實(shí)驗(yàn)室常用試劑配制

1、實(shí)驗(yàn)室常用試劑、緩沖液的配制方法蛋白質(zhì)電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法核酸電泳相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法核酸、蛋白質(zhì)雜交用相關(guān)試劑、緩沖液的配制方法SDS-PAGE分離膠配方表PAGE凝膠配方表（核酸電泳用）各種緩沖液的性質(zhì)對(duì)照表離心機(jī)轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速與相對(duì)離心力RCF(g)間的換算關(guān)系相對(duì)離心力RCF值（g值）取決于轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速（rpm）和旋轉(zhuǎn)半徑（r，以mm計(jì)算)，可用如下公式表示：此外，根據(jù)RCF值（g值)、rpm值、r值之間的關(guān)系，可從圖A、圖B中大致讀出各種數(shù)值。圖A 高速轉(zhuǎn)子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。如：轉(zhuǎn)子速度為

2、80,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為20 mm時(shí)，相對(duì)離心力RCF值約為150,000 g。圖B 低速轉(zhuǎn)子的相對(duì)離心力列線圖要確定某一列上的未知值時(shí)，用尺子排列其他兩列的已知值，所需值落在尺子與第三列的交切處。如：轉(zhuǎn)子速度為5,000 rpm，旋轉(zhuǎn)半徑為40 mm時(shí)，相對(duì)離心力RCF值約為1,100 g。密碼子表色素在聚丙烯酰胺凝膠中的移動(dòng)速度*大腸桿菌的基因型野生的大腸桿菌（E.coli）的基因組DNA中有470萬個(gè)堿基對(duì)（bp)，內(nèi)含4288個(gè)基因。E.coli基因組中還包含有許多插入序列，如-噬菌體片段和一些其他特殊組份的片段，這些插入的片段都是由基因的水平轉(zhuǎn)移和基因重組而形成的，由此表明了

3、基因組具有它的可塑造性。利用大腸桿菌基因組的這種特性對(duì)其進(jìn)行改造，使其中的某些基因發(fā)生突變或缺失，從而給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化，這種能觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型 (Phenotype)，把引起這種變化的基因構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型（Genotype)。具有不同基因型的菌株表現(xiàn)出不同的特性。這些不同基因型特性的菌株在基因工程的研究和生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。大腸桿菌基因型的表示方法有如下幾種：1根據(jù)基因產(chǎn)物或其作用產(chǎn)物的英文名稱的第一個(gè)字母縮寫成三個(gè)斜體字母來表示。例如：DNA Adenine Methylasedam。2變異基因不同，導(dǎo)致的結(jié)果相同時(shí)，用其作用結(jié)果的英文名稱的前三個(gè)

4、字母斜體后加上一個(gè)大寫字母來表示區(qū)別。例如：RecombinationrecA、recB、recC。3某個(gè)基因或某個(gè)領(lǐng)域缺失時(shí)，在其基因型前面加上“D”表示。例如：lac-proAB基因缺失時(shí)它的基因型表示為D(lac-proAB)。4野生的大腸桿菌具有F因子（質(zhì)粒）和噬菌體插入片段，當(dāng)這些質(zhì)?；蚴删w片段變異或缺失時(shí)，用“( )”或“/”等以區(qū)別。例如：/F' traD36、proAB、lac I q、lacZDM15。5由于某種基因的變異導(dǎo)致大腸桿菌可以明顯觀察到特征變化，有時(shí)也用其表現(xiàn)型代替基因型進(jìn)行表示。例如：某些抗藥性的獲得或喪失，用如下方式表示：Streptomycin抗性

5、Str +或Str r，Ampicillin敏感性Amp-。(第一個(gè)字母要大寫,“+”或“r”表示有抗性,“-”表示無抗性或敏感)。6根據(jù)某些特異性蛋白的變異及其導(dǎo)致的結(jié)果變化進(jìn)行表示。例如：TH2菌株上有一種基因型表示如下：hsdS20 (rB-、mB-)，其中S20代表特異性識(shí)別蛋白發(fā)生變異，()中的 rB-、mB-表示由于S20的變異而導(dǎo)致B株來源的hsdR和hsdM的功能缺失。使用時(shí)注意：基因工程中，經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近也經(jīng)常使用由B株及C株來源的大腸桿菌。大腸桿菌B株原來就為lon-，另外MV1184株不具有琥珀抑制基因 (Amber supperssor

