實驗一、質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳

1、一、質(zhì)粒一、質(zhì)粒DNA的提取及電泳檢測的提取及電泳檢測二、目的基因的二、目的基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測三、三、DNA的定性定量分析及酶切產(chǎn)物檢測的定性定量分析及酶切產(chǎn)物檢測質(zhì)粒雙酶切PCR產(chǎn)物雙酶切四、酶切產(chǎn)物及四、酶切產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物的純化及檢測產(chǎn)物的純化及檢測五、五、DNA的連接及檢測的連接及檢測六、大腸桿菌的培養(yǎng)和超級感受態(tài)細(xì)胞的制備六、大腸桿菌的培養(yǎng)和超級感受態(tài)細(xì)胞的制備七、質(zhì)粒七、質(zhì)粒DNA的原核轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選的原核轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選酶切產(chǎn)物+酶切產(chǎn)物T載體+PCR產(chǎn)物實驗學(xué)時：實驗學(xué)時：6 學(xué)時學(xué)時實驗類型：綜合性實驗類型：綜合性每組人數(shù)：每組人數(shù)： 4 人組人組一、

2、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提通過本實驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的技術(shù)和方法。取質(zhì)粒的技術(shù)和方法。 一、堿裂解法小量制備質(zhì)粒一、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA質(zhì)粒按復(fù)制方式分為兩種類型：松弛型質(zhì)粒 20200個拷貝 /細(xì)胞 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 12個拷貝 /細(xì)胞由由pUC18載體改建而成，在載體改建而成，在pUC18載體的載體的MCS處的處的Xba I和和Sal I識別位識別位點之間插入了點之間插入了EcoR V識別位點，用識別位點，用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的的3端添加端添加“T”而成。因大部分耐而成。因大部分耐熱性熱性DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)

3、行PCR反應(yīng)時都有反應(yīng)時都有PCR 產(chǎn)物的產(chǎn)物的3末端添加一個末端添加一個“A”的的特性，所以使用本制品可以大大提高特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。產(chǎn)物的連接、克隆效率。復(fù)制起點復(fù)制起點篩選標(biāo)記基因篩選標(biāo)記基因多克隆位點多克隆位點 高堿高堿細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物釋放染色體染色體DNADNA斷裂成不同長度的線性雙鏈斷裂成不同長度的線性雙鏈DNADNA；線性雙鏈線性雙鏈DNADNA片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。片段中的氫鍵斷裂，雙鏈解離變性。質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；不發(fā)生斷裂，保持雙鏈閉合環(huán)狀；雙鏈雙鏈DNADN

4、A并不完全分離。并不完全分離。高酸高酸中和中和至中至中性性變性的染色體變性的染色體DNADNA與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚與變性的蛋白質(zhì)以及細(xì)胞碎片凝聚成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物成網(wǎng)絡(luò)狀大分子不溶性沉淀物質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中又恢復(fù)天然構(gòu)型，溶解在上清液中純化純化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì)，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質(zhì) 三、儀器、材料與試劑三、儀器、材料與試劑 (一)儀器 1恒溫培養(yǎng)箱 2恒溫?fù)u床 3臺式離心機(jī) 4高壓滅菌鍋 (二二)材料材料 1含連接外源基因質(zhì)含連接外源基因質(zhì) 粒的粒的E. coli 21.5mL

5、Eppendorf管管 3吸頭、微量移液器吸頭、微量移液器 Solution I 50mmolL 葡萄糖葡萄糖 25mmolL TrisHCl(pH8.0) 10 mmolL EDTA (三三)主要試劑主要試劑溶液溶液：由葡萄糖、：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成組成 (保護(hù)、緩沖保護(hù)、緩沖)葡萄糖葡萄糖的作用是增加溶液的粘度的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的減少抽提過程中的 機(jī)械剪切作機(jī)械剪切作用用,防止破壞質(zhì)粒防止破壞質(zhì)粒 (保護(hù)作用保護(hù)作用)EDTA 的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子的作用是絡(luò)合掉鎂等二價金屬離子, 防止防止DNA酶對質(zhì)粒分酶對質(zhì)粒分子的降解作用（保護(hù)作用）子

