有機(jī)試劑 5,熒光試劑

1、第五章 熒光試劑 熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展 熒光產(chǎn)生的理論基礎(chǔ) 分子熒光光譜 熒光強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命 有機(jī)試劑結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 代表性熒光試劑熒光的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展 十六世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)，但對(duì)熒光的產(chǎn)生原理和條件 1852年Stokes考察奎寧和葉綠素?zé)晒?發(fā)現(xiàn)熒光波長(zhǎng)比照射光波長(zhǎng)要長(zhǎng)，認(rèn)定是物質(zhì)吸收光后重新發(fā)射出的光，提出了“熒光” 1867 Goppetsroder 桑色素?zé)晒鈾z測(cè)鋁 二十世紀(jì)初，已熒光素、稠環(huán)芳烴及曙紅等600余種化合物有熒光 1924年 Wawwillous測(cè)定熒光產(chǎn)率 1926年 Gavila對(duì)熒光壽命進(jìn)行了測(cè)定 熒光產(chǎn)生的理論基礎(chǔ) 基態(tài)和激發(fā)態(tài) 單重態(tài)（S)和三重態(tài) (T)T

2、TSSSFPisciscicicic21102E熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜 emex 斯托克斯（stokes）位移 熒光強(qiáng)度、熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命 熒光強(qiáng)度 F= 2.3FIobc F熒光強(qiáng)度；F熒光量子產(chǎn)率，Io照射到被測(cè)物質(zhì)上的光強(qiáng)度；該物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)；b檢測(cè)池厚度；c物質(zhì)濃度 熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度的區(qū)別 熒光量子產(chǎn)率是熒光物質(zhì)的固有屬性 其與物質(zhì)濃度無(wú)關(guān) 熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度有密切關(guān)系 同濃度下，熒光量子產(chǎn)率高的熒光越強(qiáng)（排出外界條件影響）熒光壽命 熒光壽命（） lnFo-lnF=-t/ Fo和F分別代表t=0和t=時(shí)的熒光強(qiáng)度，通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)量不同時(shí)間的Ft值，確定lnF

3、tt的關(guān)系曲線，應(yīng)為直線 直線斜率就是熒光壽命 用式子=10-5/max估計(jì)熒光壽命，max為最大吸收波長(zhǎng)下的摩爾吸光系數(shù)，如S0-S1躍遷的值一般為103，估計(jì)熒光壽命是10-8s. 影響有機(jī)化合物熒光的有機(jī)試劑結(jié)構(gòu)因素 分子共軛體系 共軛大鍵共平面程度及其剛性 .取代基 影響 雜原子影響 分子離子化對(duì)熒光的影響 立體結(jié)構(gòu)分子共軛體系大小對(duì)熒光的影響 有機(jī)熒光團(tuán) 能發(fā)射出熒光的共軛鍵的基團(tuán) （-CH=CH-）n（n2），苯，萘，對(duì)苯二醌，苯并雜環(huán)、吡喃酮以及占噸酮基團(tuán) 共軛體系越大，熒光量子強(qiáng)度越高 對(duì)于稠環(huán)芳烴，具有相同芳香環(huán)數(shù)的化合物，芳環(huán)的連接和排列順序不同，化合物的有關(guān)熒光性能也不同

4、 芳環(huán)直線性排列的化合物的熒光發(fā)射波長(zhǎng)比非線性排列的波長(zhǎng)要長(zhǎng) 芳香環(huán)數(shù)越多，共軛體系越大，熒光越強(qiáng) 芳香環(huán)或共軛體系增加到一定程度，只是熒光發(fā)射波長(zhǎng)向長(zhǎng)波紅移，F(xiàn)不再增加，還可能降低 共軛大鍵共平面及其剛性的影響 有機(jī)分子具有共軛平面結(jié)構(gòu)才顯示出熒光特性 分子的共軛體系必須具備共平面性 共軛體系的平面結(jié)構(gòu)還要有一定程度的剛性 C252 (C H ) NN(C H )252+CCOOHON(C H )252+252 (C H ) N取代基的影響 取代基種類的影響 取代基有推電子取代基和吸電子取代基 推電子取代基：-NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OR（R=-CH3、-C2H5等 吸電子取代

