實驗三血清紅細胞制備

1、實驗三、實驗動物的采血方法、實驗三、實驗動物的采血方法、動物血清及紅細胞的制備方法動物血清及紅細胞的制備方法指導老師：程指導老師：程 燕燕實驗目的1、學習實驗動物不同部位的取無菌采、學習實驗動物不同部位的取無菌采血方法；血方法；2、學習動物血清、紅細胞的制備；、學習動物血清、紅細胞的制備；3、觀察兔、豚鼠的免疫器官、觀察兔、豚鼠的免疫器官。實驗原理 免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫組織、免疫細胞和免疫分子組成。免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫組織、免疫細胞和免疫分子組成。 免疫細胞免疫細胞 1. 1.固有免疫的組成細胞：吞噬細胞、淋巴器官、樹突狀細胞、固有免疫的組成細胞：吞噬細胞、淋巴器官、樹突狀細胞、NKN

2、K細胞、細胞、NKTNKT細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞；細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞； 2. 2.適應性免疫應答細胞：適應性免疫應答細胞：T T細胞、細胞、B B細胞細胞 免疫分子免疫分子 1. 1.膜型分子：膜型分子：TCRTCR、BCRBCR、CDCD分子、粘附分子、分子、粘附分子、MHCMHC分子、細胞分子、細胞因子受體。因子受體。 2. 2.分泌型分子：免疫球蛋白、補體、細胞因子。分泌型分子：免疫球蛋白、補體、細胞因子。實驗原理 血液是一種結締組織（細胞間質）。血液系統(tǒng)是各種重要的血液是一種結締組織（細胞間質）。血液系統(tǒng)是各種重要的免疫細胞、免疫分子的載體，也是各種免疫事件發(fā)生

3、的場所。免疫細胞、免疫分子的載體，也是各種免疫事件發(fā)生的場所。 組成：組成：1 1、血漿、血漿 血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原）血漿蛋白（白蛋白、球蛋白、纖維蛋白原） 脂蛋白、無機鹽、氧等成分脂蛋白、無機鹽、氧等成分 激素、酶、抗體激素、酶、抗體 細胞代謝產(chǎn)物等。細胞代謝產(chǎn)物等。 2 2、血細胞、血細胞 紅血球、紅血球、 白血球（有粒白細胞：中性粒白血球（有粒白細胞：中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞和無粒白細胞：單核細胞和細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞和無粒白細胞：單核細胞和淋巴細胞淋巴細胞) ) 血小板血小板實驗原理 實驗研究中，要采集實驗動物的血液進行檢查或實驗研究中，要采集

4、實驗動物的血液進行檢查或分析，故必須掌握血液的正確采集、分離和保存分析，故必須掌握血液的正確采集、分離和保存的操作技術。的操作技術。 采血方法的選擇，主要決定于實驗的目的所需血采血方法的選擇，主要決定于實驗的目的所需血量以及動物種類。量以及動物種類。 用血量較少可刺破組織取毛細血管的血用血量較少可刺破組織取毛細血管的血 當需血量較多時可作靜脈采血當需血量較多時可作靜脈采血（原則：靜脈采血時，若需反復多次，應自遠離心（原則：靜脈采血時，若需反復多次，應自遠離心臟端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈臟端開始，以免發(fā)生栓塞而影響整條靜脈) )實驗原理 現(xiàn)將采用血方法按動物和部位分別加以介紹?，F(xiàn)將采用血

5、方法按動物和部位分別加以介紹。 小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾靜脈穿刺采血、小鼠和大鼠采血方法：割尾采血法、尾靜脈穿刺采血、眼眶后靜脈叢采血、摘眼球法、斷頭采血、頸（股）動眼眶后靜脈叢采血、摘眼球法、斷頭采血、頸（股）動靜脈采血靜脈采血 豚鼠采血法：耳緣剪口采血豚鼠采血法：耳緣剪口采血 、心臟采血、心臟采血 、股動脈采、股動脈采血血 、背中足靜脈取血、背中足靜脈取血 兔采血法：耳靜脈采血兔采血法：耳靜脈采血 、耳中央動脈采血、耳中央動脈采血 、心臟取、心臟取血血 、后肢脛部皮下靜脈取血、后肢脛部皮下靜脈取血 、股動靜脈、頸動靜脈取、股動靜脈、頸動靜脈取血血 、 雞采血法雞采血法 ：翼根靜脈

