第4章酶的分離純化

1、第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化v酶的分離純化策略酶的分離純化策略v酶液的制備與初分離酶液的制備與初分離v酶的分離純化方法酶的分離純化方法v酶純度的檢驗酶純度的檢驗 酶的提取和分離純化酶的提取和分離純化是指把酶從組織中、是指把酶從組織中、細胞內或細胞外液中提取出來并使之達到細胞內或細胞外液中提取出來并使之達到與使用目的相適應的純度。與使用目的相適應的純度。酶的分離提純包括三個基本環(huán)節(jié)：酶的分離提純包括三個基本環(huán)節(jié)： 一是抽提，一是抽提，即把酶從材料轉入溶劑中制成即把酶從材料轉入溶劑中制成酶溶液；酶溶液； 二是純化二是純化，即把雜質從酶溶液中除掉或從，即把雜質從酶溶液中除掉或從酶溶液中

2、把酶分離出來；酶溶液中把酶分離出來； 三是制劑三是制劑，即將酶制成各種劑型。，即將酶制成各種劑型?？臻g結構的穩(wěn)定性空間結構的穩(wěn)定性 有活性的酶的空間穩(wěn)定性有限，不同的酶有活性的酶的空間穩(wěn)定性有限，不同的酶可能有不同的穩(wěn)定性可能有不同的穩(wěn)定性保持穩(wěn)定性的環(huán)境因素保持穩(wěn)定性的環(huán)境因素v離子強度適當離子強度適當v最適最適pHpHv低溫低溫v加入穩(wěn)定性：甘油、糖類、聚乙二醇等加入穩(wěn)定性：甘油、糖類、聚乙二醇等第一節(jié)第一節(jié) 酶的分離純化策略酶的分離純化策略一、酶分離純化基本原則一、酶分離純化基本原則v防止變性失活防止變性失活v低溫進行低溫進行v防止局部的過酸過堿防止局部的過酸過堿v避免劇烈攪拌和泡沫形成

3、避免劇烈攪拌和泡沫形成v重金屬離子能引起酶失活，有機溶劑會使酶失重金屬離子能引起酶失活，有機溶劑會使酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在會使酶分解活，微生物污染以及蛋白酶的存在會使酶分解破壞，破壞，v其他因素：水質、輔因子等其他因素：水質、輔因子等樣品性質對純化策略的影響溫度穩(wěn)定性迅速，且在低溫下操作pH值穩(wěn)定性 對提取及純化所用緩沖液的選擇，對離子交換、親和色譜或反相色譜條件的選擇溶解穩(wěn)定性對反相色譜條件的選擇離子強度對沉淀及疏水親和色譜的條件的選擇蛋白酶敏感性需去除蛋白酶或添加抑制劑金屬離子敏感性需在緩沖液中添加乙二胺四乙醇（EDTA）或乙二醇雙（2-氨基乙基）醚-N，N，N，N-四乙酸（E

4、GTA）氧化敏感性需添加還原劑分子量對凝膠過濾介質的選擇表表4-2 4-2 酶蛋白性質及其對純化策略的影響酶蛋白性質及其對純化策略的影響二、酶的分離純化策略二、酶的分離純化策略1 1、目的明確、目的明確用途：用途：醫(yī)療用途、活體研究等醫(yī)療用途、活體研究等 極高純度極高純度99%X X射線結晶、物理化學性質研究等射線結晶、物理化學性質研究等 高純度高純度95-99%95-99%N N端測序、生產抗原等端測序、生產抗原等 一般純度一般純度95%95%2 2、建立一個可靠、快速的分析方法、建立一個可靠、快速的分析方法 目標酶蛋白，蛋白質純度的檢測，總蛋目標酶蛋白，蛋白質純度的檢測，總蛋白量的檢測，對

5、必須清除的雜質的分析白量的檢測，對必須清除的雜質的分析 純化方法的選擇純化方法的選擇-解決純化倍數(shù)和回解決純化倍數(shù)和回收率的矛盾收率的矛盾建立以下分析通道：建立以下分析通道：v 快速、可靠的分析目標酶蛋白的方法（酶快速、可靠的分析目標酶蛋白的方法（酶活力測定方法）活力測定方法）v 蛋白質純度檢測方法蛋白質純度檢測方法v 總蛋白的檢測方法總蛋白的檢測方法 對必須清除的雜質分析方法對必須清除的雜質分析方法此外，還需盡量做到此外，還需盡量做到v 純化過程中不宜重復相同的步驟和條件純化過程中不宜重復相同的步驟和條件v 減少添加劑的使用減少添加劑的使用v 盡早去除有破壞型的雜質盡早去除有破壞型的雜質 盡

6、早采用高效分離方法，將最昂貴、最費盡早采用高效分離方法，將最昂貴、最費時的分離方法防在最后階段。時的分離方法防在最后階段。3、純化方法的選擇、純化方法的選擇評定好壞的標準：評定好壞的標準：v 比活力提高倍數(shù)比活力提高倍數(shù)v 總活力的回收率總活力的回收率 重現(xiàn)性重現(xiàn)性表表4-3 4-3 常用的提純方法常用的提純方法性 質方 法溶解度電荷等電點分于大小生物親和性等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀、萃取離子交換層析、電泳層析聚焦、等電聚焦離心分離、凝膠過濾、透析、超濾親和層析、免疫吸附層析、親和萃取v 比活力提高倍數(shù)是純化后樣品的酶比活力比活力提高倍數(shù)是純化后樣品的酶比活力與純化前比活力的比值，較大的倍

7、數(shù)表示與純化前比活力的比值，較大的倍數(shù)表示比活力明顯提高，說明操作的有效性。比活力明顯提高，說明操作的有效性。v 總活力的回收率是指純化后樣品的總活力總活力的回收率是指純化后樣品的總活力占前樣品總酶活的百分比。這一比值越高占前樣品總酶活的百分比。這一比值越高說明該操作步驟對酶活的保存率越高。說明該操作步驟對酶活的保存率越高。v 較好的重現(xiàn)性是所有方法可行性的必要條較好的重現(xiàn)性是所有方法可行性的必要條件。件。酶的分離純化一般程序可以分為酶的分離純化一般程序可以分為v 預處理：預處理：包括材料的選擇、發(fā)酵液的預處包括材料的選擇、發(fā)酵液的預處理和細胞的破碎等。理和細胞的破碎等。v 粗分級分離：粗分級

