植物組織培養(yǎng)教程李浚明學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1植物植物(zhw)組織培養(yǎng)教程組織培養(yǎng)教程 李浚明李浚明 第一頁(yè)，共69頁(yè)。一、培養(yǎng)基的組成和作用 培養(yǎng)基（medium）是植物組織培養(yǎng)的重要(zhngyo)材料，是外植體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，只有配制出適宜的培養(yǎng)基，才能使組織培養(yǎng)獲得成功。 通常植物組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基包括以下六大類成分，即礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、瓊脂以及其他附加物等。 培養(yǎng)基的主要指標(biāo)是營(yíng)養(yǎng)成分及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度。第1頁(yè)/共69頁(yè)第二頁(yè)，共69頁(yè)。（一）礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)： 礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)又稱無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)，是指植物(zhw)生長(zhǎng)發(fā)育所需要的各種化學(xué)元素。 第2頁(yè)/共69頁(yè)第三頁(yè)，共69頁(yè)。礦質(zhì)元素的生理(shngl)作

2、用：（1）組成各種化合物，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；（2）構(gòu)成特殊物質(zhì)，參與代謝；（3）維持離子平衡、膠體穩(wěn)定及電荷平衡等電化學(xué)作用；（4）影響形態(tài)發(fā)生和組織、器官的建成等。 第3頁(yè)/共69頁(yè)第四頁(yè)，共69頁(yè)。 根據(jù)植物對(duì)元素的吸收量，可以把植物必需元素分為大量元素和微量元素。 國(guó)際植物生理學(xué)會(huì)建議將植物所需濃度大于0.5 mmol/l的的元素稱為(chn wi)大量元素。低于0.5 mmol/l的元素稱為(chn wi)微量元素。 根據(jù)此規(guī)則大量元素種類包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。其中C、H、O為氣體元素，其余六種為礦質(zhì)元素，分別占植物干重的百分?jǐn)?shù)為18、10、70、0.3%、0.07、

3、0.3%、0.3 、0.07%、0.05。 微量元素包括Fe、B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、Cl等。第4頁(yè)/共69頁(yè)第五頁(yè)，共69頁(yè)。1、大量元素： 組織培養(yǎng)中，各種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)主要從培養(yǎng)基中獲得，N、P、K、Ca、Mg、S等6種大量元素依靠各種無(wú)機(jī)鹽提供。 不同植物種類和不同試驗(yàn)?zāi)康膶?duì)元素的使用量要求不同，需經(jīng)試驗(yàn)確定。 目前已選擇出多種培養(yǎng)基配方用于植物組織培養(yǎng)。其中以MS應(yīng)用最廣泛(gungfn)。 以MS為例6中礦質(zhì)元素分別由KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4.7H2O、CaCl2 . 2H2O提供。 第5頁(yè)/共69頁(yè)第六頁(yè)，共69頁(yè)。第6頁(yè)/共69頁(yè)第七頁(yè)，共69頁(yè)。

4、大量元素中的氮通常(tngchng)采用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮的形式被使用，但銨態(tài)氮濃度過(guò)高會(huì)對(duì)有些植物培養(yǎng)物造成傷害，不適宜使用過(guò)高的濃度。而常用MS培養(yǎng)基中既有硝態(tài)氮又有銨態(tài)氮。第7頁(yè)/共69頁(yè)第八頁(yè)，共69頁(yè)。2、微量元素： 植物組織的對(duì)其需要量極少，過(guò)多會(huì)產(chǎn)生毒害，如造成蛋白質(zhì)變性、酶系失活。代謝(dixi)障礙等。 各種微量元素均具有特定的生理功能，如硼與蛋白質(zhì)的合成及糖類的運(yùn)輸有關(guān)；銅能促進(jìn)離體根的形成；錳參與植物的光合作用和呼吸作用；鉬為氮素代謝(dixi)的重要元素。 第8頁(yè)/共69頁(yè)第九頁(yè)，共69頁(yè)。第9頁(yè)/共69頁(yè)第十頁(yè)，共69頁(yè)。 微量元素中，鐵的用量較大，它對(duì)葉綠素的合成起重要