6、 free)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。主要的基因型說明基因重組相關(guān)的基因型recA (Recombination)Map position: 58 min功能：recA基因表達(dá)ATP依賴型DNA重組酶，它在-噬菌體與基因組DNA的溶原重組時(shí)起作用，同時(shí)具有對(duì)DNA放射性損傷的修復(fù)功能。由recA基因的變異所產(chǎn)生的基因型使同源或異源DNA的重組不能進(jìn)行，保持插入DNA的穩(wěn)定性，對(duì)DNA的轉(zhuǎn)化有利。recB (Recombination)Map position: 61 min功能：recB基因表達(dá)ATP依賴型DNase和核酸外切酶V的一個(gè)亞基，對(duì)re

7、cA的DNA重組酶起輔助和促進(jìn)作用。DNase催化雙鏈DNA的解旋和解鏈，核酸外切酶V催化單鏈DNA的裂解，在DNA的重組和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。recB基因的變異導(dǎo)致其DNA重組和修復(fù)功能喪失，保證了外源DNA的穩(wěn)定，有利于DNA轉(zhuǎn)化。recC (Recombination)Map position: 61 min功能：recC基因表達(dá)四種酶，即核酸外切酶V，ATP依賴型的核酸內(nèi)切酶，解旋酶及ATP酶，它們和recA, recB所表達(dá)的酶相互協(xié)調(diào)作用，在DNA的重組及放射性損傷的修復(fù)中發(fā)揮作用。recC基因的變異導(dǎo)致DNA重組功能缺失，保證外源DNA的穩(wěn)定性。甲基化相關(guān)的基因型dam (D

8、NA adenine methylase)Map position: 74 min功能：dam基因表達(dá)DNA腺嘌呤甲基化酶，它能催化特異序列GATC中A的甲基化，保證DNA免受限制性核酸內(nèi)切酶Mbo I的切斷，同時(shí)在DNA復(fù)制時(shí)也起一定的輔助作用。dam基因的變異導(dǎo)致腺嘌呤（A）甲基化酶活性的缺失，使腺嘌呤 (A) 不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。dcm (DNA cytosine methylase)Map position: 43 min功能：dcm基因表達(dá)胞嘧啶甲基化酶，它能特異性識(shí)別DNA雙鏈上的CCWGG序列，并使第二個(gè)C甲基化，即CmCWGG，避免DNA受到相關(guān)限制酶的切斷。dc

9、m基因的變異導(dǎo)致胞嘧啶甲基化酶活性缺失，使外源DNA上的C不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。mcrA (Modified cytosine restriction protein a)Map position: 26 min功能：mcrA基因表達(dá)大腸桿菌防御體系中起重要作用的mcrA酶，這種酶能特異性地作用于外來DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特異序列，使之分解，對(duì)大腸桿菌本身起保護(hù)作用。mcrA基因的變異，導(dǎo)致上述功能缺失，對(duì)外來DNA中被甲基化的胞嘧啶特異序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆體的穩(wěn)定。mcrB, C (Methyl cytosine-sp

10、ecific restriction)Map position: 98 min功能：mcrB, C基因表達(dá)兩種特異性蛋白，即mcrB蛋白和mcrC蛋白，它們?cè)诖竽c桿菌的防御系統(tǒng)中起重要作用。一般情況下，只有這兩種蛋白同時(shí)存在時(shí)才表現(xiàn)出活性，mcrC具有識(shí)別和調(diào)節(jié)功能，它能特異性的結(jié)合到外源DNA上被甲基化的胞嘧啶（C）的特異序列G5mC上，然后由mcrB蛋白切斷（mcrB蛋白是特異性切斷外來DNA中G5mC序列的限制性核酸內(nèi)切酶)，防御外來DNA的侵入。mcrB, C基因的變異，使上述的對(duì)外來DNA的防御作用缺失，對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化有利。mrr (Methylation requiring rest