8、分離：等電點沉淀、鹽析、有機溶等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀、萃取和離心分離。劑沉淀、萃取和離心分離。v 細分級分離：細分級分離：通常用色譜分離通常用色譜分離 成品制作成品制作：透析、超濾、結晶和冷凍干燥：透析、超濾、結晶和冷凍干燥等。等。第二節(jié)第二節(jié) 酶液的制備和初分離酶液的制備和初分離一、材料的預處理一、材料的預處理v動物材料：動物材料： 除去與實驗無關甚至有妨礙的結締組除去與實驗無關甚至有妨礙的結締組 織，織，脂肪組織和血污等。脂肪組織和血污等。v 植物種子需要除殼植物種子需要除殼v 微生物材料需將菌體和發(fā)酵液成分分開微生物材料需將菌體和發(fā)酵液成分分開沉淀法沉淀法酶泥胞外酶胞外酶用鹽析或

9、有機溶劑沉淀用鹽析或有機溶劑沉淀v胞外酶胞外酶：釋放到細胞外的酶：釋放到細胞外的酶v胞內酶：胞內酶：游離在細胞內的酶和牢固與膜或游離在細胞內的酶和牢固與膜或細胞顆粒結合在一起的酶細胞顆粒結合在一起的酶細胞壁的主要組分：細胞壁的主要組分：細菌：細菌：肽聚糖、肽聚糖、N-N-乙酰葡糖胺、乙酰葡糖胺、 N-N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸真菌和酵母：真菌和酵母：葡聚糖、甘露聚糖葡聚糖、甘露聚糖藻類：藻類：纖絲狀糖類纖絲狀糖類動物細胞無細胞壁，易破碎。動物細胞無細胞壁，易破碎。細胞破碎的方法細胞破碎的方法v 機械法機械法v 物理法：滲透壓突變、超聲波、凍融、冷物理法：滲透壓突變、超聲波、凍融、冷凍干燥再抽提凍

10、干燥再抽提v 化學法：有機溶劑處理、表面活性劑處理化學法：有機溶劑處理、表面活性劑處理v 生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶等酶、纖維素酶、甘露聚糖酶等表表4-4 常見的破碎細胞方法常見的破碎細胞方法 分類原理舉例機械法珠磨法固體剪切作用植物組織和細菌高壓勻漿法液體剪切作用細胞懸浮液超聲波 液體剪切作用和空穴作用細胞懸浮液Xpress法固體剪切作用細胞懸浮液非機械法酶溶法 酶對細胞壁的分解作用溶菌酶處理細菌胞內酶？胞內酶？細胞破碎取酶細胞破碎取酶（1 1）機械破碎法）機械破碎法v液體剪切：攪拌、勻漿液體剪切：攪拌、勻漿v固體剪切：研

11、磨、珠磨、搗碎固體剪切：研磨、珠磨、搗碎14573682圖4-1 珠磨機的結構簡圖1細胞懸浮液；2微珠；3破碎室；4冷卻劑；5細胞勻漿器；6液珠分離器；7攪拌槳；8冷卻劑 12 3 4 5 6圖4-2 高壓勻漿器結構簡圖1細胞懸浮液；2閥座；3碰撞環(huán)；4閥； 5閥桿； 6 細胞勻漿液JY92-II D超聲波超聲波細胞粉碎機細胞粉碎機細胞破碎珠細胞破碎珠高壓細胞破碎機高壓細胞破碎機DY89-I型型 電動玻璃勻漿機電動玻璃勻漿機（2 2）化學滲透：）化學滲透：將細胞壁溶解作用和滲透壓將細胞壁溶解作用和滲透壓作用相結合，使細胞膜破裂而釋放出胞內作用相結合，使細胞膜破裂而釋放出胞內物質。物質。v有機溶

12、劑處理：溶解膜脂、干燥、抽提。有機溶劑處理：溶解膜脂、干燥、抽提。v表面活性劑處理：改變膜的通透性，使之表面活性劑處理：改變膜的通透性，使之溶解，再抽提蛋白。溶解，再抽提蛋白。SDSSDS、TritonTriton（3 3）酶溶解：）酶溶解：利用溶解細胞壁的酶處理菌體，利用溶解細胞壁的酶處理菌體，使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用使細胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊而破壞細胞膜。滲透壓沖擊而破壞細胞膜。（4 4）凍結）凍結- -溶凍法溶凍法 將細胞急劇凍結后在室溫緩慢融化，反復將細胞急劇凍結后在室溫緩慢融化，反復操作多次達到破壞細胞壁和細胞膜的作用，操作多次達到破壞細胞壁和細胞膜的

13、作用，適用于較脆弱的菌體。適用于較脆弱的菌體。三、抽提三、抽提 酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛎傅奶崛∈侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱為中的過程，也稱為酶的抽提酶的抽提。v酶提取時首先應根據(jù)酶的結構和溶解性質，選擇酶提取時首先應根據(jù)酶的結構和溶解性質，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質易溶于極性溶適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質易溶于極性溶劑中，非極性物質易溶于非極性的有機溶劑中，劑中，非極性物質易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶于堿性溶劑中，堿性物質易溶于酸酸性物質易溶于堿性溶劑

14、中，堿性物質易溶于酸性溶劑中。性溶劑中。v酶都能溶解于水，通常可用酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。抽提緩沖液可能組成成分抽提緩沖液可能組成成分vpHpH調節(jié)劑調節(jié)劑v離子強度調節(jié)劑：鹽類離子強度調節(jié)劑：鹽類v構象穩(wěn)定性：甘油構象穩(wěn)定性：甘油v抗氧劑：抗氧劑：DTTDTT、巰基乙醇等、巰基乙醇等v重金屬絡合劑：重金屬絡合劑：EDTAEDTA、檸檬酸、檸檬酸v蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑：PMSFPMSF、DFPDFP

15、等等v增溶劑：增溶劑：Triton X-100Triton X-100等等影響酶提取的主要因素影響酶提取的主要因素（1 1）pHpH（2 2）溫度）溫度（3 3）抽提液的用量）抽提液的用量離心離心離心轉數(shù)：每分鐘轉數(shù)（離心轉數(shù)：每分鐘轉數(shù)（rpmrpm）離心分離強度：離心分離強度：g g值值換算：換算：g=g=（rpmrpm2 2/60)/60)2 2/9.8/9.8r:r:粒子距離軸中心的距離粒子距離軸中心的距離低速：低速：4000rpm4000rpm高速：高速：4000-20000 rpm4000-20000 rpm超速超速: : 20000 rpm20000 rpm實驗室的離心機實驗室的