5、(zhngyo)作用，由于在較高pH下，F(xiàn)eCl3極易形成Fe（OH）3沉淀，難以被吸收，所以多用乙二胺四乙酸二鈉鹽與硫酸亞鐵形成的螯合物，并且單獨(dú)配制。第10頁(yè)/共69頁(yè)第十一頁(yè)，共69頁(yè)。第11頁(yè)/共69頁(yè)第十二頁(yè)，共69頁(yè)。（二）有機(jī)成分： 主要包括各種維生素和氨基酸，如硫胺素（VB1）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、泛酸(fn sun)鈣（VB5）、生物素、鈷胺素（VB12）、葉酸等以及甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰氨、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰氨、丙氨酸等。有時(shí)添加水解乳蛋白或水解酪蛋白，為牛乳經(jīng)酶法加工的水解產(chǎn)物，含有20種氨基酸的混合物，用量101000mg/L, 通常用于原生質(zhì)體等培

6、養(yǎng)。 此外肌醇是另外一種重要的有機(jī)成分，又叫環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起重要作用，此外還參與磷脂代謝及維持離子平衡等生理作用。第12頁(yè)/共69頁(yè)第十三頁(yè)，共69頁(yè)。第13頁(yè)/共69頁(yè)第十四頁(yè)，共69頁(yè)。（三）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)： 植物激素是植物新稱代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的用量直接(zhji)影響植物細(xì)胞的分化、分裂以及發(fā)育，影響植物的形態(tài)建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、衰老脫落、休眠、萌發(fā)等生理活動(dòng)。 在植物組織培養(yǎng)中，主要通過(guò)植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)離體的組織、器官的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行調(diào)控。包括誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、愈傷組織的生長(zhǎng)、根芽的分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生等。 第14頁(yè)/共69頁(yè)第十五頁(yè)，共69頁(yè)。

7、 常用(chn yn)的植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物涉及五大類植物激素：1、生長(zhǎng)素類：IAA、IBA、NAA、2，4-D2、細(xì)胞分裂類：6-BA、KT（Kin）、ZT、2ip3、赤霉素類：GA3、GA4、GA74、脫落酸：ABA5、乙烯：ETH第15頁(yè)/共69頁(yè)第十六頁(yè)，共69頁(yè)。第16頁(yè)/共69頁(yè)第十七頁(yè)，共69頁(yè)。1、生長(zhǎng)素類： 主要促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)形成愈傷組織(zzh)，促進(jìn)生根。 常用的有NAA、IAA、IBA、2，4D等。第17頁(yè)/共69頁(yè)第十八頁(yè)，共69頁(yè)。第18頁(yè)/共69頁(yè)第十九頁(yè)，共69頁(yè)。2、細(xì)胞分裂素類： 促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，促進(jìn)莖增促，抑制莖伸長(zhǎng)；誘導(dǎo)芽的分化、促

8、進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)；延緩衰老(shuilo)。 常用細(xì)胞分裂素有BA、KIN、ZT、2ip等。第19頁(yè)/共69頁(yè)第二十頁(yè)，共69頁(yè)。第20頁(yè)/共69頁(yè)第二十一頁(yè)，共69頁(yè)。第21頁(yè)/共69頁(yè)第二十二頁(yè)，共69頁(yè)。 此外近年來(lái)發(fā)現(xiàn)苯基(bn j)脲衍生物具有非常高的細(xì)胞分裂素活性，在多種植物上應(yīng)用。 如TDZ，CPPU，4PU等。第22頁(yè)/共69頁(yè)第二十三頁(yè)，共69頁(yè)。第23頁(yè)/共69頁(yè)第二十四頁(yè)，共69頁(yè)。3、赤霉素類： 主要具有誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長(zhǎng)，對(duì)根無(wú)效；對(duì)形成層細(xì)胞分化有影響，與生長(zhǎng)素協(xié)同作用；可以誘導(dǎo)離體成花；打破(d p)休眠等功能。 常用GA3、GA4等。第24頁(yè)/共69頁(yè)第二十五頁(yè)，共69

9、頁(yè)。第25頁(yè)/共69頁(yè)第二十六頁(yè)，共69頁(yè)。4、脫落酸（ABA）： 促進(jìn)休眠、衰老和脫落。組織培養(yǎng)中較少使用(shyng)，主要用于調(diào)節(jié)激素平衡，促進(jìn)形態(tài)建成。第26頁(yè)/共69頁(yè)第二十七頁(yè)，共69頁(yè)。第27頁(yè)/共69頁(yè)第二十八頁(yè)，共69頁(yè)。5、乙烯： 主要促進(jìn)衰老(shuilo)和脫落，高濃度易形態(tài)變化。第28頁(yè)/共69頁(yè)第二十九頁(yè)，共69頁(yè)。第29頁(yè)/共69頁(yè)第三十頁(yè)，共69頁(yè)。（四）碳源： 碳源主要為細(xì)胞提供合成新化合物的骨架，為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物與能源，此外還能維持一定的滲透壓。 常用的碳源主要是蔗糖，使用濃度在25，此外果糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物