6、采血、心臟采血、頸靜脈采血：翼根靜脈采血、心臟采血、頸靜脈采血實驗原理家兔采血方法家兔采血方法 （1 1）耳緣靜脈采血：）耳緣靜脈采血： 家兔固定，將耳緣靜脈皮膚上的毛拔去或剪去，家兔固定，將耳緣靜脈皮膚上的毛拔去或剪去，75%75%酒精消毒，酒精消毒，用左手食指和中指夾住靜脈近心端，以使其血管怒張拇指和小指用左手食指和中指夾住靜脈近心端，以使其血管怒張拇指和小指夾住耳緣部分，以左手無名指和小指放在耳下作墊，待靜脈充盈夾住耳緣部分，以左手無名指和小指放在耳下作墊，待靜脈充盈后，右手持注射器使針頭由靜脈末端刺入，順血管方向向心端刺后，右手持注射器使針頭由靜脈末端刺入，順血管方向向心端刺約約1-1

7、.5cm1-1.5cm，放松左手拇指和食指對血管的壓迫，右手緩慢抽吸，放松左手拇指和食指對血管的壓迫，右手緩慢抽吸注射器，若注射阻力較大，說明針頭沒有刺入靜脈，應調(diào)整針頭注射器，若注射阻力較大，說明針頭沒有刺入靜脈，應調(diào)整針頭或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，讓血自然流出，滴或重新穿刺；也可以刀片在血管上切一小口，讓血自然流出，滴入盛器內(nèi)，采血完畢，用干棉球按壓止血。入盛器內(nèi)，采血完畢，用干棉球按壓止血。（2 2）兔心臟穿刺取血：）兔心臟穿刺取血： 家兔背位固定，在左胸第家兔背位固定，在左胸第2 24 4肋間剪毛一塊，用肋間剪毛一塊，用75%75%酒精和碘伏消毒。然后用酒精和碘伏消毒。然

8、后用5 510ml10ml注射器，在胸骨左緣注射器，在胸骨左緣3-43-4肋間心尖搏動最明顯處作垂直穿刺。肋間心尖搏動最明顯處作垂直穿刺。 注意事項有：注意事項有：動作宜迅速，以縮短在心臟內(nèi)的留針時間和防止血液凝動作宜迅速，以縮短在心臟內(nèi)的留針時間和防止血液凝固；固；如針頭已進入心臟但抽不出血時，應將針頭稍微后退一如針頭已進入心臟但抽不出血時，應將針頭稍微后退一點。點。在胸腔內(nèi)針頭不應左右擺動以防止傷及心，肺、在胸腔內(nèi)針頭不應左右擺動以防止傷及心，肺、實驗原理豚鼠采血方法豚鼠采血方法 （1 1）背中足靜脈取血）背中足靜脈取血 固定動物，將動物腳背面用酒精消毒，找出背中固定動物，將動物腳背面用酒

9、精消毒，找出背中足靜脈后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右足靜脈后，以左手的拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手拿的注射針刺入靜脈。采血后，用紗布或脫脂棉壓手拿的注射針刺入靜脈。采血后，用紗布或脫脂棉壓迫止血。反復采血時，兩后肢交替使用。迫止血。反復采血時，兩后肢交替使用。 （2 2）心臟采血）心臟采血 通常在胸骨左緣的正中，選心跳最強的部位作穿刺。通常在胸骨左緣的正中，選心跳最強的部位作穿刺。針頭宜稍細長些，以免發(fā)生手術后穿刺孔出血，其操針頭宜稍細長些，以免發(fā)生手術后穿刺孔出血，其操作手法詳見兔心臟采血。作手法詳見兔心臟采血。實驗動物的采血量動物種類 最大安全采血量（ml） 最大致死采血量（m