16、離心機v常溫和冷凍常溫和冷凍v超速離心機為冷凍超速離心機為冷凍v使用冷凍離心機需先降使用冷凍離心機需先降溫，預冷離心機頭溫，預冷離心機頭v使用超速離心機要抽真使用超速離心機要抽真空空離心的形式離心的形式 角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式從低速到超速。從低速到超速。 角式離心頭要配套，低溫使用預冷，操作角式離心頭要配套，低溫使用預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、膠圈、旋緊。注意穩(wěn)、蓋、膠圈、旋緊。離心機：落地式、臺式離心機：落地式、臺式小臺式離心機小臺式離心機超速離心機超速離心機離心機管離心機管 材質：材質：玻璃、玻璃、塑料塑料 強度強度和離心和離心機轉速配備機轉速配

17、備 大?。捍笮。汉娃D和轉子相配備子相配備 高速和超速高速和超速管要管要加蓋加蓋離心機操作離心機操作平衡、定溫、定速、定時、定剎車平衡、定溫、定速、定時、定剎車四、濃縮四、濃縮（1 1）蒸發(fā)）蒸發(fā) 工業(yè)上應用較多的是薄膜蒸發(fā)濃縮，即將工業(yè)上應用較多的是薄膜蒸發(fā)濃縮，即將待濃縮的酶在高真空度的條件下變成極薄待濃縮的酶在高真空度的條件下變成極薄的液膜，并使之與大面積熱空氣接觸，讓的液膜，并使之與大面積熱空氣接觸，讓其中的水分瞬時蒸發(fā)達到濃縮的目的。其中的水分瞬時蒸發(fā)達到濃縮的目的。（2 2）超濾）超濾 在加壓情況下，將待濃縮溶液通過一層只在加壓情況下，將待濃縮溶液通過一層只允許水分子和小分子選擇性透

18、過的微孔超允許水分子和小分子選擇性透過的微孔超濾膜，而將酶等大分子滯留，從而達到濃濾膜，而將酶等大分子滯留，從而達到濃縮的目的?？s的目的。（3 3）凝膠過濾：）凝膠過濾：利用葡聚糖凝膠利用葡聚糖凝膠G-25G-25或或G-50G-50等能吸水膨脹，而酶等大分子排阻于膠外等能吸水膨脹，而酶等大分子排阻于膠外的原理進行的一種濃縮。的原理進行的一種濃縮。（4 4）沉淀法）沉淀法 利用鹽析法或有機溶劑沉淀法將蛋白質進利用鹽析法或有機溶劑沉淀法將蛋白質進行沉淀，再將沉淀溶解在小體積的樣品溶行沉淀，再將沉淀溶解在小體積的樣品溶液中。液中。（5 5）滲透濃縮法）滲透濃縮法 將蛋白質溶液放入透析袋中，然后在封

19、閉將蛋白質溶液放入透析袋中，然后在封閉容器中緩慢減壓，水及無機鹽流向膜外。容器中緩慢減壓，水及無機鹽流向膜外。第三節(jié)第三節(jié) 酶的分離純化方法酶的分離純化方法（1 1）根據(jù)）根據(jù)溶解度大小溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機分離的方法、如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。沉淀法等。（2 2）根據(jù)）根據(jù)分子大小分子大小的差別。如離心分離法、篩膜分的差別。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。離法、凝膠過濾法等。（3 3）根據(jù)）根據(jù)電學、解離電學、解離性質差別，有吸附法、離子交性質差別，有吸附法、離子交換色譜法、電泳法以及聚焦

20、色譜法。換色譜法、電泳法以及聚焦色譜法。（4 4）基于）基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑酶和底物、輔助因子以及抑制劑具有專一具有專一的親和作用特性而建立的各種親和分離法。的親和作用特性而建立的各種親和分離法。（5 5）利用）利用穩(wěn)定性差異穩(wěn)定性差異而建立的選擇性熱變性、酸堿而建立的選擇性熱變性、酸堿變性和表面變性法等。變性和表面變性法等。一、根據(jù)溶解度不同而建立的純化方法一、根據(jù)溶解度不同而建立的純化方法酶的性質：水溶性酶的性質：水溶性 基于物理、化學規(guī)律，基于物理、化學規(guī)律，酶分子的疏水基團一般酶分子的疏水基團一般位于分子內部，帶電和位于分子內部，帶電和強極性基團位于分子表強極性基團位于分子

21、表面，形成極性表面。進面，形成極性表面。進而水分子被結合在極性而水分子被結合在極性表面形成水化層，使酶表面形成水化層，使酶分子具有一個很親水的分子具有一個很親水的表面而易溶于水。表面而易溶于水。調節(jié)酶溶解性的方法調節(jié)酶溶解性的方法1、鹽析法、鹽析法v在低濃度鹽溶液中，其溶解度隨鹽離子強在低濃度鹽溶液中，其溶解度隨鹽離子強度升高而加大，表現(xiàn)出度升高而加大，表現(xiàn)出鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。原因：。原因：鹽離子與蛋白質分子中的極性基團或離子鹽離子與蛋白質分子中的極性基團或離子基團作用，降低蛋白質分子的活度系數(shù)而基團作用，降低蛋白質分子的活度系數(shù)而使其溶解度增加。使其溶解度增加。v當鹽濃度繼續(xù)升高達到某一上限

22、值時，其當鹽濃度繼續(xù)升高達到某一上限值時，其溶解度又會以不同速度下降。分別沉淀析溶解度又會以不同速度下降。分別沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為出，這種現(xiàn)象稱為鹽析鹽析。S：為溶解度：為溶解度S0：離子強度為：離子強度為0時溶解度時溶解度Ks：鹽析常數(shù)：鹽析常數(shù)I：離子強度：離子強度 不同蛋白質分子量、表面電荷不同，在不不同蛋白質分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀。濃鹽中蛋白質的溶解度同鹽濃度下沉淀。濃鹽中蛋白質的溶解度遵循遵循CohnCohn方程：方程：鹽析影響因素鹽析影響因素vpHpH值：等電點處最易沉淀值：等電點處最易沉淀v溫度：濃鹽溶液中，溫度升高溶解度下降溫度：濃鹽溶液中，溫度升高溶解度下

23、降v鹽種類：高價鹽效果好，常用硫酸銨，一鹽種類：高價鹽效果好，常用硫酸銨，一般用氨水調般用氨水調pHpH。濃度經常用飽和度（換算。濃度經常用飽和度（換算表）表）v蛋白質濃度：過稀回收困難，過濃易沉淀。蛋白質濃度：過稀回收困難，過濃易沉淀。 飽和度：飽和度：溶液中飽和硫酸銨的體積與溶液溶液中飽和硫酸銨的體積與溶液總體積之比?？傮w積之比。 當?shù)鞍踪|溶液體積不大，要達到的鹽濃度當?shù)鞍踪|溶液體積不大，要達到的鹽濃度不高，可加入飽和硫酸銨溶液，不高，可加入飽和硫酸銨溶液，100m1100m1硫酸硫酸銨溶液，由飽和度銨溶液，由飽和度S1S1變?yōu)樽優(yōu)镾2S2，應向其中加，應向其中加入的飽和硫酸銨溶液的入的飽

