第八章20104miRNA

1、miRNA與siRNA非編碼小分子RNAmiRNAsiRNA非編碼小分子RNA從“生物垃圾”到“年度分子” 真核生物基因組中99%為非編碼序列，外顯子和調控序列外稱為“垃圾” 非編碼序列轉錄出的RNA為“垃圾RNA分子” 非編碼核糖核酸：除成熟mRNA分子外所有獨立存在的RNA分子。 進化越高，“垃圾”越多？ 1993年，線蟲，lin-4 2000年，線蟲，let-7 很快分離出一類21-22 小分子RNA 1998, RNA干擾現(xiàn)象 2001，人工合成，siRNA，抑制同源序列基因的表達 至此，“垃圾”變“寶物” 非編碼RNA的研究成果先后7次在近10年scince評選：年度十大科技突破 2

2、000年，RNA的研究進展被美國科學雜志評為重大科技突破； 2001年“RNA干擾”作為當年最重要的科學研究成果之一，再次入選“十大科技突破”； 2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。 同時， Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成功之一。 2003年，小核糖核酸的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。 RNA研究的突破性進展，是生物醫(yī)學領域近20年來，可與HGP（人類基因組計劃，生物通網(wǎng)站注）相提并論的最重大成果之一 除了除了mRNA、tRNA、rRNA三種三種RNA外外，細胞的不同部位存

3、在的許多其他種類的小，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子分子RNA，統(tǒng)稱為，統(tǒng)稱為非非mRNA小小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。 u snmRNAs:u snmRNAs的種類的種類:核內小核內小RNA (small nuclear RNA, snRNA)核仁小核仁小RNARNARNA (small nucleolar RNA, snoRNA)胞質小胞質小RNA RNA (small cytoplasmic RNA, scRNA)催化性小催化性小RNA RNA (small catalytic RNA)小片段干涉小片段干涉 RNARNA (s

4、mall interfering RNA, siRNA)起始起始RNARNA (initiator RNA，iRNA) 微小微小RNA（micro RNA, miRNA） u snmRNAs的功能：的功能： U系列系列snRNA與蛋白質結合構成與蛋白質結合構成snRNP，參與參與hnRNA和和rRNA的加工和轉運。的加工和轉運。如如U1、U2、U3、U4、U5、U6等。等。多種多樣多種多樣 siRNA和和miRNA參與某些基因表達調控。參與某些基因表達調控。 iRNA作為作為DNA合成的引物。合成的引物。MicroRNAmicroRNA是誰？ MicroRNA也可以寫做miRNA ，是一種21

5、25nt長的單鏈小分子RNA。 它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF）。成熟的miRNA，5端有一個磷酸基團，3端為羥基。 編碼miRNAs的基因最初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發(fā)夾結構單鏈RNA前體（pre-miRNA）并經(jīng)過Dicer酶加工后生成。 成熟的miRNA 5端的磷酸基團和3端羥基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區(qū)分標志。 miRNA 5端第一個堿基對U（尿苷）有強烈的傾向性，而對G卻排斥，但第二到第四個堿基缺乏U。一般來講，除第四個堿基外，其他位置堿基通常都缺乏C。

6、這些分子能夠與那些和它的序列互補的mRNA分子相結合，有時候甚至可以與特定的DNA片斷結合。這種結合的結果就是導致基因的沉默。這種方式是身體調節(jié)基因表達的一個重要策略。 miRNA研究的開端 miRNA的研究起始于時序調控小RNA（stRNAs）。 1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲（Caenorhabditis elegan）中發(fā)現(xiàn)了第一個定時調控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4 2002年，Reinhart等又在線蟲C.elegan中發(fā)現(xiàn)第二個異時性開關基因let-7 2001年10月science報道了三個實驗室從線蟲、果蠅和人體克隆的幾十個類似C.elegan的lin-4的小RNA基因，

7、稱為microRNA。 隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個miRNAs，并且發(fā)現(xiàn)它與多種重要的生命過程有關。 MiRNA的作用方式 miRNA基因是一類高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分為三種： 第一種以線蟲lin-4為代表，作用時與靶標基因不完全互補結合，進而抑制翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性（不改變mRNA豐度），這種miRNA是目前發(fā)現(xiàn)最多的種類； 第二種以擬南芥miR-171為代表，作用時與靶標基因完全互補結合，作用方式和功能與siRNA非常類似，最后切割靶mRNA； 第三種以let-7為代表，它具有以上兩種作用模式：當與靶標基因完全互補結合時，直接

8、靶向切割mRNA，如果蠅和Hela細胞中l(wèi)et-7直接介導RISC分裂切割靶mRNA；當與靶標基因不完全互補結合時，起調節(jié)基因表達的作用，如線蟲中的let-7與靶mRNA3端非翻譯區(qū)不完全配對結合后，抑制調節(jié)基因的翻譯。Differences in miRNA Mode of ActionGenomics of microRNAMiRNA的特異性 研究表明MiRNAs在物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性在特定的時間、組織才會表達。細胞特異性或組織特異性是miRNA表達的主要特點，又如擬南芥中的miR-171僅在其花序中高水平表達，在某些組織低水平表達，在莖、葉等組織中卻無任何表達的跡象