10、l）小白鼠0.10.3大白鼠12豚鼠510家兔1040狗50300猴1560血清的制備血清的制備：不加抗凝劑血清的制備：不加抗凝劑 無菌靜脈采血無菌靜脈采血2ml2ml，3737自然凝固，待血清開始出現(xiàn)后，自然凝固，待血清開始出現(xiàn)后，放冰箱內(nèi)放冰箱內(nèi)1212小時或小時或2424小時，離心分離血清（小時，離心分離血清（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min），得到的上清液即為血清，小心將上清吸出），得到的上清液即為血清，小心將上清吸出（注意切勿吸出細胞成分）。（注意切勿吸出細胞成分）。血漿的制備：需加抗凝劑（抗凝劑：血液血漿的制備：需加抗凝劑（抗凝劑：血液 = 1= 1：9

11、9） 無菌靜脈采血無菌靜脈采血2ml2ml（注射器用抗凝劑潤洗），（注射器用抗凝劑潤洗），將血液將血液加加入到有抗凝劑的離心管中顛倒混勻，離心（入到有抗凝劑的離心管中顛倒混勻，離心（3000rpm3000rpm，5-10min5-10min）后所得的上清液即為血漿。）后所得的上清液即為血漿。注意：血清的保存可以在每注意：血清的保存可以在每50ml50ml血清中加血清中加1 1硫柳汞水溶硫柳汞水溶液液1ml1ml防腐。防腐。紅細胞及懸液制備標準紅細胞的制備：標準紅細胞的制備： 取全血取全血1ml1ml，加等滲鹽水，加等滲鹽水2 23ml3ml，充分搖勻離心沉淀，充分搖勻離心沉淀，棄去上清液，然后

12、再加生理鹽水棄去上清液，然后再加生理鹽水2 23ml 3ml 按上述方法洗按上述方法洗滌，共三次，離心去上清，余下的為壓積紅細胞。滌，共三次，離心去上清，余下的為壓積紅細胞。紅細胞懸液的制備：紅細胞懸液的制備： 2 2紅細胞懸液：壓積紅細胞紅細胞懸液：壓積紅細胞2 2滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水4ml 4ml 5 5紅細胞懸液：壓積紅細胞紅細胞懸液：壓積紅細胞5 5滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水4ml4ml 10 10紅細胞懸液：壓積紅細胞紅細胞懸液：壓積紅細胞5 5滴滴+ +新鮮等滲鹽水新鮮等滲鹽水2ml2ml注意：注意： 標準紅細胞鹽水懸液臨用前制備，最多存放標準紅細胞鹽水懸液臨

13、用前制備，最多存放3 3天，天，用用檸檬酸葡萄糖溶液（檸檬酸葡萄糖溶液（ACDACD）溶液保存最長可保存溶液保存最長可保存1 1周周實驗器材 實驗動物：豚鼠、兔實驗動物：豚鼠、兔 實驗試劑：血液抗凝劑（實驗試劑：血液抗凝劑（1:500u肝素鈉注射液）肝素鈉注射液） 生理鹽水生理鹽水 實驗器材：實驗器材：5ml注射器、注射器、 一次性離心管（一次性離心管（5、10、15ml規(guī)格）、規(guī)格）、 普通吸管、尖吸管、普通吸管、尖吸管、1ml刻度吸管刻度吸管 75%酒精棉球酒精棉球 水平離心機水平離心機實驗步驟1.1.用用7575酒精棉球消毒采血部位皮膚酒精棉球消毒采血部位皮膚2.2.用用5ml5ml注射器分別抽取豚鼠或兔靜脈血注射器分別抽取豚鼠或兔靜脈血2 2mlml 豚鼠采血法豚鼠采血法 ：背中足靜脈取血：背中足靜脈取血 心臟采血、心臟采血、 兔采血法：耳緣靜脈采血兔采血法：耳緣靜脈采血 心臟采血心臟采血 3.3.制備血清、紅細胞（如上述流程）制備血清、紅細胞（如上述流程）注意事項：1 1、采血部位需要進行消毒、采血部位需要進行消毒2 2、采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥；、采血用的注射器和試管必須保持清潔干燥；3 3、注意血清與血漿制備的區(qū)別：抗凝劑