24、和硫酸銨溶液的mlml數(shù)數(shù)(V)(V)為：為： V VVo(S2S1)/(1S2) Vo(S2S1)/(1S2) 當?shù)鞍踪|原有體積較大，要達到的鹽濃度當?shù)鞍踪|原有體積較大，要達到的鹽濃度又較高，此時加入固體硫酸銨為宜。在又較高，此時加入固體硫酸銨為宜。在00、2525下，硫酸銨濃度由飽和度下，硫酸銨濃度由飽和度SlSl增至增至S2S2應向應向1L1L溶液中添加的固體硫酸銨的克溶液中添加的固體硫酸銨的克數(shù)，可以直接查表數(shù)，可以直接查表: :鹽析法注意方面鹽析法注意方面v鹽析法適宜的鹽析法適宜的pHpH是接近分離酶的是接近分離酶的PIPI值值. .可控可控制制pHpH5 5或或pHpH6 6，使目

25、的酶與雜蛋白帶相，使目的酶與雜蛋白帶相同電荷而減少與它們的結合同電荷而減少與它們的結合v從酶的穩(wěn)定性和溶解度來看，鹽析溫度應從酶的穩(wěn)定性和溶解度來看，鹽析溫度應控制在控制在00左右為宜。左右為宜。v蛋白質濃度應在蛋白質濃度應在1mg/ml1mg/ml以上。以上。v 經鹽折后經鹽折后, ,沉淀通過離心或壓濾與母液分沉淀通過離心或壓濾與母液分開，收集后的沉淀再溶于一定的緩沖液心開，收集后的沉淀再溶于一定的緩沖液心除去不溶物除去不溶物, ,酶溶液又得到一次純化。酶溶液又得到一次純化。鹽析操作鹽析操作 低飽和度：低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過

26、均勻，一般終飽和度不超過40%40%。加量估算：假定混合總體積不變。加量估算：假定混合總體積不變。高飽和度：高飽和度：加固體鹽添加法，不會大量增加加固體鹽添加法，不會大量增加溶液體積。溶液體積。溫和攪拌添加，加畢后繼續(xù)攪拌溫和攪拌添加，加畢后繼續(xù)攪拌1010分鐘以上，分鐘以上，以充分沉淀。以充分沉淀。沉淀后要高速離心分離，還需除鹽。沉淀后要高速離心分離，還需除鹽。2、有機溶劑沉淀法、有機溶劑沉淀法（1 1）原理：）原理：利用酶等蛋白質在有機溶劑中的利用酶等蛋白質在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。溶解度不同而使之分離的方法。 與水相容的有機溶劑（甲醇、乙醇和丙酮與水相容的有機溶劑（甲醇、

27、乙醇和丙酮等）能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。等）能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。v有機溶解的主要作用是降低溶液的介電常有機溶解的主要作用是降低溶液的介電常數(shù)，因為分子中的靜電引力和溶劑的介電數(shù)，因為分子中的靜電引力和溶劑的介電常數(shù)成反比，加入有機溶劑，蛋白質分子常數(shù)成反比，加入有機溶劑，蛋白質分子間的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解間的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解度降低。度降低。v另一作用引起蛋白質脫水而沉淀。另一作用引起蛋白質脫水而沉淀。注意事項注意事項v一般在進行有機溶劑法時，溶液一般在進行有機溶劑法時，溶液pHpH盡可能盡可能靠近待純化酶的靠近待純化酶的PIPI值。值。v加入適

28、當?shù)闹行喳}，如加入適當?shù)闹行喳}，如5 5一一1010硫酸銨往硫酸銨往往有助于提高分離效率。但其濃度不得越往有助于提高分離效率。但其濃度不得越過過0.05mol/L0.05mol/L。v此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起酶的變性失活。酶的變性失活。3、等電點沉淀法、等電點沉淀法 利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質具有不同的等電點以及不同的兩性電解質具有不同的等電點這一特性，通過調節(jié)溶液的這一特性，通過調節(jié)溶液的pHpH值，使酶或值，使酶或雜質沉淀析出，從而使酶與雜質分離的方雜質沉淀析出，從而使酶與雜質

29、分離的方法稱為法稱為等電點沉淀等電點沉淀。4、有機聚合物沉淀法、有機聚合物沉淀法 在酶液中加入某些高分子物質，使其與酶在酶液中加入某些高分子物質，使其與酶形成聚合物而沉淀下來，從而使酶與雜質形成聚合物而沉淀下來，從而使酶與雜質分離的方法稱為分離的方法稱為有機物聚合法有機物聚合法。vSDSSDSvPEGPEGv丙烯酰胺丙烯酰胺5、萃取分離、萃取分離 萃取分離：萃取分離：利用溶質在互不相溶的兩相間利用溶質在互不相溶的兩相間分配系數(shù)不同而使溶質得到純化或濃縮的分配系數(shù)不同而使溶質得到純化或濃縮的方法。方法。（1 1）雙水相萃?。╇p水相萃取v將兩種不同水溶性聚合物的水溶液混合，將兩種不同水溶性聚合物的

30、水溶液混合，當聚合物達到一定濃度時，體系自然分成當聚合物達到一定濃度時，體系自然分成互不相溶的兩相，從而構成雙水相體系?；ゲ幌嗳艿膬上啵瑥亩鴺嫵呻p水相體系。v原理：原理：利用酶和雜質蛋白等在不混溶的兩利用酶和雜質蛋白等在不混溶的兩個水相系統(tǒng)中分配系數(shù)不同而達到分離的個水相系統(tǒng)中分配系數(shù)不同而達到分離的目的的方法。目的的方法。 雙水相的形成主要是由于高聚物之間的不雙水相的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，相溶性，即高聚物分子的空間阻礙作用，互相無法滲透，形成不了均一相，從而具互相無法滲透，形成不了均一相，從而具有分離傾向，在一定條件下分成兩相。有分離傾向，在一定條件