9、；20-24h的果蠅胚胎提取物中可發(fā)現(xiàn)miR-12，卻找不到miR3-miR6，在成年果蠅中表達的miR-1和let-7也無法在果蠅胚胎中表達，這同時體現(xiàn)了miRNA的又一特點基因表達時序性。 MiRNA表達的時序性和組織特異性暗示miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調控，對組織的發(fā)育起重要作用。MiRNA的產(chǎn)生“話說在“廣袤”的細胞質中游蕩著一個名叫Dicer的浪子。與此同時，在細胞的腹地細胞核中，一個身形頎長的RNA降生了即pri-miRNA。Dicer在細胞質中遇到了一個雙鏈的RNA并被她所吸引，于是尾隨她并最終在她身上咬了一口，結果siRNA降生了。D

10、icer又繼續(xù)游蕩，這時他看到了一個非常漂亮的發(fā)夾狀的RNA（她其實就是在細胞核中降生的那條RNA的化身pre-miRNA），于是非常仰慕并最終歷經(jīng)艱辛將她咬了一口。這樣我就“哇”的一聲來到了這個世界上”miRNA說?！拔液蛃iRNA有許多共同點，但我們的差別也很多，所以可別把我們混在一起哦，”它補充說。 MiRNA的功能研究 最近，miRNA常常在那些頂級雜志上露面，人類對它在生長發(fā)育中的調節(jié)功能以及與疾病關系的了解也一點一點地在增加。 研究發(fā)現(xiàn)miRNA的主要功能是調節(jié)生物體內在的與體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關的基因的表達，而且研究人員推測這種小分子調節(jié)著人類三分之一的基因！ 目前認為m

11、iRNA在人體中有200多種類型。發(fā)表在6月2日的Nature雜志上的一項研究表明miRNA與感染的病毒的復制有關之前認為這種分子只與內生的物質的調節(jié)有關，而于外源病毒的調節(jié)無關。因此，這一發(fā)現(xiàn)對miRNA的功能有了新的認識 2005年6月9日的自然雜志上的文章顯示microRNA的活動模式能夠被用于診斷癌癥。 研究人員Todd R. Golub和Robert Horvitz等人證明miRNA表達特征能用于劃分人類癌癥以及區(qū)別正常細胞和癌細胞。研究表明miRNA表達特征甚至能夠鑒別出那些從外形上無法確定的癌細胞。 發(fā)表在同期自然雜志上的第二篇文章表明一種特殊的miRNA束能夠導致小鼠的淋巴瘤。

12、 由霍普金斯大學醫(yī)學院的Joshua Mendell和同事發(fā)表在自然的第三篇文章顯示一些miRNA與一種已知能導致人類癌癥的基因相互協(xié)作。這讓人懷疑miRNA可能充當一種新型的癌基因。通過確定出大多數(shù)常見癌癥中表達的特殊miRNA以及分析它們對癌癥發(fā)生和癌癥基因的影響，這三項同期公布在自然雜志上的研究改變了癌癥遺傳學的前景。 新的研究表明miRNA在從癌癥、心臟病到艾滋病的各種疾病中起到一定的作用，而且有間接的證據(jù)表明如果將兩個miRNA從人類基因組中刪除就會發(fā)生白血病。 對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育進程，造血過程，器官形成，凋亡，細

13、胞增殖，甚至是腫瘤發(fā)生(Kim, 2005)。miRNA controls some plant phenotypemiRNA controls the miRNA controls the differentiation of the differentiation of the hematopoietic stem cellhematopoietic stem cellExpression studies on Expression studies on mammalian microRNAsmammalian microRNAsObesity 肥胖Host-virus interacti

14、on: a new role for Host-virus interaction: a new role for microRNAsmicroRNAsmiRNA and CancermiRNA and CancerComparison of small RNAComparison of small RNAcharacterization methodscharacterization methodsMicroRNA Quantitation by RT-MicroRNA Quantitation by RT-PCRPCRMicroRNA Quantitation by RT-PCRMicro

15、RNA Quantitation by RT-PCRSBC-miRNA microarryhybridization resultScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600掃描像素值： 5m，PMT(%)數(shù)值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a為肝標志小RNAMIR-19b為癌標志小RNAScanner=GenePix 4000BWavelengths=635,532PMTGain=650,600掃描像素值： 5mPMT(%)數(shù)值：100肝癌CY5癌旁CY3MIR-122a為肝標志小RNAMIR-155,20a ,le