10、組織培養(yǎng)。 糖濃度高低(god)直接影響形態(tài)建成。第30頁(yè)/共69頁(yè)第三十一頁(yè)，共69頁(yè)。（五）瓊脂： 瓊脂作為固化劑用于組織培養(yǎng)中，起支持植物的作用，不提供營(yíng)養(yǎng)，為海藻中提取的一種高分子化合物，僅溶于熱水(r shu)（90 oC以上），成為凝膠，冷卻后（40 oC以下）即凝固為凝膠。 瓊脂的用量通常在410g/L. 瓊脂是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中主要的成本支出，約占80。第31頁(yè)/共69頁(yè)第三十二頁(yè)，共69頁(yè)。 瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工工藝有關(guān)外，還受高壓滅菌(mi jn)時(shí)的溫度、時(shí)間以及pH影響。第32頁(yè)/共69頁(yè)第三十三頁(yè)，共69頁(yè)。（六）有機(jī)(yuj)附加物： 1、椰子汁： 用量

11、為100200g/L。 2、香蕉泥： 使用量為150200g/L。 3、蘋(píng)果汁、番茄汁等。第33頁(yè)/共69頁(yè)第三十四頁(yè)，共69頁(yè)。（七）其他(qt)成分： 1、活性炭： 使用量為0 .2-1%。 第34頁(yè)/共69頁(yè)第三十五頁(yè)，共69頁(yè)。2、抗生素： 常用(chn yn)青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在520mg/L。第35頁(yè)/共69頁(yè)第三十六頁(yè)，共69頁(yè)。3、抑制酚類物質(zhì)形成的物質(zhì)：（1）抗壞血酸： 可以加入培養(yǎng)基或浸泡(jnpo)處理外植體。（2）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）： 加入培養(yǎng)基中。第36頁(yè)/共69頁(yè)第三十七頁(yè)，共69頁(yè)。4、生長(zhǎng)(shngzhng)抑制劑： 常用矮壯素、比久（B9）

12、、多效唑（pp333） 、三碘苯甲酸、根皮酚等。第37頁(yè)/共69頁(yè)第三十八頁(yè)，共69頁(yè)。二、培養(yǎng)基的類型：1、高鹽濃度培養(yǎng)基：MS、B5、SH等。 適用于多數(shù)營(yíng)養(yǎng)需求量較大的植物。2、中等鹽濃度培養(yǎng)基：Nitsh、Miller等 大量(dling)元素濃度約為MS的1/2。3、低鹽培養(yǎng)基：WPM、 White等。 大量(dling)元素濃度約為MS的1/4左右。 適用于木本植物的培養(yǎng)。第38頁(yè)/共69頁(yè)第三十九頁(yè)，共69頁(yè)。表1MS培養(yǎng)基的組成配方組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)組成成分?jǐn)?shù)量(mg/l)NH4NO31650 Na2-EDTA37.3 KNO31900 FeSO47H2O 27.8 Ca

13、Cl22H2O 440 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 370 蔗糖 30 KH2PO4170 pH 5.8 KI0.83 肌醇 100.0 H3BO36.2 煙酸 0.5 MnSO44H2O22.3 鹽酸吡哆醇 0.5 ZnSO47H2O8.6 甘氨酸 2.0 Na2MoO42H2O0.25 鹽酸硫銨等 0.4 CoCl26H2O0.025 第39頁(yè)/共69頁(yè)第四十頁(yè)，共69頁(yè)。表2B5培養(yǎng)基的組成和配方組成成分 數(shù)量(mg/l） 組成成分 數(shù)量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O 27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 Mg

14、SO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇 100 H3BO4 3.0 煙酸 1.0 MnSO44H2O 10 鹽酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激動(dòng)素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025 鹽酸硫銨 10 Na2-EDTA37.3 第40頁(yè)/共69頁(yè)第四十一頁(yè)，共69頁(yè)。 表3 N6培養(yǎng)基的組成(z chn)和配方組成成分 數(shù)量(mg/l)組成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO4