31、下分成兩相。v聚合物聚合物/ /聚合物聚合物：聚乙二醇：聚乙二醇/ /葡聚糖、聚丙葡聚糖、聚丙二醇二醇/ /聚乙二醇聚乙二醇v聚合物聚合物/ /鹽：鹽：聚乙二醇聚乙二醇/(/(硫酸鹽或磷酸鹽）硫酸鹽或磷酸鹽）雙水相適合進行的酶萃取雙水相適合進行的酶萃取v兩相中含有兩相中含有70%70%以上的水以上的水v設備簡單設備簡單v操作方便、快捷操作方便、快捷 細胞勻漿加入PEG、鹽葡聚糖 第一步雙水相萃取 靜止分層細胞碎片上 相 ： 蛋白質第二步雙水相萃取 靜止分層靜止分層下相：雜蛋白、核酸、多糖上相：蛋白質加入鹽第三步雙水相萃取 靜止分層靜止分層下相：目的酶 、雜蛋白、色素 加入鹽 圖 4-4 三步雙

32、水相萃取法分離酶的流程（2）超臨界流體萃?。┏R界流體萃取 超臨界流體萃取超臨界流體萃取是將超臨界流體是將超臨界流體（supercritical fluid）作為萃取溶劑，利用）作為萃取溶劑，利用欲分離物質與雜質在超臨界流體中溶解度欲分離物質與雜質在超臨界流體中溶解度不同而達到分離的一種萃取技術。不同而達到分離的一種萃取技術。 超臨界流體：超臨界流體：物質狀態(tài)超過氣液共存時的物質狀態(tài)超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質特有的點最高壓力和最高溫度下物質特有的點臨臨界點后的流體。界點后的流體。 臨界點圖4-5 超臨界系統(tǒng)相超臨界流體 PPaT 三相點 液態(tài) 氣態(tài) 固態(tài)v超臨界流體的物理特性和傳

33、質通常介于液超臨界流體的物理特性和傳質通常介于液體和氣體之間，體和氣體之間，超臨界流體超臨界流體的黏度大大低的黏度大大低于液體的黏度，接近氣體的黏度，有利于于液體的黏度，接近氣體的黏度，有利于物質擴散。其物質擴散。其擴散系數(shù)接近于氣體擴散系數(shù)接近于氣體。v由于溶質在超臨界流體中的由于溶質在超臨界流體中的溶解度隨溫度溶解度隨溫度和壓力的變化很大和壓力的變化很大，超臨界流體對于物質，超臨界流體對于物質的萃取具有選擇性。的萃取具有選擇性。v常用的超臨界流體是常用的超臨界流體是二氧化碳二氧化碳。（3）反膠團萃?。┓茨z團萃取 反膠團（反膠團（reversed micellesreversed micel

34、les）：兩性表面：兩性表面活性劑在非極性有機溶劑中親水基團自發(fā)活性劑在非極性有機溶劑中親水基團自發(fā)地向內聚集而成的微小膠團。地向內聚集而成的微小膠團。表面活性劑的存在是構成反膠團的必要條件表面活性劑的存在是構成反膠團的必要條件v陰離子型表面活性劑陰離子型表面活性劑v陽離子型表面活性劑陽離子型表面活性劑v非離子型表面活性劑非離子型表面活性劑 酶 水 烴 反膠團圖4-6 反膠團萃取的原理示意圖v反膠團的形成使有機相內形成了分散的親反膠團的形成使有機相內形成了分散的親水微環(huán)境，使生物分子在有機相（萃取相）水微環(huán)境，使生物分子在有機相（萃取相）內存在于反膠團的親水微環(huán)境中，消除了內存在于反膠團的親水

35、微環(huán)境中，消除了蛋白質難溶于有機相中或在有機相中發(fā)生蛋白質難溶于有機相中或在有機相中發(fā)生不可逆變性現(xiàn)象。不可逆變性現(xiàn)象。v通過控制通過控制pHpH值、離子強度、有機溶劑的種值、離子強度、有機溶劑的種類及表面活性劑的種類和濃度，可以改變類及表面活性劑的種類和濃度，可以改變蛋白質在兩相間的分配系數(shù)，不同蛋白質蛋白質在兩相間的分配系數(shù)，不同蛋白質表面電荷與相對尺寸的不同使得它們在兩表面電荷與相對尺寸的不同使得它們在兩相中的分配系數(shù)不同，從而達到分離的目相中的分配系數(shù)不同，從而達到分離的目的。的。二、根據(jù)不同分子大小而建立的純化方法二、根據(jù)不同分子大小而建立的純化方法1 1、凝膠過濾、凝膠過濾 凝膠過

36、濾凝膠過濾(Gel fitration (Gel fitration ChromatographyChromatography，GFC)GFC)也稱凝膠色譜，是也稱凝膠色譜，是利用凝膠的網(wǎng)狀結構根據(jù)分子大小進行分利用凝膠的網(wǎng)狀結構根據(jù)分子大小進行分離的一種方法。離的一種方法。凝膠性質凝膠性質v得水值得水值WrWr：膠體內部含水量膠體內部含水量1g1g干凝膠吸干凝膠吸水克數(shù)水克數(shù)v排阻限度：排阻限度：不能滲透到凝膠內部的最低分不能滲透到凝膠內部的最低分子量。子量。v分離范圍：分離范圍：上限為排阻限度。上限為排阻限度。v顆粒形狀：顆粒形狀：理想形狀為球狀。理想形狀為球狀。v顆粒大?。侯w粒大?。侯w粒

37、越小，分辨力越強，流速顆粒越小，分辨力越強，流速越低。越低。選擇性曲線選擇性曲線顆粒大小對分辨率大小顆粒大小對分辨率大小流速對分辨率的影響流速對分辨率的影響常用凝膠常用凝膠1 1、交聯(lián)葡聚糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠SephadexSephadexSephadex G-10Sephadex G-10至至200200，型號，型號/10=/10=得水值得水值細度細度umum，粗，粗100-300100-300， 中中50-10050-100 細細20-8020-80 超細超細10-4010-40 號越高排阻限度和分離范圍越高，溶脹時間越長，號越高排阻限度和分離范圍越高，溶脹時間越長，最大流體靜壓力越小，

38、操作壓力超限會破壞多孔最大流體靜壓力越小，操作壓力超限會破壞多孔結構。結構?；瘜W穩(wěn)定，不溶所有溶液，化學穩(wěn)定，不溶所有溶液，pH2-12pH2-12名稱基 質制造商Sephadex G-10Sephadex G-200Sepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6BSepharose CL 4B、Sepharose CL 6BSephacryl S系列Sephadex 系列Sepharose 系列Bio-Beads SBio-Beads X系列Bio-Gel P系列Bio-Gel A 系列TSKgel SW系列TSWgel toyopearl HW系列TSKgel

