蛋白質(zhì)結(jié)合率的測(cè)定方法

1、 蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法 平衡透析法基于藥物結(jié)合的平衡原理，是測(cè)定藥物游離濃度最常用的方法。同時(shí)也是研究藥物血漿蛋白結(jié)合率的經(jīng)典方法。為了縮短檢測(cè)時(shí)間，提高樣品分析的通量，目前采用96孔平衡透析裝置孔平衡透析裝置進(jìn)行血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定。該裝置的獨(dú)特設(shè)計(jì)使表面積體積達(dá)到最大化、測(cè)定方法自動(dòng)化，能夠減少非特異性的透析設(shè)備表面的藥物吸附，并且能夠加速待測(cè)樣品的溶解，縮短平衡時(shí)間。1.1.平衡透析法：平衡透析法：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、受實(shí)驗(yàn)因素干擾小等缺點(diǎn)： 1)透析平衡時(shí)間較長(zhǎng)。 2)血漿和緩沖液的pH值以及離子強(qiáng)度必須嚴(yán)格控制。 3)受稀釋作用、GibbsDonn舳效應(yīng)以及體積遷移

2、效應(yīng)的影響。 4)非特異性的透析設(shè)備表面的藥物吸附效應(yīng)。1.1.平衡透析法：平衡透析法： 超濾法利用半透膜原理。為解決超濾過程中非特異性超濾裝置表面的藥物吸附問題在測(cè)定皮質(zhì)激素與血漿蛋白結(jié)合的過程中。Taylor等51對(duì)傳統(tǒng)超濾法進(jìn)行了改進(jìn)，解決了可溶性差以及藥物的吸附問題，使方法特別適合于先導(dǎo)化合物的優(yōu)化。2.2.超濾法：超濾法：優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、不受稀釋效應(yīng)和體積遷移的影響。其最大優(yōu)其最大優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)血漿中游離藥物的快速分離，僅十幾分鐘至數(shù)十分鐘即可收集到足夠供測(cè)定的血漿超濾液，加之與高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，超濾法已廣泛用于大規(guī)模生物樣品的游離藥物濃度測(cè)定。缺點(diǎn)：1)分離

3、過程中結(jié)合平衡不穩(wěn)定。2)對(duì)高蛋白結(jié)合率藥物的游離濃度難以準(zhǔn)確檢測(cè)。3)結(jié)合藥物在透過濾膜時(shí)會(huì)出現(xiàn)泄漏。4)超濾裝置對(duì)藥物具有吸附性。 2.2.超濾法：超濾法：優(yōu)點(diǎn)：是可以在基本不干擾生物體內(nèi)正常生命活動(dòng)的情況下進(jìn)行實(shí)時(shí)采樣和在線分析，可連續(xù)研究在生理?xiàng)l件下體內(nèi)藥物與蛋白的結(jié)合作用。缺點(diǎn)：1)只可測(cè)定藥物的游離濃度，得不到總濃度或結(jié)合藥物濃度的信息。 2)受探針性能的影響，藥物的回收率也受到限制，特別是蛋白結(jié)合率很高的疏水性藥物，回收率較低的問題很嚴(yán)重。3)缺少足夠靈敏的分析方法。3.3.微透析法：微透析法： 微透析法是近年來發(fā)展起來的直接測(cè)定體內(nèi)血漿、組織和其他生理體液中藥物游離濃度的測(cè)定方

4、法。具體操作具體操作如下：將一個(gè)含透析膜的微透析探針用外科法植于血管或組織間隙，透析緩沖液經(jīng)探針泵入，血液中或組織液中的游離藥物通過濃度梯度擴(kuò)散經(jīng)透析膜進(jìn)入探針，透析液收集一段時(shí)間后便可分析測(cè)定其中藥物的游離濃度。近年來，微透析與高效液相色譜毛細(xì)管電泳或質(zhì)譜等分析儀器聯(lián)用在生命過程動(dòng)態(tài)變化的研究中顯示出很好的發(fā)展前景。3.3.微透析法：微透析法： HPAC被用于分析藥物與血漿蛋白的結(jié)合，可由藥物的電泳遷移率的連續(xù)變化計(jì)算出藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)。該方法允許多種藥物同時(shí)進(jìn)樣，并可同時(shí)測(cè)定多種藥物與蛋白的結(jié)合常數(shù)，這對(duì)立體選擇性蛋白結(jié)合的研究非常有用。藥物在蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)可采用已知結(jié)合位點(diǎn)的置換劑

