等l向上的趨勢(shì)性變化：可能存在累積性的產(chǎn)物污染，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸累積，從而使病人結(jié)果的陽(yáng)性率逐漸增高。此時(shí)實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行徹底清潔。第三十八頁(yè)，共53頁(yè)。直接概率計(jì)算法直接概率計(jì)算法l按統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律，一個(gè)事件發(fā)生的概率小于5%被稱(chēng)為小概率事件，即發(fā)生的可能性很小。l當(dāng)一個(gè)小概率事件發(fā)生時(shí)，則可能有誤差存在，有必要對(duì)其發(fā)生的原因進(jìn)行分析。l對(duì)每天的日常病人結(jié)果中陽(yáng)性率出現(xiàn)的概率進(jìn)行計(jì)算，如果這種結(jié)果出現(xiàn)的概率小于5%時(shí)，則可判為失控。 第三十九頁(yè)，共53頁(yè)。根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算l在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中某檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果的陽(yáng)性率為p,計(jì)算在n個(gè)血液樣本中有k個(gè)陽(yáng)性結(jié)果的

16、概率。根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算公式如下： P(X=k)=n!/k!(n-k)!pk(1-p)n-k (1) 其中n為當(dāng)次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)，k為陽(yáng)性個(gè)數(shù)，p為陽(yáng)性率。lP(X=k)5%為失控。此時(shí)，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報(bào)告，所有陽(yáng)性標(biāo)本在查清原因后重做。第四十頁(yè)，共53頁(yè)。根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算根據(jù)二項(xiàng)式分布的概率計(jì)算l如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HBV DNA，平常病人結(jié)果的陽(yáng)性率為10%，即p=0.1, 在某一次檢測(cè)25個(gè)樣本出現(xiàn)6個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，19個(gè)陰性結(jié)果，則檢測(cè)過(guò)程中是存在污染的可能性可通過(guò)下述方法計(jì)算。即計(jì)算在25個(gè)樣本中出現(xiàn)6個(gè)或6個(gè)以上陽(yáng)性結(jié)果的概率，此時(shí)的概率為1-（獲得0個(gè)或1個(gè)或2個(gè)或3個(gè)

17、或4個(gè)或多5個(gè)陽(yáng)性結(jié)果的概率）即：l1-P(0)+P(1)+P(2)+P(3)+P(4)=1-(1-0.1)25+25(1-0.1)240.1+300(1-0.1)230.12+2300(1-0.1)220.13+12650(1-0.1)210.14+53130(1-0.1)200.15=0.0334l則在這個(gè)實(shí)驗(yàn)室一次檢測(cè)25個(gè)標(biāo)本獲得6個(gè)或6個(gè)以上陽(yáng)性結(jié)果的概率為3.34%，小于5%，屬于小概率事件，即發(fā)生的可能性很小，可能有污染所致假陽(yáng)性結(jié)果的可能。第四十一頁(yè)，共53頁(yè)。根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算l在血液篩查檢測(cè)中，許多實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)項(xiàng)目如HCV RNA 、CT、結(jié)核桿菌

18、、淋球菌的陽(yáng)性結(jié)果率均較低，這時(shí)雖然可以使用公式（1）計(jì)算概率，但如果標(biāo)本量很大，使用泊松分布來(lái)估計(jì)二項(xiàng)式分布是一種更為簡(jiǎn)便的方法。根據(jù)泊松分布，可使用下式計(jì)算概率： P(X=k) =(np)ke-np/k! (2)l P(X=k)5%為失控。此時(shí)，陰性標(biāo)本可以發(fā)出報(bào)告，所有陽(yáng)性標(biāo)本在查清原因后重做。第四十二頁(yè)，共53頁(yè)。根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算根據(jù)泊松分布的概率計(jì)算l一個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，某項(xiàng)目每次檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率約為2%，則在100個(gè)樣本中出現(xiàn)8個(gè)陽(yáng)性結(jié)果的概率。l根據(jù)泊松分布，可使用公式（2）計(jì)算概率，此時(shí)n=100,p=0.02,k=8, np=2代入公式（2）計(jì)算得 P(X=10) =28e-

19、2/8!=0.0009。第四十三頁(yè)，共53頁(yè)。標(biāo)本間交叉污染的概率計(jì)算l如果所有陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)是連續(xù)性的，則可能存在標(biāo)本間的交叉污染，即陽(yáng)性樣本污染了它鄰近的陰性樣本，這種情況的概率計(jì)算公式如下： P=(n-r+1)/n!/r!(n-r)! （3） 其中n為當(dāng)次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本數(shù)，r為連續(xù)出現(xiàn)陽(yáng)性的個(gè)數(shù)。l 當(dāng)某次實(shí)際測(cè)定標(biāo)本連續(xù)陽(yáng)性的概率大于所計(jì)算的概率，則判為失控。陰性標(biāo)本結(jié)果可以發(fā)出，陽(yáng)性標(biāo)本要考慮標(biāo)本間交叉污染的問(wèn)題。第四十四頁(yè)，共53頁(yè)。標(biāo)本間交叉污染的概率計(jì)算l如在一次檢測(cè)100個(gè)標(biāo)本的HBV DNA檢測(cè)中，所有兩個(gè)陽(yáng)性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-2+1)/100!/2!(1