39、PW系列TSKgel CW-35Cellulofine交聯(lián)葡聚糖瓊脂糖交聯(lián)瓊脂糖聚丙烯酰胺-葡聚糖高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖高交聯(lián)瓊脂糖（二次交聯(lián)）苯乙烯-二乙烯苯聚丙烯酰胺瓊脂糖硅膠親水性聚乙烯醇親水性聚乙烯纖維素纖維素PharmaciaPharmaciaPharmacia Pharmacia PharmaciaPharmaciaBio-Rad Bio-RadBio-RadToyoSodaToyoSodaToyoSodaToyoSodaChisso表表4-6 4-6 常用的商品化凝膠過濾介質常用的商品化凝膠過濾介質凝膠的選擇凝膠的選擇v瓊脂糖凝膠剛性相對較高，能得到較高的瓊脂糖凝膠剛性相對較高，能

40、得到較高的流速，但葡聚糖凝膠的分辨率較高。流速，但葡聚糖凝膠的分辨率較高。v葡聚糖凝膠的穩(wěn)定范圍最寬，特別是堿穩(wěn)葡聚糖凝膠的穩(wěn)定范圍最寬，特別是堿穩(wěn)定性好（定性好（2-122-12），聚丙烯酰胺凝膠酸穩(wěn)定），聚丙烯酰胺凝膠酸穩(wěn)定性好（性好（1-101-10），瓊脂糖凝膠凝膠穩(wěn)定性范），瓊脂糖凝膠凝膠穩(wěn)定性范圍最小。圍最小。v不必須高流速和強酸的情況下，一般多選不必須高流速和強酸的情況下，一般多選用用葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠。用凝膠過濾去除小分子用凝膠過濾去除小分子v分離酶蛋白和溶液中的小分子，如抑制劑、分離酶蛋白和溶液中的小分子，如抑制劑、鹽、底物、保護劑等，傳統(tǒng)的技術是透析，鹽、底物、保護劑等，

41、傳統(tǒng)的技術是透析，但透析一般用時較多，不適合快速操作，但透析一般用時較多，不適合快速操作，此時凝膠過濾是最好的選擇。此時凝膠過濾是最好的選擇。v加壓法：有規(guī)格化產品供選用。加壓法：有規(guī)格化產品供選用。v離心柱法：裝小塑料柱離心柱法：裝小塑料柱平衡平衡離心離心加加樣樣再離心再離心收集收集v選膠：排阻限度在酶分子量之下，而在小選膠：排阻限度在酶分子量之下，而在小分子量之上越多越好，大承壓。分子量之上越多越好，大承壓。用凝膠過濾測分子量用凝膠過濾測分子量 利用凝膠過濾中按利用凝膠過濾中按分子量大小出峰位分子量大小出峰位置不同，可以測定置不同，可以測定蛋白質的分子量。蛋白質的分子量。2、膜分離、膜分離

42、 膜分離即過濾分離法膜分離即過濾分離法，利用微孔超濾膜僅，利用微孔超濾膜僅能選擇性透過一定大小的分子而達到分離能選擇性透過一定大小的分子而達到分離目的的一類方法。目的的一類方法。膜分離加壓膜分離加壓膜分離 微濾微濾超濾超濾反滲透反滲透電場膜分離電場膜分離 電滲析電滲析 離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析 擴散膜分離擴散膜分離 透析透析根據(jù)膜材料和不同進料液的特性，商品應用的膜產根據(jù)膜材料和不同進料液的特性，商品應用的膜產品通常采取如下幾種結構形式：管式；中空纖維；品通常采取如下幾種結構形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。卷式；平板式。 中空纖維膜超濾膜是由數(shù)百至數(shù)百萬根中空纖維膜超濾膜是由數(shù)百至

43、數(shù)百萬根中空纖維膜固定在圓筒形容器內構成。中空纖維膜固定在圓筒形容器內構成。v外壓型外壓型v內壓型內壓型3、依據(jù)電學解離性質不同建立的純化方法、依據(jù)電學解離性質不同建立的純化方法1 1、離子交換色譜、離子交換色譜 離子交換色譜離子交換色譜是利用離子交換劑上的可解是利用離子交換劑上的可解離基團對各種離子的作用力不同而達到分離基團對各種離子的作用力不同而達到分離目的的一種色譜方法。離目的的一種色譜方法?；驹砘驹?離子交換樹脂共價鍵有可解離基團，可人離子交換樹脂共價鍵有可解離基團，可人為選擇性使其帶上電荷，帶為選擇性使其帶上電荷，帶正電荷的為陰正電荷的為陰離子交換樹脂離子交換樹脂，帶負電荷的

44、為，帶負電荷的為陽離子交換陽離子交換樹脂樹脂。生物大分子表面帶有電荷，通過靜。生物大分子表面帶有電荷，通過靜電作用結合在相應的樹脂上，親和力的大電作用結合在相應的樹脂上，親和力的大小取決于靜電鍵的數(shù)目及排布有關。小取決于靜電鍵的數(shù)目及排布有關。不同不同的大分子有不同的親和力。的大分子有不同的親和力。改變環(huán)境的離改變環(huán)境的離子強度或子強度或pHpH值使表面電荷發(fā)生變化，會改值使表面電荷發(fā)生變化，會改變相應的親和力，從而改變大分子在樹脂變相應的親和力，從而改變大分子在樹脂上的吸附狀態(tài)，達到分離的目的。上的吸附狀態(tài)，達到分離的目的。 一般由一般由 高分子支持物和高分子支持物和功能基團功能基團( (又

45、又叫離子交換基叫離子交換基) )兩部分組成。離子交換劑根兩部分組成。離子交換劑根據(jù)支持介質的不同有離子交換樹脂、離子據(jù)支持介質的不同有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離于交換凝膠等。交換纖維素、離于交換凝膠等。高分子支持物高分子支持物功能基功能基團團離子交換劑離子交換劑v陽離子交換劑：陽離子交換劑：帶負電荷，吸附帶陽離子的基帶負電荷，吸附帶陽離子的基團，與陽離子發(fā)生交換，其活性基團為酸性。團，與陽離子發(fā)生交換，其活性基團為酸性。v常用羧甲基常用羧甲基v 磺丙基磺丙基陰離子交換劑：陰離子交換劑：帶正電荷，與陰離子發(fā)生交換，帶正電荷，與陰離子發(fā)生交換，其活性基團為堿性。常用二乙胺基乙基、二乙其活性基