11、riction)Map position: 98 min功能：mrr基因是大腸桿菌細(xì)胞防御系統(tǒng)中重要的基因之一，它能嚴(yán)格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，它對(duì)限制酶Acc I，CviR I，Hinf I (Hha II)，Nla II，Pst I以及N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明顯的抑制作用。mrr欠損株（基因型）可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的轉(zhuǎn)化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆體。hsdM (Host specificitive defective)Map position: 99 min功能：hsdM基因所表達(dá)的DNA甲基化酶是I

12、型限制酶復(fù)合體（具有對(duì)DNA切斷和修補(bǔ)的雙重功能）的一部分，它能使DNA雙鏈上的AA (雙腺嘌呤) 甲基化，保護(hù)宿主DNA不被分解。hsdM的變異使細(xì)胞內(nèi)的DNA不被甲基化，易于獲得非甲基化質(zhì)粒。點(diǎn)突變相關(guān)的基因型mutS (Mutator)Map position: 59 min功能：mutS基因表達(dá)的蛋白具有識(shí)別DNA上錯(cuò)配序列的功能，并能修復(fù)其錯(cuò)配序列（GCAT)，防止基因突變。mutS基因的變異導(dǎo)致DNA的錯(cuò)配序列不能得到修復(fù)，容易發(fā)生基因突變，這對(duì)于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造是有利的。mutT（Mutator）Map position: 3 min功能：野生大腸桿菌在進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，細(xì)

13、胞中的8-OXO-dGTP插入模板DNA中的DA位點(diǎn)的效率幾乎與插入DC位點(diǎn)的效率相同，導(dǎo)致A-T轉(zhuǎn)換成G-C，使DNA產(chǎn)生變異。而mutT蛋白就是特異性地降解8-OXO-dGTP成為單磷酸鹽（8-OXO-dGMP)，這種單磷酸鹽狀態(tài)的G (鳥嘌呤) 不能作為底物進(jìn)行DNA合成，從而防止了上述的基因突變。mutT基因的變異使細(xì)胞中8-OXO-dGTP濃度增高，AC的突變幾率增大，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造。dut (dUTPase)Map position: 82 min功能：dut基因表達(dá)脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶（dUTPase)，它能水解dUTP成為dUMP，使細(xì)胞體內(nèi)dUTP的濃度

14、維持在較低的水平，尿嘧啶（U）就不易摻入到DNA中，避免了基因發(fā)生AU的突變。dut基因發(fā)生突變使dUTPase活性缺失，導(dǎo)致dUTP濃度升高，堿基U（尿嘧啶）極易摻入到DNA中，使其發(fā)生AU的基因突變，有利于利用點(diǎn)突變進(jìn)行基因改造。ung (Uracil DNA glycosylase)Map position: 56 min功能：ung基因表達(dá)尿嘧啶-N-糖苷酶，這種酶能特異性識(shí)別DNA單鏈或雙鏈上發(fā)生突變的尿嘧啶殘基，并從DNA上水解去除尿嘧啶殘基，防止DNA發(fā)生突變。ung基因的變異導(dǎo)致上述功能缺失，有利于點(diǎn)突變。uvrB (Ultraviolet)Map position: 18 m

15、in功能：uvrB基因表達(dá)核酸外切酶中的b亞基，這種核酸外切酶具有DNA的切補(bǔ)功能，對(duì)紫外線損傷的DNA有修補(bǔ)作用。uvrB基因的變異使細(xì)胞中核酸外切酶切除變異堿基的活性缺失，有利于點(diǎn)突變。核酸內(nèi)切酶相關(guān)的基因型hsdR (Host specificity defective)Map position: 99 min功能：hsdR基因表達(dá)I型限制酶EcoK (K12株) 或EcoB (B株)，在大腸桿菌細(xì)胞中起到一種“抗體”的作用，對(duì)外來的各種 DNA有嚴(yán)格的限制。HsdR基因的變異導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)的I型限制酶EcoK或EcoB活性缺失，這對(duì)于外來基因的導(dǎo)入及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化是有利的。hsdS (Hos

16、t specificitive defective)Map position: 99 min功能：hsdS所表達(dá)的特異性蛋白是I型限制酶EcoK或EcoB復(fù)合體中的一部分，它專門負(fù)責(zé)hsdR酶和hsdM酶對(duì)DNA序列的特異識(shí)別。hsdS基因的變異使hsdR和hsdM不能正確識(shí)別其作用的特異DNA序列，可以保持插入DNA的穩(wěn)定性。endA (Endonuclease)Map position: 64 min功能：endA基因表達(dá)非特異性核酸內(nèi)切酶I，它能使所有DNA雙鏈解開，在DNA的復(fù)制和重組中起重要作用。endA基因的變異將使插入的外源DNA更加穩(wěn)定，提取的質(zhì)粒純度更高。停止密碼子相關(guān)的基因