15、7H2O 185 蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 煙酸 0.5 KI 0.8 鹽酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 鹽酸硫銨 1.0 ZnSO47H2O1.5 第41頁(yè)/共69頁(yè)第四十二頁(yè)，共69頁(yè)。第42頁(yè)/共69頁(yè)第四十三頁(yè)，共69頁(yè)。第43頁(yè)/共69頁(yè)第四十四頁(yè)，共69頁(yè)。第44頁(yè)/共69頁(yè)第四十五頁(yè)，共69頁(yè)。第45頁(yè)/共69頁(yè)第四十六頁(yè)，共69頁(yè)。第46頁(yè)/共69頁(yè)第四十七頁(yè)，共69頁(yè)。第47頁(yè)/共69頁(yè)第四十八頁(yè)，共69頁(yè)。第48頁(yè)/共69頁(yè)第四十九頁(yè)，共69頁(yè)。第49頁(yè)/共69頁(yè)第五十頁(yè)，共

16、69頁(yè)。第50頁(yè)/共69頁(yè)第五十一頁(yè)，共69頁(yè)。第51頁(yè)/共69頁(yè)第五十二頁(yè)，共69頁(yè)。三、培養(yǎng)基母液及激素母液的配制： 由于培養(yǎng)基中元素種類多，用量少，因此每次稱量繁瑣，因此通常將各種營(yíng)養(yǎng)成分配制成母液保存，配制培養(yǎng)基時(shí)根據(jù)需要量取用，從而簡(jiǎn)化操作，節(jié)省時(shí)間。 營(yíng)養(yǎng)元素母液根據(jù)其性質(zhì)和反應(yīng)特性混合。 激素母液 根據(jù)使用(shyng)濃度配制。 第52頁(yè)/共69頁(yè)第五十三頁(yè)，共69頁(yè)。1、器皿和用具的準(zhǔn)備 儀器(yq)包括萬(wàn)分之一天平，百分之一天平，pH計(jì) 用品包括不同型號(hào)的燒杯（2000ml、1000ml、100ml），容量瓶（1000ml、500ml、100ml）、移液管（10ml、5ml

17、、2ml、1ml）、試劑瓶若干（1000ml、250ml）、移液器（1000ul、200ul）滴灌、玻璃棒、試管、各種規(guī)格三角瓶（150ml、100ml、50ml）、培養(yǎng)基分裝器，漏斗、稱量紙、標(biāo)簽紙、不同范圍pH試紙、鉛筆等。 玻璃器皿用前清洗干凈。 第53頁(yè)/共69頁(yè)第五十四頁(yè)，共69頁(yè)。2、藥品(yopn)及蒸餾水準(zhǔn)備： 藥品(yopn)采用分析純或化學(xué)純?cè)噭?水利用蒸餾水或去離子水。第54頁(yè)/共69頁(yè)第五十五頁(yè)，共69頁(yè)。3、母液配制： （1）配制母液原則： 相同類型的試劑混合； 易形成沉淀的藥品分開(kāi)； 母液濃度要適宜； 用量要認(rèn)真計(jì)算和核對(duì)； 藥品要準(zhǔn)確(zhnqu)稱量。 第55

18、頁(yè)/共69頁(yè)第五十六頁(yè)，共69頁(yè)。 （2）MS培養(yǎng)基母液的配制： MS培養(yǎng)基母液根據(jù)試劑特性通常配成四種母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe鹽（100倍）、有機(jī)物（100倍）。 配置前先進(jìn)行根據(jù)培養(yǎng)基組成和配制體積計(jì)算母液試劑用量，然后稱取藥品(yopn)，大量元素可以用百分之一或千分之一天平，微量元素，鐵鹽和有機(jī)物用萬(wàn)分之一天平稱量。第56頁(yè)/共69頁(yè)第五十七頁(yè)，共69頁(yè)。第57頁(yè)/共69頁(yè)第五十八頁(yè)，共69頁(yè)。第58頁(yè)/共69頁(yè)第五十九頁(yè)，共69頁(yè)。（3）激素母液的配制： 根據(jù)各種激素的使用濃度配制適宜的母液，用萬(wàn)分之一天平稱取激素，溶劑溶解后加水定容。 生長(zhǎng)素類、赤霉素類及脫落酸等用95乙醇(y chn)溶解；細(xì)胞分裂素類用1N HCl或1N NaOH溶解。 通常激素母液濃度生長(zhǎng)素類為0.10.5 mg/ml, 細(xì)胞分裂素母液濃度為0.21.0 mg/ml.第59頁(yè)/共69頁(yè)第六十頁(yè)，共69頁(yè)。四、培養(yǎng)