骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)定向誘導(dǎo)分化與治療肝功能損傷的實(shí)驗(yàn)研究_圖文

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)定向誘導(dǎo)分化與治療肝功能損傷 的實(shí)驗(yàn)研究 1陸海華,滕皋軍,居勝紅,孫軍輝,李愛梅,張愛鳳東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院放射科,分子影像實(shí)驗(yàn)室 南京(210009E-mail :摘 要:目的 觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( Mesenchymal Stem Cells, MSCs 在肝臟特定微環(huán)境下是否 向具肝細(xì)胞表型與功能的細(xì)胞橫向分化 (transdifferentiation并探討其治療肝功能損傷的可行性。 方法 20只裸小鼠 , 隨機(jī)分為四組 , 每組 5只 :A組 : CCl4與橄欖油 1:1混合,按 1ml/kg腹腔注射, 每周兩次。一周后經(jīng)尾靜脈移植 1×106 G

2、FP陽性 MSCs ,術(shù)后繼續(xù)注射 CCl4,每周 2次; B 組: CCL4注射同 A 組,經(jīng)尾靜脈注入等量生理鹽水; C 組:正常小鼠,細(xì)胞移植同 A 組; D 組:正 常對(duì)照。術(shù)后 4 周處死全部受試動(dòng)物 , 血清檢測(cè)肝功能 , HE、 Masson 染色行組織學(xué)觀察,雙熒光 染色確認(rèn) GFP 陽性細(xì)胞并觀察其是否表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白。 結(jié)果 A 、 B 組受體肝纖維組織增 生顯示肝功能損傷模型制作成功,二組膠原分布百分比并無明顯差異(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t = -2.238, P >0.05 。 A 組鏡下可見 GFP 陽性細(xì)胞主要分

3、布于匯管區(qū) (portal area及小葉間隔周圍 , 部 分同時(shí)表達(dá)白蛋白(35±7% ;B 、 C 、 D 組鏡下均未見綠色熒光細(xì)胞。 A 組白蛋白水平明顯高于 B 組(24.4±3.3 vs. 18.6±2.9, P <0.05 ,兩組 ALT 水平亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (121.2±20.8 vs. 191.8±28.9, P<0.05。 結(jié)論 持續(xù)肝功能損傷可以有效誘導(dǎo) MSCs 向肝遷移增殖,部分 MSCs 在肝細(xì)胞持續(xù)損 傷的微環(huán)境下有向肝樣細(xì)胞 (hepatocyte-like cells橫向分化的潛能, MSCs移植可以

4、在一定程度上 修復(fù)受損肝功能。關(guān)鍵詞:間充質(zhì)干細(xì)胞 ; 移植 ; 肝功能損傷 ; 橫向分化與原位肝移植(orthotopic liver transplantation, OLT 相比,肝細(xì)胞移植(hepatocyte transplantation , HCT 操作簡單,費(fèi)用低廉,風(fēng)險(xiǎn)小。 HCT 不僅可以作為原位肝移植手術(shù)前的一 種過渡療法,在逆轉(zhuǎn)急性肝功能衰竭及治療代謝缺陷性肝病等方面也顯示了巨大的潛力。細(xì)胞來源是目前制約 HCT 臨床應(yīng)用的關(guān)鍵問題。 成年肝細(xì)胞植入受體后長期存活和增殖困難, 只能提供暫時(shí)的功能支持。胎肝細(xì)胞增殖能力旺盛,免疫源性低,耐受低溫儲(chǔ)存,但其來源受到限制。骨髓

5、源性肝干細(xì)胞(bone marrow-derived hepatocytestem cells,BDHSC 因其取材方便,自體來源無免疫排斥,能在體外擴(kuò)增并進(jìn)行基因修飾,在肝細(xì)胞移 植領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景本實(shí)驗(yàn)擬分離培養(yǎng)綠色熒光蛋白小鼠 (green fluorescent protein-expressingmouse,GFP-expressing mouse骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchyal stem cells,MSCs,植入經(jīng)四氯化碳 (carbon tetrachloride,CCl4 誘導(dǎo)肝功能損傷的裸小鼠體內(nèi) , 觀察移植細(xì)胞在受體肝組織內(nèi)分布、 增 殖與分化 , 及肝