17、型supE (Suppressor)Map position: 16 min功能：supE基因表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supE基因發(fā)生變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，即使遇到停止密碼子UAG，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG作為一個(gè)密碼子來編碼谷氨酰胺（Glutamine)，從而使發(fā)生了琥珀突變（AAGUAG）的基因?qū)Φ鞍踪|(zhì)表達(dá)得以延續(xù)，因此稱supE為琥珀突變抑制因子。supF (Suppressor)Map position: 27 min功能：supF基因表達(dá)的阻遏蛋白與停止密碼子UAG結(jié)合，使蛋白質(zhì)合成停止。supF基因變異時(shí)，不能表達(dá)正常的阻遏蛋白，即使

18、遇到停止密碼子UAG，蛋白質(zhì)合成仍能繼續(xù)，并使UAG作為一個(gè)密碼子編碼酪氨酸 (Tyrosine)，彌補(bǔ)了由于琥珀突變 (AAGUAG) 帶來的蛋白合成停止，因此也稱supF為琥珀突變抑制因子。抗藥性相關(guān)的基因型gyrA（Gyrase）Map position：48 min功能：gyrA基因表達(dá)DNA促旋酶A亞基。DNA促旋酶在DNA復(fù)制時(shí)具有使DNA解旋和回旋的作用。萘啶酮酸 (Nalidixic acid)、4-喹啉（4-Quinoline）等抗生素抑制DNA促旋酶的活性是通過與促旋酶復(fù)合體 (A2B2）中的A亞基的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。gyrA基因的變異使DNA促旋酶A亞基不能正常表達(dá)，萘啶酮酸和

19、熒光喹啉等失去結(jié)合目標(biāo)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)萘啶酮酸（Nalr) 和熒光喹啉的抗性。rpsL（Ribosomal protein small subunit）Map position：73 min功能：細(xì)胞中的核糖體是蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所，大腸桿菌細(xì)胞中的核糖體包含兩個(gè)亞基，即50S亞基（23SrRNA、5SrRNA、34種蛋白質(zhì)）和30S亞基 16SrRNA、21種蛋白質(zhì)（S1S21)。rpsL基因就是表達(dá)核糖體30S亞基中的S12蛋白質(zhì)，S12蛋白作用于翻譯的開始階段。鏈霉素（Streptomycin）等抗生素的作用位點(diǎn)就是核糖體30S亞基上的S12蛋白質(zhì)，正常情況下鏈霉素與S12

20、蛋白結(jié)合使蛋白質(zhì)的生物合成不能進(jìn)行，細(xì)胞停止生長(zhǎng)。rpsL基因的變異使鏈霉素失去結(jié)合位點(diǎn)，從而使該基因型的菌株具有了對(duì)鏈霉素的抗性（Str r)。Tn5（Transposon）Map position：轉(zhuǎn)座子功能：在原核生物和真核生物基因組中都存在有可移動(dòng)的DNA序列，一般稱這段序列為轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)位基因，轉(zhuǎn)座子上通常帶有抗藥性基因。Tn5是載有卡那霉素（Kanamycine）抗性基因的轉(zhuǎn)座子，當(dāng)Tn5轉(zhuǎn)位到大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得卡那霉素的抗性（Kmr)。Tn10（Transposon）Map position：轉(zhuǎn)座子功能：Tn10是載有四環(huán)素（tetracycline）抗性基因的轉(zhuǎn)座子

21、。當(dāng)Tn10轉(zhuǎn)位至大腸桿菌基因組時(shí)，能使此菌株獲得四環(huán)素的抗性 (Tet r)。能量代謝相關(guān)的基因型lacZ（Lactose）Map position：8 min功能：lacZ基因是大腸桿菌中l(wèi)ac操縱子的結(jié)構(gòu)基因，表達(dá)-半乳糖苷酶，分解乳糖為半乳糖苷。-半乳糖苷酶是由四個(gè)相同的亞基組成的，每個(gè)亞基又包含兩個(gè)片斷，即片斷和片斷，只有這兩種片斷同時(shí)存在時(shí)，-半乳糖苷酶才表現(xiàn)出活性。lacZ基因的變異或缺失將直接導(dǎo)致-半乳糖苷酶活性缺失，細(xì)胞在只有乳糖作為碳源的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，由此可以進(jìn)行菌株的篩選和純化。lacZDM15（Lactose）Map position：8 min功能：lacZM15