46、團為堿性。常用二乙胺基乙基、二乙胺基乙基胺基乙基-2-2-羧丙基羧丙基v解離基團為強電離基團的稱為強離子交換解離基團為強電離基團的稱為強離子交換劑。如碘酸基。劑。如碘酸基。v帶有弱解離基團的為弱離子交換劑。如羧帶有弱解離基團的為弱離子交換劑。如羧甲基。甲基。吸附狀態(tài)吸附狀態(tài)v 緊密吸附：緊密吸附：靜電荷鍵多緊密吸附，吸附后靜電荷鍵多緊密吸附，吸附后解吸幾率極低，將被吸附于柱頂不下移。解吸幾率極低，將被吸附于柱頂不下移。v 有限吸附：有限吸附：靜電荷鍵不多，吸附與解吸附靜電荷鍵不多，吸附與解吸附處于某程度平衡，隨溶液在柱中下移，大處于某程度平衡，隨溶液在柱中下移，大分子多次吸附與解吸附，形成一定

47、的下移分子多次吸附與解吸附，形成一定的下移速度，速度，此狀態(tài)可以達到較高的分辨率。此狀態(tài)可以達到較高的分辨率。v 不吸附：不吸附：靜電鍵少，不能吸附，與溶液同靜電鍵少，不能吸附，與溶液同步下移，形成步下移，形成“穿越峰穿越峰”。離子交換纖維素樹脂的前處理離子交換纖維素樹脂的前處理v酸堿處理：酸堿處理：0.5mol/L HCl0.5mol/L HCl和和NaOHNaOH。v陽離子交換樹脂：酸陽離子交換樹脂：酸- -堿堿- -酸處理，最后掛酸處理，最后掛上陽離子上陽離子H H+ +。v陰離子交換樹脂：堿陰離子交換樹脂：堿- -酸酸- -堿處理，最后掛堿處理，最后掛上陰離子上陰離子OHOH- -。v

48、處理時間：處理時間：20-30min20-30min。v每步處理后用蒸餾水洗掉浮酸（堿），終每步處理后用蒸餾水洗掉浮酸（堿），終處理的樹脂還要用緩沖液洗至基本平衡的處理的樹脂還要用緩沖液洗至基本平衡的酸堿度和離子強度，以換上緩沖液離子。酸堿度和離子強度，以換上緩沖液離子。離子交換葡聚糖離子交換葡聚糖v以以Sephadex G-25Sephadex G-25和和G50G50為骨架，接入離子為骨架，接入離子交換基團，由于膠表面和膠孔內可連接交交換基團，由于膠表面和膠孔內可連接交換基團，吸附容量大，且流速大。換基團，吸附容量大，且流速大。vDEAEDEAE（QAEQAE），）， Sephadex A

49、-25Sephadex A-25，A-50A-50，CMCM（SPSP），）， Sephadex C-25Sephadex C-25，C-50C-50陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂v離子交換葡聚糖需在酸性（陽離子交換樹離子交換葡聚糖需在酸性（陽離子交換樹脂）或堿性（陰離子交換樹脂）緩沖液中脂）或堿性（陰離子交換樹脂）緩沖液中溶脹。溶脹。柱色譜操作步驟：柱色譜操作步驟：v 加樣加樣v 洗滌洗滌v 洗脫：恒定溶液洗脫，逐次洗脫和梯度洗洗脫：恒定溶液洗脫，逐次洗脫和梯度洗脫。脫。洗脫方法洗脫方法v 增加緩沖液離子強度：增加緩沖液離子強度：即增大離子在樹脂即增大離子在樹脂上的競爭，同時減少大分子表面電荷

50、，降上的競爭，同時減少大分子表面電荷，降低吸附力，從而使大分子從樹脂上解吸。低吸附力，從而使大分子從樹脂上解吸。（氯化鈉）（氯化鈉）v 改變改變pHpH值：值：減少蛋白質分子表面基團的解減少蛋白質分子表面基團的解離度，降低吸附力，從而使大分子解吸，離度，降低吸附力，從而使大分子解吸，但改變過多可能使蛋白質變性。但改變過多可能使蛋白質變性。有時兩種方法結合使用。有時兩種方法結合使用。洗脫方式洗脫方式梯度洗脫梯度洗脫v洗脫液中離子強度或洗脫液中離子強度或pHpH連續(xù)改變，使混合連續(xù)改變，使混合物中各個蛋白質先后進入有限吸附至不吸物中各個蛋白質先后進入有限吸附至不吸附狀態(tài)而被洗脫。附狀態(tài)而被洗脫。v

51、注意：注意：總體積要足夠大，使各分離峰不要總體積要足夠大，使各分離峰不要太擁擠，梯度上限要足夠高，使各物質都太擁擠，梯度上限要足夠高，使各物質都能解吸，梯度斜度適當，如過大各峰不易能解吸，梯度斜度適當，如過大各峰不易分開，過小，峰形過寬和拖尾。分開，過小，峰形過寬和拖尾。逐次洗脫（階段洗脫）逐次洗脫（階段洗脫） 用不同離子強度或用不同離子強度或pHpH洗脫液按洗脫能力由洗脫液按洗脫能力由小到大相繼進行洗脫。小到大相繼進行洗脫。優(yōu)點：優(yōu)點：洗脫峰集中，體積小濃度高，所需洗洗脫峰集中，體積小濃度高，所需洗脫液總量少，時間短，設備和操作簡單脫液總量少，時間短，設備和操作簡單缺點：缺點：如洗脫條件不準

52、確純度可能不夠高；如洗脫條件不準確純度可能不夠高；洗脫峰經常拖尾，變一次洗脫液會出現(xiàn)一洗脫峰經常拖尾，變一次洗脫液會出現(xiàn)一個峰，有時造成假象。個峰，有時造成假象。2 2、電泳、電泳v帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性帶電顆粒在電場的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電相反的電極方向移動，這種現(xiàn)象稱之為電泳泳(electrophoresis(electrophoresis，簡稱，簡稱EP)EP)。v19371937年由瑞典科學家年由瑞典科學家Tiselius ATiselius A首先提出首先提出來的，并設計出世界上第一臺自由電泳儀，來的，并設計出世界上第一臺自由電泳儀，建

53、立了建立了“移界電泳移界電泳”分離模式。首先證明分離模式。首先證明了血清是由白蛋白、了血清是由白蛋白、11、22、和和球球蛋白組成的，蛋白組成的，19481948年被授予諾貝爾獎。年被授予諾貝爾獎。 顆粒在電場中的移動速度主要決定于其顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本本身所帶的凈電荷量身所帶的凈電荷量，同時受，同時受顆粒形狀顆粒形狀和和顆顆粒大小粒大小的影響。此外，還受到的影響。此外，還受到電場強度電場強度、溶液溶液pHpH值值、離子強度離子強度及及支持體的特性支持體的特性等外等外界條件的影響。界條件的影響。 （1）聚丙烯酰胺凝膠電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳v聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電