5、來鑒別。采用HPAC測(cè)定苯妥英與人血清蛋白的結(jié)合，闡明了苯妥英與其他藥物競(jìng)爭(zhēng)血漿蛋白結(jié)合位點(diǎn)所導(dǎo)致的藥物間相互作用。4.4.高效親和色譜法高效親和色譜法(HPAC)(HPAC)：4.4.高效親和色譜法高效親和色譜法(HPAC)(HPAC)：優(yōu)點(diǎn)是：1)固定化的生物高聚物具有良好的穩(wěn)定性和恒定的結(jié)合行為。2)色譜系統(tǒng)良好的精密度和重現(xiàn)性可提供大量結(jié)合作用的對(duì)比研究，特別適宜對(duì)映體的選擇性研究。缺點(diǎn)是：1)流動(dòng)緩沖液中蛋白的強(qiáng)紫外吸收可干擾藥物的檢測(cè)。2)光學(xué)異構(gòu)體之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可能不同。3)有時(shí)檢測(cè)到的峰形展寬，可能導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)的估計(jì)錯(cuò)誤。4)藥物與蛋白的結(jié)合會(huì)發(fā)生在毛細(xì)管內(nèi)表面，致使數(shù)據(jù)分析

6、復(fù)雜化。5)遷移率變化的重現(xiàn)性差。5.5.高效前沿分析法高效前沿分析法(HPFA)(HPFA)： HPFA以分子排阻原理為基礎(chǔ)，是近幾年發(fā)展起來的一種能夠同時(shí)測(cè)定藥物與蛋白結(jié)合平衡中游離藥物和總藥物濃度的一種新的色譜方法。HPFA能夠避免高效親和液相色譜(HPAc)存在的問題，在當(dāng)今藥物蛋白結(jié)合的研究中，已成為一種很有發(fā)展前景的技術(shù)。特別是采用集高速高效及高選擇性優(yōu)點(diǎn)于一身的HPcE進(jìn)行前沿分析可以滿足微量樣品的測(cè)定，這種方法稱為HPCEFA，是最具活力的分析技術(shù)之一。HPFA不僅可以用來分析藥物與蛋白之間的相互作用，而且可用來研究存在著快速和可逆平衡的任何物質(zhì)之間的相互作用，特別是為內(nèi)源性活

7、性物質(zhì)的研究提供了快速、準(zhǔn)確的分析方法，因此在藥代動(dòng)力學(xué)研究中將具有廣闊的應(yīng)用前景。5.5.高效前沿分析法高效前沿分析法(HPFA)(HPFA)：優(yōu)點(diǎn)：1)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，允許直接進(jìn)樣，可以連接到在線的高效液相色譜或毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中進(jìn)行自動(dòng)分析。2)所采用的流動(dòng)相是模擬人體生理環(huán)境的磷酸鹽緩沖液，屬于水性介質(zhì)。3)當(dāng)藥物峰與蛋白峰完全分離時(shí)，可同時(shí)從藥物平臺(tái)峰的峰面積和峰高計(jì)算出總藥物濃度和游離藥物濃度。4)串聯(lián)一個(gè)手性高效液相色譜法(HPLc)柱，或與毛細(xì)管電泳手性拆分技術(shù)相結(jié)合，可分別得到外消旋體中兩個(gè)對(duì)映體的平臺(tái)峰，求得蛋白結(jié)合參數(shù)。5)具有調(diào)節(jié)效應(yīng)相當(dāng)于藥物的富集，大大提高了樣品的檢測(cè)限，可用于藥物蛋白結(jié)合率很高、游離藥物濃度極低的藥物研究。6)可以分析納摩爾級(jí)的樣品，或進(jìn)行納升量樣品的測(cè)定。HPFA對(duì)于分析藥物與缺乏的或較難獲得的蛋白質(zhì)的結(jié)合研究是非常有利的?？傊?，測(cè)定藥物血漿蛋白結(jié)合率的方法還有很多，如超速離心法超速離心法，該法對(duì)藥物的吸收較少，主要受藥物沉積作用的影響；凝膠過濾凝膠過濾法法，該法省時(shí)快速，可適用于高分子量的藥