22、是表達(dá)-半乳糖苷酶片斷的一段基因，當(dāng)M15缺失（M15）時(shí)，lacZ基因雖然能表達(dá)片斷，但不能表達(dá)片斷，-半乳糖苷酶沒有活性。當(dāng)帶有l(wèi)acZ（片斷）基因的lac操縱子通過載體DNA（如pUC19 DNA）轉(zhuǎn)化到lacZM15基因型的細(xì)胞 (如E.coli JM109）時(shí)，在有IPTG (異丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 存在的情況下, -半乳糖苷酶表現(xiàn)出活性,它能分解X-gal (半乳糖類似物)，使其呈現(xiàn)藍(lán)色。因此可以通過平板上的藍(lán)白菌落進(jìn)行克隆體的鑒定。lacI q（Lactose）Map position：8 min功能：lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac 操縱子（Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)

23、的阻遏蛋白是lac 操縱基因（Operator）的抑制因子，這種阻遏蛋白能與過量的乳糖結(jié)合而失去對(duì)操縱基因的抑制，使lac 操縱子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ（-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達(dá)。IPTG（異丙基-D-1-硫代半乳糖苷) 作為乳糖的類似物與lacI阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此IPTG經(jīng)常作為lac 操縱子的誘導(dǎo)劑而使用?；蛐蚻acIq是lacI基因發(fā)生變異而使其大量（quantity）的表達(dá)阻遏蛋白，從而使lac 操縱基因幾乎完全被抑制。利用這種基因型的菌株進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，可以使目的基因的表達(dá)得到更有效的人為控制。ara（Arabino

24、se）Map position：1 min功能：ara基因表達(dá)阿拉伯糖代謝所需的各種酶，包括：araA表達(dá)阿拉伯糖異構(gòu)酶、araB表達(dá)核酮糖激酶、araC表達(dá)阻遏蛋白（起調(diào)節(jié)作用)，araD表達(dá)L-核酮糖-4-磷酸差向異構(gòu)酶、araE表達(dá)低親和型L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、araF表達(dá)L-阿拉伯糖結(jié)合蛋白、araG表達(dá)高親和性的L-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ara基因的變異，使細(xì)胞不能利用阿拉伯糖進(jìn)行能量代謝，可以利用此特性進(jìn)行菌株篩選。mtl（Mannitol）Map position：81 min功能：mtl基因包括mtlA、mtlC、mtlD三種基因。mtlA表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)移酶、mtlC表達(dá)阻遏蛋白（起調(diào)

25、節(jié)作用)、mtlD表達(dá)甘露醇-1-磷酸脫氫酶。mtl基因的變異使甘露醇代謝不能進(jìn)行，細(xì)胞在以甘露醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。xyl（Xylose）Map position：80 min功能：xyl基因包含xylA、xylB、xylR三種基因。xylA表達(dá)D-木糖異構(gòu)酶、xylB表達(dá)木酮糖激酶、xylR作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)阻遏蛋白。xyl基因的變異使細(xì)胞不能以木糖作為碳源進(jìn)行能量代謝。gal（Galactose）Map position：17 164min功能：gal基因表達(dá)半乳糖代謝所需的各種酶類及調(diào)節(jié)蛋白，包括：galE（17 min）表達(dá)尿苷二磷酸（UDG）半乳糖-4-差向異構(gòu)酶、gal

26、K（17 min）表達(dá)半乳糖激酶、galP（64 min）表達(dá)半乳糖透性酶、galR（62 min）表達(dá)半乳糖操縱子的阻遏蛋白、galT（17 min）表達(dá)半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、galU（27 min）表達(dá)葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶。大腸桿菌K12株中通常出現(xiàn)的基因型是galK和galT，由于這兩種基因的變異使細(xì)胞不能直接利用半乳糖作為碳源。因此通過在最小培養(yǎng)基中添加半乳糖與否，進(jìn)行菌株篩選和基因型確認(rèn)。srl（Sorbitol）Map position：58 min功能：srl基因包含srlA、srlC、srlD、srlR等基因。srlA表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)相關(guān)的酶（葡萄糖醇-山梨醇透