20、00-2)!=99/4950=0.02 概率為2.0%。 因此，如在100個(gè)標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)為陽(yáng)性次數(shù)有3次，即概率為3.0%，則為失控。l而在一次檢測(cè)100個(gè)標(biāo)本，所有三個(gè)陽(yáng)性結(jié)果連續(xù)出現(xiàn)的概率為： P=(100-3+1)/100!/3!(100-3)!=98/161700=0.0006 概率為0.06%。 因此，如果如在100個(gè)標(biāo)本中，連續(xù)出現(xiàn)三個(gè)為陽(yáng)性次數(shù)有1次，即概率為1.0%，為失控。第四十五頁(yè)，共53頁(yè)。室內(nèi)質(zhì)量控制的評(píng)價(jià)lIQC是一個(gè)集體活動(dòng)，不光是對(duì)實(shí)驗(yàn)室一次測(cè)定的有效性的判斷，也反應(yīng)了實(shí)驗(yàn)室測(cè)定趨勢(shì)的變化。lIQC的失控不能做為處罰的依據(jù)，應(yīng)建設(shè)性的找出失控的原因，針對(duì)其

21、采取措施加以改進(jìn)。l對(duì)IQC應(yīng)定期進(jìn)行評(píng)價(jià)。第四十六頁(yè)，共53頁(yè)。陽(yáng)性質(zhì)控樣本失控的常見(jiàn)原因陽(yáng)性質(zhì)控樣本失控的常見(jiàn)原因l核酸提取中的隨機(jī)誤差。如核酸提取中的丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中擴(kuò)增抑制物的殘留、所用耗材如離心管有PCR抑制物等。l儀器的問(wèn)題。如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。l試劑的問(wèn)題。如Taq酶和/或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等。第四十七頁(yè)，共53頁(yè)。陽(yáng)性質(zhì)控樣本測(cè)定結(jié)果偏低或?yàn)殛幮躁?yáng)性質(zhì)控樣本測(cè)定結(jié)果偏低或?yàn)殛幮越Y(jié)果偏低結(jié)果偏低陰性陰性臨床標(biāo)本中臨床標(biāo)本中無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性臨床標(biāo)本中臨床標(biāo)本中有較強(qiáng)陽(yáng)性有較強(qiáng)陽(yáng)性臨床標(biāo)本

22、臨床標(biāo)本中有陽(yáng)性中有陽(yáng)性臨床標(biāo)本臨床標(biāo)本全為陰性全為陰性觀察臨床標(biāo)本情況觀察臨床標(biāo)本情況所用離所用離心管含心管含抑制物抑制物Taq 酶酶活性降活性降低低核酸提核酸提取試劑取試劑效率低效率低更換進(jìn)更換進(jìn)口離心口離心管管更換更換Taq 酶酶再檢測(cè)再檢測(cè)更換核更換核酸提取酸提取試劑試劑所有標(biāo)本重新檢測(cè)所有標(biāo)本重新檢測(cè)核酸提核酸提取中靶取中靶核酸丟核酸丟失失核酸提核酸提取中抑取中抑 抑物殘抑物殘留留核酸提核酸提取試劑取試劑混入混入擴(kuò)增儀擴(kuò)增儀孔間溫孔間溫度差異度差異隨機(jī)誤差檢測(cè)質(zhì)控樣本及檢測(cè)質(zhì)控樣本及35份已份已知陽(yáng)性樣本知陽(yáng)性樣本質(zhì)控樣本質(zhì)控樣本測(cè)定正常測(cè)定正常且陽(yáng)性樣且陽(yáng)性樣本有些值本有些值增加增加質(zhì)控及已質(zhì)控及已知陽(yáng)性樣知陽(yáng)性樣本測(cè)定仍本測(cè)定仍異常異常按系統(tǒng)誤按系統(tǒng)誤差途徑分差途徑分析析重新提取或已知濃度重新提取或已知濃度DNA在同一孔內(nèi)擴(kuò)增在同一孔內(nèi)擴(kuò)增結(jié)果正常結(jié)果正常結(jié)果仍低結(jié)果仍低進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行擴(kuò)增儀孔溫度儀孔溫度校準(zhǔn)后再校準(zhǔn)后再檢測(cè)檢測(cè)Taq酶或酶或逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶失活失活第四十八頁(yè)，共53頁(yè)。避免假陰性的措施避免假陰性的措施l純化核酸l標(biāo)本重復(fù)雙份測(cè)定 l稀釋標(biāo)本 l使用“內(nèi)質(zhì)控”（Internal Control,IC) 第四十九頁(yè)，共53頁(yè)。陰性質(zhì)控樣本的常見(jiàn)失控原因陰性質(zhì)控樣本的常見(jiàn)失控原因 l擴(kuò)增產(chǎn)物的“污染”l臨床標(biāo)