16、t7 family為癌標志小RNAsiRNA 小的干涉RNA（small interfering RNA; siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是兩種序列特異性地轉錄后基因表達的調節(jié)因子，是小RNA的最主要組成部分，它們的相關性密切，既具有相似性，又具有差異性。對小RNA的深入研究將使我們更深一步了解生命的奧秘。RNA干涉（RNAi）在實驗室中是一種強大的實驗工具，通過這種方式，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導序列特異的目標基因的沉默，迅速阻斷基因活性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過程中人工體外合成的小片段RNA，由約20個堿基對組成，包括5個磷酸

17、根，2個核苷和3個懸臂。 在哺乳動物中利用小的干涉RNA和短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs，shRNA）來進行RNA干涉以使基因沉默已經(jīng)成為強大而有力的生物工具。 圖1 dsRNA可以沉默目標基因。在植物中，通過注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重復序列可以誘導目標基因沉默。在線蟲中，沉默也可以用注射dsRNA的方式來誘導。這兩種生物體中，沉默是系統(tǒng)的并且傳遍全身。a) 沉默信號從脈桿傳到葉片組織。綠色是綠色熒光蛋白；紅色是葉綠素熒光，可以在綠色熒光蛋白被沉默后看出。b,c）通過實驗，使得線蟲的核中表達綠色熒光蛋白。實驗者在左邊加上對照dsRNA，右邊加上綠色熒光蛋白的d

18、sRNA。一些神經(jīng)元核仍然可以檢測到熒光，對應于少量的蛋白質表達。c）Hela細胞加上ORC6 siRNA之后，針對微管蛋白（綠色）和DNA（紅色）進行染色。ORC6的去除導致多核細胞的積累。穩(wěn)定的沉默也可以通過表達發(fā)夾結構或者折回的雙鏈RNA的表達來實現(xiàn)。d）當和野生型的果蠅相比（右邊），成體果蠅中表達控制白色基因的發(fā)夾同源物（左邊）導致眼睛喪失色素。 1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次發(fā)現(xiàn)2125nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對轉基因導致基因沉默十分重要，而在轉基因正確表達的植株中則未出現(xiàn)。 隨后，Hammond 等進行的細胞提取物核酸酶活性實驗證明了小分子RNA在RN

19、Ai 中的作用，這些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。 RNAi能夠調節(jié)和關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動。 RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅提升了人們對RNA分子的認識，還大大推進基因功能的研究，更為各種類型的傳染病和癌癥提供了一種新的手段。 近年來，有關RNAi研究成果令人眼花繚亂：人們利用RNAi途徑來人為調節(jié)特定基因的表達以達到治療遺傳疾病甚至癌癥的目的，而且已經(jīng)有不少的成功信息公布。 siRNA是RNAi途徑的主要作用物,miRNA和siRNA很容易混淆，他們有許多共同點也有許多不同點。相同點/聯(lián)系點siRNAmiRNA長度及特征都約在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羥

20、基合成的底物miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的Dicer酶依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白參與RISC組分二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導沉默機制上有重疊；產(chǎn)生了on target和off target的問題作用方式都可以阻遏靶標基因的翻譯，也可以導致mRNA降解，即在轉錄水平后和翻譯水平起作用進化關系可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補充，miRNA在進化過程中替代了siRNA不同點/分歧點siRNAmiRNA機制性質往往是外源引起的

21、，如病毒感染和人工插入dsRNA之后誘導而產(chǎn)生，屬于異常情況是生物體自身的一套正常的調控機制直接來源長鏈dsRNA發(fā)夾狀pre-miRNA分子結構siRNA是雙鏈RNA，3端有2個非配對堿基，通常為UUmiRNA是單鏈RNA對靶RNA特異性較高，一個突變容易引起RNAi沉默效應的改變相對較低，一個突變不影響miRNA的效應作用方式RNAi途徑miRNA途徑生物合成，成熟過程由dsDNA在Dicer酶切割下產(chǎn)生;發(fā)生在細胞質中pri-miRNA在核內由一種稱為Drosha酶處理后成為60nt的帶有莖環(huán)結構的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；這些pre-miRNAs在轉運

22、到細胞核外之后再由Dicer酶進行處理，酶切后成為成熟的miRNAs；發(fā)生在細胞核和細胞質中不同點/分歧點siRNAmiRNAArgonaute (AGO) 蛋白質各有不同的AGO蛋白質各有不同的AGO蛋白質互補性（complementarity）一般要求完全互補不完全互補，存在錯配現(xiàn)象RISCs的分子量不同(Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004)siRISCsmiRISCs/miRNP各自的生物學功能不同抵抗病毒的防御機制；沉默那些過分表達的mRNA；保護基因組免受轉座子的破壞對有機體的生長發(fā)育有重要作用(Rhoades et al., 2002)重要特性高度特異性高度的保守性、時序性和組織特異性不同點/分歧點siRNAmiRNA作用機制單鏈的siRNA結合到RISC復合物中，引導復合物與mRNA完全互補，通過其自身的解旋酶活性，解開siRNAs，通過反義siRNA鏈識別目的mRNA片段，通過內切酶活性切割目的片段，接著再通過細胞外切酶進一步降解目的片段。同時，siRNA也可以阻遏3U