27、性酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶II等)、srlD表達(dá)山梨醇-6-磷酸-2-脫氫酶、srlC、R都是調(diào)控基因，表達(dá)葡萄糖醇操縱子的阻遏蛋白。Srl基因的變異使細(xì)胞對(duì)山梨醇的吸收和利用受到阻害，在以山梨醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中，此基因型的菌株不能生長(zhǎng)。氨基酸代謝相關(guān)的基因型gpt (Guanine-hypoxanthine phosphoribosyl transferase)Map position: 6 min功能：gpt基因表達(dá)鳥嘌呤-次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，參與鳥嘌呤代謝。gpt基因的變異使鳥嘌呤不能生物合成，對(duì)菌株篩選有利。thyA (Thymine)Map position: 61 min功能：th

28、yA基因表達(dá)胸苷酸合成酶，參與胸腺嘧啶的代謝。thyA基因的變異可以利用胸腺嘧啶進(jìn)行菌株篩選。asd (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase)Map position: 76 min功能：asd基因表達(dá)天門冬氨酸半醛脫氫酶，催化如下反應(yīng)：L天門冬氨酸-4-半醛 + 磷酸鹽 + NADP+ = L-4-磷酸天門冬氨酸 +NADPH，此反應(yīng)是氨基酸共同合成路徑的第二步。asd基因的變異使天門冬氨酸合成受阻，用最小培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需特別添加天門冬氨酸。leuB (Leucine)Map position: 2 min功能：leuB基因表達(dá)3()-異丙基蘋果酸

29、脫氫酶，作用于亮氨酸生物合成的第二步，催化反應(yīng)如下：3-羧基-2-羥基-4-甲基戊烯 + NAD+3-羧基-4-甲基-2-氧戊烯 + NADH。leuB基因的變異導(dǎo)致亮氨酸生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，需特別添加亮氨酸。proA (Proline)Map position: 6 min功能：proA基因表達(dá)-谷氨酸磷酸還原酶，作用于脯氨酸生物合成的第二步，反應(yīng)如下：L-谷氨酸-5-半醛 + 磷酸 + NADP+L-谷氨酸-5-磷酸鹽 + NADPH 。proA基因的變異或缺失，使脯氨酸的生物合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)需要特別添加脯氨酸。proB (Proline)Map

30、position: 6 min功能：proB基因表達(dá)谷氨酸鹽-5-磷酸激酶，它能催化三磷酸鹽與谷氨酸鹽結(jié)合形成谷氨酸-5-磷酸鹽，是脯氨酸合成的第一步，反應(yīng)如下：ATP +L-谷氨酸鹽ADP + L-谷氨酸-5-磷酸。proB基因的變異或缺失，使脯氨酸合成受阻，在用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需特別添加脯氨酸。trpR（Tryptophan）Map position：100 min功能：trpR基因表達(dá)“trp操縱子”的阻遏蛋白，但這種阻遏蛋白不能單獨(dú)與操縱子上的操縱基因結(jié)合，只有在L-色氨酸存在的情況下，首先與L-色氨酸結(jié)合成復(fù)合體，然后這個(gè)復(fù)合體才能與操縱基因相結(jié)合，對(duì)trp操縱子起抑制作用。吲哚丙酸

31、鹽（IPA）作為L(zhǎng)-色氨酸的類似物也能與這種阻遏蛋白結(jié)合，但其形成的復(fù)合體沒有活性，不能與操縱基因結(jié)合，因此可以把吲哚丙酸鹽（IPA）作為trp操縱子表達(dá)的誘導(dǎo)劑。trpR基因的變異，使trp操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，有利于trp操縱子的蛋白表達(dá)。lys (Lysine)Map position: 17 191 min功能：lys基因分布于大腸桿菌基因組圖的17 191 min的5個(gè)位置上,包括lysA (61 min)、lysC (91 min)、lysP (46 min)、lysT (17 min)、lysX (60 min)，它們的功能如下：lysA表達(dá)二氨基庚二酸脫羧酶、lysC表達(dá)天