54、泳（polyacrylamide gel electrophoresis PAGE）以聚丙烯酰胺作為）以聚丙烯酰胺作為支持載體。支持載體。v聚丙烯酰胺有單體丙烯酰胺和亞甲基雙丙聚丙烯酰胺有單體丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺聚合而成。烯酰胺聚合而成。（2）等電聚焦電泳）等電聚焦電泳v等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（isoelectric focusing)isoelectric focusing)是是利用蛋白質等兩性電解質具有等電點，在利用蛋白質等兩性電解質具有等電點，在等電點的等電點的pHpH值下呈電中性，從而不發(fā)生泳值下呈電中性，從而不發(fā)生泳動的特點而進行的電泳分析。動的特點而進行的電泳分析。v在電

55、泳設備中首先需調配連續(xù)的在電泳設備中首先需調配連續(xù)的pHpH梯度，梯度，然后使蛋白質在電場作用下泳動到與各自然后使蛋白質在電場作用下泳動到與各自等電點相同的等電點相同的pHpH值區(qū)域而不再繼續(xù)泳動，值區(qū)域而不再繼續(xù)泳動，從而形成具有不同等電點的蛋白質區(qū)帶。從而形成具有不同等電點的蛋白質區(qū)帶。等電聚焦電泳法測定蛋白質等電聚焦電泳法測定蛋白質pI（3）連續(xù)凝膠電泳）連續(xù)凝膠電泳v連續(xù)凝膠電泳實質上是聚丙烯凝膠垂直平連續(xù)凝膠電泳實質上是聚丙烯凝膠垂直平板電泳的發(fā)展，實現(xiàn)在批次內連續(xù)將各個板電泳的發(fā)展，實現(xiàn)在批次內連續(xù)將各個電泳區(qū)帶分離回收，并可進行多批次分離電泳區(qū)帶分離回收，并可進行多批次分離操作。

56、操作。v在電場作用下，電泳形成的區(qū)帶一次連續(xù)在電場作用下，電泳形成的區(qū)帶一次連續(xù)走出凝膠并進行洗脫、收集，達到將各組走出凝膠并進行洗脫、收集，達到將各組分分離回收的目的。分分離回收的目的。圖圖4-12 連續(xù)流動電泳原連續(xù)流動電泳原理示意圖理示意圖 不同遷移 液流樣品注入+ （4）連續(xù)流動電泳）連續(xù)流動電泳v連續(xù)流動電泳是在連續(xù)流動電泳是在紙電泳紙電泳的基礎上發(fā)展起來的。的基礎上發(fā)展起來的。v以以濾紙濾紙為載體，可以為載體，可以減少分離組分在流動的緩沖減少分離組分在流動的緩沖液中的自由擴散液中的自由擴散。將濾紙的上端插入電泳液槽中，。將濾紙的上端插入電泳液槽中，依靠依靠毛細管虹吸作用毛細管虹吸作

57、用和和重力作用重力作用，電泳液沿著紙，電泳液沿著紙面向下均勻流動，在垂直于電泳緩沖液流動方向面向下均勻流動，在垂直于電泳緩沖液流動方向施加電場，即在濾紙的兩個側邊上與電極解觸，施加電場，即在濾紙的兩個側邊上與電極解觸，將欲分離的樣品以定點方式流加在濾紙上，加樣將欲分離的樣品以定點方式流加在濾紙上，加樣點的位置需根據(jù)各組分的電泳行為確定。點的位置需根據(jù)各組分的電泳行為確定。v在電場作用下，帶有不同電荷的組分隨著電泳緩在電場作用下，帶有不同電荷的組分隨著電泳緩沖液沖液向前流動向前流動的同時而向不同的同時而向不同電極方向電極方向遷移。遷移。（5 5）無載體連續(xù)流動電泳）無載體連續(xù)流動電泳 與連續(xù)流動

58、載體類似，只是不使用載體，與連續(xù)流動載體類似，只是不使用載體，而是使用兩張塑料板，在她們之間形成而是使用兩張塑料板，在她們之間形成0.50.50.8mm0.8mm的間隙作為電泳槽，使電泳緩的間隙作為電泳槽，使電泳緩沖液從下到上平行流過電泳槽，依靠表面沖液從下到上平行流過電泳槽，依靠表面張力減少液體內部的流動性，待分離樣品張力減少液體內部的流動性，待分離樣品從下端某一點連續(xù)加入，在垂直于電泳緩從下端某一點連續(xù)加入，在垂直于電泳緩沖液流動方向上的電場作用下，帶有不同沖液流動方向上的電場作用下，帶有不同電荷的各個組分分別向不同的電極方向遷電荷的各個組分分別向不同的電極方向遷移，在電泳槽的末端，將流出

59、的電泳緩沖移，在電泳槽的末端，將流出的電泳緩沖液分割，再分別檢測、收集，即可獲得分液分割，再分別檢測、收集，即可獲得分離的各個組分。離的各個組分。多孔膜連續(xù)自由流動電泳多孔膜連續(xù)自由流動電泳 利用多孔膜將電泳槽分成多個小池，在電利用多孔膜將電泳槽分成多個小池，在電場作用下，電泳分離的物質可透過膜在小場作用下，電泳分離的物質可透過膜在小池間遷移，而多孔膜可起到穩(wěn)定液流、防池間遷移，而多孔膜可起到穩(wěn)定液流、防止擴散的作用，在各個小池流動的電泳緩止擴散的作用，在各個小池流動的電泳緩沖液不僅可起到帶走電泳產生的熱量的作沖液不僅可起到帶走電泳產生的熱量的作用，同時也可以收集電泳產生的不同區(qū)帶，用，同時也

60、可以收集電泳產生的不同區(qū)帶，從而達到分離的目的。從而達到分離的目的。 圖 4-13 多孔膜自由流動電泳示意圖3、聚焦色譜、聚焦色譜 原理：當用特種的緩沖液滴定和淋洗填裝原理：當用特種的緩沖液滴定和淋洗填裝在色譜柱中的特種多緩沖液交換劑時，隨在色譜柱中的特種多緩沖液交換劑時，隨著這種緩沖液的擴展，會在色譜柱中自上著這種緩沖液的擴展，會在色譜柱中自上而下地建立起連續(xù)的而下地建立起連續(xù)的pHpH梯度，將待純化樣梯度，將待純化樣品加入色譜柱，其中的蛋白質組分將隨著品加入色譜柱，其中的蛋白質組分將隨著多緩沖液的擴展按各自的等電點聚焦與相多緩沖液的擴展按各自的等電點聚焦與相應的應的pHpH值區(qū)段并隨擴展過