6、功能恢復(fù)狀況 , 為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1. 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物:綠色熒光蛋白小鼠 , 遺傳背景 C57BL/6,本校分子遺傳中心提供,一月齡,體重 18-22g, 雌雄不限。 Balb/c裸小鼠,購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,鼠齡 5-6周,體重 20g 左右,雌雄不限, 飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)動(dòng)物房,室溫 25 ±2 ,無菌飼料與水自由飲用。1.1.2 主要試劑和儀器:DMEM 培養(yǎng)液(Dulbecco , s Modified Eagle, s Medium (美國 GIBCO 公司 , 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所 , Percoll 分離液(美國 Pha

7、rmarcia 公司 ,胰酶(Trypsin (美國 AMRESCO 公司 , 四氯化碳 (CCl4(上海試劑三廠 ,兔抗鼠白蛋白多克隆抗體 (丹麥 DAKO 公司,兔抗 GFP 多克隆抗體(美國 eBioscience 公司 ,Cy3標(biāo)記羊抗兔 IgG(美國 CALTAG LABORATORIES,Masson三色試劑盒 (福州邁新公司 。 CO 2培養(yǎng)箱(德國 HERABUS 公 司 ,熒光倒置相差顯微鏡與激光掃描共聚焦顯微鏡(德國 Zeiss 公司 , 冰凍切片機(jī)(德國 Leica 公 司 , 全自動(dòng)生化分析儀(美國 Beckman 公司 。1.2 方法1.2.1 GFP(green f

8、luorescent protein陽性 MSCs 分離、培養(yǎng)和傳代:斷頸處死綠色熒光蛋白小 鼠,無菌條件下取出股骨與脛骨, DMEM 培養(yǎng)液沖洗出骨髓,密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞,加 入含 10%胎牛血清的低糖 DMEM 培養(yǎng)液, 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至 1×106/ml, 接種于 25cm 2培養(yǎng)瓶內(nèi), 5 %CO 2、 37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 3天后首次換液,以后每隔 3-4天換液 1次,待貼壁細(xì)胞長滿至 80 %左右時(shí),以 0.25%胰蛋白酶消化, 1 2傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察 細(xì)胞。1.2.2. 小鼠肝功能損傷模型的制備與細(xì)胞移植:20只裸小鼠, 隨機(jī)分為

9、4組, 每組 5只。 A 組: CCl 4與橄欖油 1:1混合,按 1ml/kg腹腔注射,每周兩次。一周后經(jīng)尾靜脈以 27G 針頭注入第三 代 GFP 陽性 MSCs 懸液(200µl,約含 1×106個(gè)細(xì)胞 ,術(shù)后繼續(xù)注射 CCl 4,每周 2次; B 組:經(jīng)尾 靜脈注入等量生理鹽水, CCL 4注射同前; C 組:細(xì)胞移植同 A ,但手術(shù)前后未加任何藥物干預(yù); D 組:正常對(duì)照,未作任何處理。 。1.2.3 標(biāo)本準(zhǔn)備:術(shù)后四周, 受試小鼠戊巴比妥鈉麻醉, 后眼眶靜脈叢采血待測(cè)。 剪開胸腹腔, 經(jīng)左心室生理鹽水灌注沖洗血細(xì)胞直至肝臟發(fā)白, 再以 4%多聚甲醛灌注固定, 剪

10、取各葉肝組織制 成約 3mm 厚組織塊繼續(xù)浸泡于 4%多聚甲醛中固定 12小時(shí)。取部分組織塊石蠟包埋切片 , 余再用 30%蔗糖 PBS 溶液浸泡三天, PBS 洗滌后將組織用 OCT 包埋劑包埋, 置于液氮罐中 10-30秒凍結(jié) 成塊,冰凍切片機(jī)內(nèi)放置片刻切片(片厚 10µm 。1.2.4 HE染色:石蠟切片脫蠟水化, Harris 蘇木素染液染核, 1%鹽酸酒精分化數(shù)秒;再以伊 紅復(fù)染后逐級(jí)脫水、透明及封固。1.2.5 Masson染色:石蠟切片脫蠟水化,滴加 Masson 復(fù)合染色液 100µl,室溫 5分鐘;滴加 磷鉬酸溶液 100µl,室溫 5分鐘;滴加