5、基：C=O、-NO2，-COOH，-CHO、-COR（R=-CH3，-C2H5等）、-N=N-、鹵素（-F，Cl，Br，I）等 推電子取代基增強(qiáng)熒光 推電子取代基增強(qiáng)熒光 取代基中O或N上的孤對(duì)電子參與有機(jī)熒光分子的共軛大鍵，擴(kuò)大共軛體系 波長(zhǎng)紅移，熒光強(qiáng)度明顯增加 極性溶劑中易形成氫鍵，強(qiáng)酸中易質(zhì)子化，堿性介質(zhì)中可離解出H 質(zhì)子化試劑分子帶正電，使熒光減弱 離解出H試劑分子帶負(fù)電荷，熒光增強(qiáng) 吸電子取代基 減弱熒光 類取代基中的n電子躍遷到*屬于禁阻躍遷 ，激發(fā)態(tài)分子數(shù)較少 S1T1的體系間跨越占優(yōu)勢(shì)，激發(fā)態(tài)分子放出光子的數(shù)大為減少，使熒光減弱 CN氰基（-CN）是不飽和取代基，它應(yīng)使取代的

6、化合物熒光減弱，但實(shí)際結(jié)果是表現(xiàn)出推電子的效果熒光增強(qiáng) F雖是吸電子取代基，但增強(qiáng)熒光 磺酸基含有不飽和鍵，表現(xiàn)出吸電子性能，應(yīng)減弱熒光 但它易離解出H帶負(fù)電荷，又體現(xiàn)出推電子的行為，使熒光增加 增減相低，磺酸根的引入一般無(wú)顯著熒光變化，最明顯的是試劑水溶性的增加 取代基數(shù)量及其所處位置的影響 對(duì)于不同的發(fā)光母體，同類取代基所處位置不同所表達(dá)的熒光強(qiáng)弱變化規(guī)律也不相同 小體積取代基所貢獻(xiàn)的共軛效應(yīng)小只是體現(xiàn)出其電荷影響 大的取代基如苯或乙炔基苯，其共軛效應(yīng)大，取代后擴(kuò)大共軛體系，熒光增強(qiáng)的效應(yīng)大于其吸電子使熒光減弱的效應(yīng) 結(jié)果是取代后的熒光強(qiáng)度不是減弱而是大大增強(qiáng) 兩類取代基共同作用 推電子基

7、和吸電子基共存時(shí)，推電子基結(jié)合在對(duì)于吸電子基共振電子密度減小的原子上，構(gòu)成熒光性 7-羥基香豆素（F =0.37） 6-和8-羥基取代香豆素?zé)o熒光 4-甲基-7-羥基香豆素則因甲基的超共軛效應(yīng)使熒光增強(qiáng)（F =0.41） OO12345678 兩個(gè)以上推電子基同時(shí)取代，化合物的熒光會(huì)受到抑制 如 甲氧基苯的F是0.29 1，4-二甲氧基苯的F是0.21， 再如 甲苯的F是0.17 對(duì)甲酚的F等于0.09， （取代基）加重效應(yīng)對(duì)熒光的影響 加重效應(yīng)減弱熒光 ONONCH3NNCH3CH3NONCH3NNCH3CH3SF是0.22，P（磷光量子產(chǎn)率）是0.14 F等于10-5，P變?yōu)?.43 芳香

8、環(huán)中雜原子的影響 增強(qiáng)或減弱熒光，看雜原子化合物結(jié)構(gòu) 吡咯、噻吩及呋喃熒光量子產(chǎn)率很小 ，苯并后的吲哚、硫茚及苯并呋喃熒光大大增強(qiáng) n*躍遷變?yōu)?*躍遷 問(wèn)題：從分子結(jié)構(gòu)和光譜特性討論有機(jī)顯色劑和熒光試劑的聯(lián)系與區(qū)別。ONNHF 0.86 F約1.0F 0.90.分子離子化對(duì)熒光的影響 分子離子化對(duì)熒光影響很大*熒光試劑在不同酸度下離子化產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度大小不同*選擇適宜條件，使試劑有最大熒光強(qiáng)度，以便于高靈敏檢測(cè) 分子的立體結(jié)構(gòu)也影響 熒光 1，2-二苯乙烯反式具有較強(qiáng)的熒光，順式則無(wú)熒光 CHCHCHCH無(wú)機(jī)離子的主要有機(jī)熒光試劑 鈣黃綠素 類似物22(CH COOH)OHOOCOOH22(