32、冬氨酸激酶、lysP是調(diào)節(jié)賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的基因、轉(zhuǎn)錄賴氨酸t(yī)RNA、lysX負(fù)責(zé)賴氨酸排泄。lys基因的變異使賴氨酸的生物合成不能進(jìn)行，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需額外添加賴氨酸。metB（Methionine）Map position：90 min功能：metB基因表達(dá)胱硫醚-合成酶，催化反應(yīng)如下：0-琥珀酰-L-高絲氨酸 + L-半胱氨酸胱硫醚 + 琥珀酸鹽，是甲硫氨酸生物合成的第二步。metB基因的變異使甲硫氨酸的生物合成受阻，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需特別添加甲硫氨酸。cysB (Cysteine)Map position: 28 min功能：cysB基因表達(dá)一種阻遏蛋白，對(duì)半胱氨酸生物合成所需的各種酶

33、的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。cysB基因的變異有利于半胱氨酸的生物合成。thr（Thronine）Map position：0 min功能：thr包含三種基因，即thrA、thrB和thrC。thrA表達(dá)天冬氨酸激酶及I-高絲氨酸脫氫酶，thrB表達(dá)高絲氨酸激酶，thrC表述蘇氨酸合成酶。thr基因的變異使細(xì)胞不能合成蘇氨酸，用最小培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)需添加蘇氨酸。維生素代謝相關(guān)的基因型bioH（Biotin）Map position：18 min功能：bioH基因所表達(dá)的蛋白有兩種功能：催化前生物素到生物素的轉(zhuǎn)化；對(duì)庚二酰CoA（輔酶A）有優(yōu)先的阻害作用。bioH基因的變異使細(xì)胞不能自身合成生物素，在最小培養(yǎng)

34、基中必須添加生物素，細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)。thi（Thiamin）Map position：90 min功能：thi基因包含有thiA、thiB、thiC、thiD、thiK、thiL等。thiA表達(dá)硫氨素噻唑轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thiB表達(dá)硫氨素磷酸鹽焦磷酸化酶、thiC表達(dá)硫氨素嘧啶轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、thiD表達(dá)磷酸甲基化嘧啶激酶、thiK表達(dá)硫氨素激酶、thiL表達(dá)硫氨素甲磷酸激酶。thi的變異使硫氨素的生物合成不能進(jìn)行，最小培養(yǎng)基中必須添加硫氨素（VB1)，細(xì)胞才能正常生長(zhǎng)。蛋白酶相關(guān)的基因型lon（long form）Map position：10 min功能：lon基因表達(dá)ATP依賴型蛋白分解酶（La)

35、，它對(duì)外源的異型蛋白質(zhì)具有特異性的分解作用。lon基因的變異或缺失，使細(xì)胞中的這種異型蛋白質(zhì)分解酶不能得到表達(dá)，這對(duì)于保持克隆體目的蛋白的穩(wěn)定是非常有利的。ompT（Outer membrane protein）Map position：13 min功能：ompT基因表達(dá)特異性的外膜蛋白分解酶，它特異性地分解與細(xì)胞膜結(jié)合的含鐵腸菌素受體蛋白。ompT基因的變異使膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失，有利于融合蛋白的表達(dá)。物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合相關(guān)的基因型tonA（Transport）=fhuA（Ferric hydroxamateuptake）Map position：3.6 min功能：tonA和fhuA基因

36、處于基因組圖同一位點(diǎn)，它們的作用也相同，都是表達(dá)外膜受體蛋白。這種受體蛋白與鐵絡(luò)合物結(jié)合，并與tonB蛋白相互協(xié)調(diào)作用，把鐵化合物運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。另外tonA、B受體蛋白還能與大腸桿菌素M、噬菌體T1、T5、80等進(jìn)行不可逆結(jié)合，而使細(xì)胞具有一定的抗菌作用。tonA和fhuA基因的變異使細(xì)胞對(duì)鐵離子的吸收受到阻害，同時(shí)使細(xì)胞對(duì)某些抗菌素及噬菌體更敏感，有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和菌體篩選。tsx（T-six）Map position：9 min功能：tsx基因表達(dá)T6噬菌體和大腸桿菌素K的受體蛋白，它結(jié)合于細(xì)胞膜的外表面，對(duì)T6噬菌體和大腸桿菌素K進(jìn)入細(xì)胞起關(guān)鍵作用。另外tsx受體蛋白還有與核苷酸特異性結(jié)合