6、的降解作用（保護(hù)作用）Tris-HCl 使溶菌液維持溶菌作用的最適使溶菌液維持溶菌作用的最適PH范圍（緩沖作用）范圍（緩沖作用）Solution II 0.4mol/LNaOH，2SDS, 用前等體積混合用前等體積混合 溶液溶液II：由：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與（十二烷基硫酸鈉）與 NaOH 組成組成(裂解、裂解、變性變性)SDS的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性的作用是解聚核蛋白并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）（裂解細(xì)胞和蛋白質(zhì)變性作用）NaOH（PH12）的作用是破壞氫鍵，使）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性分子變性（DNA變性作用）變性作用）Solu

7、tion III 5molL 乙酸鉀乙酸鉀 60 mL 冰乙酸冰乙酸 115mL 水水 285mL TE緩沖液緩沖液 10mmo1L TrisHCl 1mmo1L EDTA(pH8.0) 胰胰RNA酶溶液酶溶液 將將RNA酶溶于酶溶于10mmo1/L TrisHCl(pH75)和和15mmo1/L NaCl中，配成中，配成10mg/mL的濃度，于的濃度，于100加熱加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于，緩慢冷卻至室溫，保存于-20。 一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康?通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測通過本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。的方法和技術(shù)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有分子

8、在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)和和分子分子篩效應(yīng)篩效應(yīng),DNA分子在高于等電點的分子在高于等電點的pH 溶液中帶負(fù)電溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的具有不

9、同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離也可以分離相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的相同，但構(gòu)型不同的DNA分子分子。如上次實驗提取的質(zhì)粒如上次實驗提取的質(zhì)粒DNA，有，有3種構(gòu)型種構(gòu)型,這這3種構(gòu)型的質(zhì)粒種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。分子在凝膠電泳中的遷移率不同。溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向

10、正極泳動時，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動，這樣溴化乙錠分子就會嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測DNA的濃度。因此電泳后呈因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其泳動最快，其次為線狀次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。 三、儀器、材料與試劑三、儀器、材料與試劑 (一一)儀器儀器 1微波爐微波爐 2瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 3移液器移液器 4凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng) (二二)試劑試劑 1（1）5TBE (50倍體積的倍體積的TBE貯存液）配貯存液）

11、配1000 mL 5TBE Tris 54 g 硼酸硼酸 27.5 g 0.5molL EDTA 20 mL pH 8.0 或（或（2） 50TAE(50倍體積的倍體積的TAE貯存液）貯存液） Tris 242 g 乙酸乙酸 57 mL 0.5molL EDTA 100 mL pH 8.0 2凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液(6x) 3瓊脂糖瓊脂糖 4溴化乙錠溶液溴化乙錠溶液(EB) 0.5ugmL (一)、稱取0.5g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入50 mL 0.5xTAE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，溫度降至60 左右時加入少許EB溶液，搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。 (二)膠板的制備 1將有

12、機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。 2將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，加入EB后，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面(不要形成氣泡)。注意：溴化乙錠為致癌物，須戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染環(huán)境。 3待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。 4加入電泳緩沖液至電泳槽中。 五、實驗結(jié)果五、實驗結(jié)果 在紫外燈在紫外燈(360nm或或254nm)下觀察染色后的電泳下觀察染色后的電泳凝膠。凝膠。DNA存在處應(yīng)顯出桔存在處應(yīng)顯出桔紅色熒光條帶紅色熒光條帶(在紫外燈下觀在紫外燈下觀察時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，紫外察時應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡，紫外線對眼睛有傷害作用線對眼睛有傷害作用)。 M 1 五五.問題與討論：問題與討論：1.1.簡要敘述溶液簡要敘述溶液、溶液、溶液和溶液和溶液的作用，以及的作用，以及實驗中分別加入上述溶液后，反應(yīng)體系出現(xiàn)的現(xiàn)實驗中分別加入上述溶液