9、CH COOH)CH2NCH2N(CH COOK)22(CH COOK)22ONONOCH2COONCH3CH2OKOHOClClONOCH2CH3NCH2O22(CH COOH)22(CH COOH)(CH COOK)22(CH COOK)22NOCH2NHCOOCH3NCH2OCH3ONCH2OCH3NN(CH COOK)22(CH COOK)22NOCH2OCH3NCH2O22(CH COOH)22(CH COOH)N(CH )32(H C) N32+Cl-(CH COOK)22(CH COOK)22+SO2NHNNNONCH2OOCH2(CH COOK)22(CH COOK)22OCH

10、2NNHCOOOHClClOCOOCOOOOHOCONHNCH2OClClKK2，2-二羥基偶氮苯同系物 HONNHOOHYR 西夫堿和腙類 OHNHOXYCHNRZNCHHOCHNNHCSNH2.2-羥基-1-萘甲醛縮氨基硫脲 0.03-0.7gGa/ml，ex/em=412nm/470nm OHCHNNHNN3-羥基皮考啉醛縮-2-吡啶腙（38）在pH4.7熒光測(cè)定Al3+，檢測(cè)限小于2ng 芐基-2-吡啶酮-2-喹啉腙（37）可以熒光測(cè)定10ng的鋅 CNNHNCH2N8-羥基喹啉（HQ）和8-羥基喹啉-5-磺酸（HQS -二酮類 黃酮類 蒽醌類OOABCDEFGI三苯甲烷占噸酮類 酸性

11、化合物 1.熒光素同系物曙紅和二溴熒光素 2.苯芴酮同系物 堿性化合物 羅丹明6G丁級(jí)羅丹明B羅丹明4G羅丹明3B羅丹明B 還有卟啉某些無(wú)機(jī)陰離子和小分子的熒光試劑 測(cè)定亞硝酸根 2，3-二氨基萘 1，2-二氨基-5，7-萘二磺酸 NH2NH2SO3HHO3Sex/em=298nm/429nm ，不需萃取，檢測(cè)限達(dá)到0.09ng/ml 2，3-二氨基萘與Se（IV）形成硒唑測(cè)硒，ex/em=366nm/520、560nm，測(cè)定范圍0.4-6.0ng/ml HOOHOOONH2H2NHOOHOOONHNNNO+O22CONH-NHONH2N(C H )252(C H ) N5 22+CONH-N

12、HNOONH2N(C H )252(C H ) N5 22+NO (NO)2-與NO形成熒光素三氮唑檢測(cè)生物體內(nèi)的NO，檢測(cè)限為5nmol/L 檢測(cè)限1mol/L CHONNNH2NONCOHOOH+H+ 2-苯乙酰-1，3-茚滿二酮-1-腙（2-DBIH）測(cè)定溴氧（O3）的熒光試劑，基于在三氯甲烷中溴氧與1，2-二-（4-吡啶基）乙烯反應(yīng)生成4-甲?；拎ぃ?-甲?；拎づc2-DBIH反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物，ex/em=468nm/536nm ，檢測(cè)限0.02g*在過(guò)氧化酶的存在下，過(guò)氧化氫（H2O2）氧化7-羥基-6-甲氧基香豆素（莨菪亭，58）并使其熒光下降，據(jù)此可以測(cè)定H2O2，檢測(cè)限10-

13、10mol118.還原劑會(huì)影響這一反應(yīng)的進(jìn)行*在微堿性（pH7.2）溶液中，有過(guò)氧化酶存在，H2O2會(huì)氧化二乙酰二氯二氫熒光素為強(qiáng)熒光的化合物，用于測(cè)定210-11-310-10mol/ml *熒光素-乙酸汞在堿性溶液中具有熒光，ex/em=499nm/520nm，加入S2-后，熒光減弱，可測(cè)定微量硫*四氯熒光素汞化合物也用于測(cè)定硫化物 測(cè)定某些有機(jī)物、藥物等的熒光試劑 蒽酮測(cè)定丙三醇ex/em488nm/575nm，測(cè)定10-75g 丙三醇在濃H2SO4中脫水成丙烯醛 OOCHCHCH2CH2CHCHOO+H SO24+O2+ H O2OHCHNNCHHO水楊醛與肼反應(yīng)生成的席夫堿水楊醛縮連氮 ，測(cè)定肼CCCCHOCHHOCH2OHOHOOHCCCCHOCHHOCH2OOOOHNNOOCHOHCH2OHNH2NH2-2H脫氫抗壞血酸與鄰苯二胺反應(yīng)生成具有藍(lán)色熒光的化合物，ex/em=350nm/430nm，可測(cè)定0.3pmol-10nmol/L的抗壞血酸 甲醛、乙酰丙