37、的功能，是核苷酸特異性運(yùn)輸通道的第一步，在核苷酸的吸收方面也起重要作用。tsx基因的變異使外界某些噬菌體及大腸桿菌素等對(duì)細(xì)胞的侵噬變得困難，有利于細(xì)胞基因組的穩(wěn)定。cysA (Cysteine）Map position：52 min功能：cysA基因表達(dá)硫酸鹽/硫代硫酸鹽轉(zhuǎn)移蛋白，參與細(xì)胞對(duì)硫酸鹽的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，通過cysA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的硫酸鹽將參與半胱氨酸的生物合成。cysA基因的變異使半胱氨酸的生物合成受到影響，在培養(yǎng)此基因型的菌株時(shí)要注意添加半胱氨酸。其他deoR (Deoxyribose)Map position: 19 min功能：deoR是大腸桿菌中deo操縱子的調(diào)節(jié)基因，它表達(dá)的阻遏蛋

38、白對(duì)deo操縱子具有重要的調(diào)控作用。deo操縱子位于大腸桿菌基因圖譜100 min的位置，它含有deoA、deoB、deoC和deoD等結(jié)構(gòu)基因，分別表達(dá)DNA代謝所需的酶類，即胸腺嘧啶磷酸化酶、磷酸轉(zhuǎn)位酶、脫氧核糖磷酸醛縮酶和嘌呤核苷磷酸化酶。deoR基因的變異，使deo操縱子的阻遏蛋白不能表達(dá)，宿主細(xì)胞合成大量的dCTP，可以選擇性地改善大分子DNA的轉(zhuǎn)化。traD（Transmissibility）Map position：F因子功能：traD基因不屬于大腸桿菌基因組DNA范圍，它是存在于F因子上的一段基因。traD基因在大腸桿菌的結(jié)合及F因子的傳遞方面發(fā)揮作用。traD基因的變異使大腸

39、桿菌細(xì)胞雖然能夠結(jié)合，但F因子不能在細(xì)胞間發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而保證了宿主細(xì)胞和導(dǎo)入質(zhì)粒的穩(wěn)定性。hflC（High frequence of lysogenization）Map position：95 min功能：hflC基因表達(dá)一種高效溶原蛋白，它能使-噬菌體侵入大腸桿菌細(xì)胞后與基因組DNA發(fā)生溶原反應(yīng)，導(dǎo)致噬菌體DNA插入到細(xì)胞基因組DNA中。hflC基因的變異能避免上述的溶原反應(yīng)，可以保持宿主基因組及插入質(zhì)粒的穩(wěn)定。minA、B (Minicell)Map position: 10 min, 26 min功能：minA、B基因是促進(jìn)微細(xì)胞 (不含DNA) 形成的相關(guān)基因。minA、B 基因的

40、變異阻害了微細(xì)胞的形成，可以提高克隆體的表達(dá)效率。relA（Relaxed）Map position：63 min功能：relA是松弛調(diào)節(jié)基因，對(duì)RNA的合成具有調(diào)節(jié)抑制作用。同時(shí)relA基因還表達(dá)ATP：GTP3'-焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)在氨基酸饑餓狀態(tài)下鳥苷3'，5'-二磷酸 (ppGpp) 的合成，以適應(yīng)饑餓環(huán)境。 relA基因的變異對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄有利。glnV（Glutamine）Map position：16 min功能：glnV基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄谷氨酸t(yī)RNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)，glnV基因的變異使以谷氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受到阻害。tyrT（Tyrosine）Map position：27 min功能：tyrT基因?qū)ｉT負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄酪氨酸t(yī)RNA（轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)，tyrT基因的變異使以酪氨酸為主的蛋白質(zhì)的合成受阻。常用大腸桿菌 (K-12株來源) 的基因型紫字表示TaKaRa銷售的感受態(tài)細(xì)胞菌株* pMC9 is pBR322 with lac I q inserted.1) Maniatis, T., Fritsh, E. F. and Sambrook, J. (1989) "Molecular Cloning" A Labor