11、苯胺藍(lán)溶液 100µl,室溫 5分鐘;蒸餾水輕輕沖洗后滴加分 化液分化 30-60秒,逐級(jí)脫水、透明及封固。光學(xué)顯微鏡下觀察照相, A 、 B 兩組各隨機(jī)選取 50個(gè)視野 (×400,利用 Simple PCI圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)算膠原分布百分比。1.2.6免疫熒光染色:冰凍切片常溫干燥 30min , PBS 洗, 2min×3次; 5%正常山羊血清封閉, 室溫, 10min ;傾去后一部分切片滴加兔抗 GFP 多克隆抗體, 1:500;其余滴加兔抗鼠白蛋白多 克隆抗體, 1:500; 4 過夜, PBS 洗, 2min×3次;弱光下滴加二抗(Cy3標(biāo)記

12、羊抗兔 IgG , 1: 100, 37 , 30min ; PBS 充分沖洗, 50%緩沖甘油封片,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察照相, 利用 Simple PCI圖像分析系統(tǒng)軟件計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。1.2.7 血清肝功能檢測(cè):主要指標(biāo)包括白蛋白 (Albumin,谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT ,谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST 。1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)用 SPSS11.5處理,結(jié)果以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 A 、 B 兩組膠原分布百分比 均數(shù)比較采用 Independent-Sample T Test;本實(shí)驗(yàn)中盡管每組僅有 5只動(dòng)物,但各組血清肝功能指 標(biāo)未出現(xiàn)明顯極端值, 且符合方差齊性要求, 故均數(shù)比較采

13、用 one-way ANOVO中的 SNK 法, P 0.05認(rèn)為有顯著性差異。2. 結(jié)果2.1 體外細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察原代培養(yǎng) 72小時(shí)后首次換液即可見到貼壁的紡錘狀細(xì)胞, 4天左右形成克隆。傳代后分布均 勻,密集生長的細(xì)胞兩極常有規(guī)律地排列成束狀,折光性強(qiáng)(圖 1a 。熒光鏡下觀察可見貼壁細(xì) 胞均發(fā)出明亮的綠色熒光,以胞核為著(圖 1b 。2.2 組織學(xué)觀察HE 染色 A 組鏡下沿匯管區(qū)或門靜脈小分支可見大量類圓形,胞質(zhì)少 , 核大而深染的細(xì)胞散在 或多個(gè)聚集呈克隆樣增生(圖 2a ,而 B 組鏡下此類細(xì)胞少見(圖 2b 。 C 、 D 組未有上述發(fā)現(xiàn)。 A 、 B 組 Masson 染色顯示

14、肝小葉大量纖維間隔形成,提示動(dòng)物模型制作成功。二組膠原分布 百分比并無明顯差異(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t =-2.238, P >0.05 (圖 3a 、 b 。2.3 雙免疫熒光染色含 GFP 細(xì)胞呈綠色熒光,抗 GFP 與抗鼠白蛋白間接免疫熒光染色陽性均呈紅色熒光,細(xì)胞同時(shí) 表達(dá)兩種熒光者,在激光掃描共聚焦顯微鏡下疊加呈現(xiàn)黃色熒光。 A 組鏡下可見:綠色熒光細(xì)胞主要 分布于匯管區(qū) (portal area及小葉間隔周圍,接近圓形,直徑 20µm左右,雙熒光標(biāo)記使移植細(xì)胞進(jìn)一 步得到確認(rèn)(圖 4a 、 b 、 c 。部分 GFP 陽

15、性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)白蛋白(圖 4d 、 e 、 f :隨機(jī)觀察 100個(gè) 視野 (×400,每個(gè)視野均以匯管區(qū)為中心 , 平均每個(gè)視野約見 11±3個(gè) GFP 陽性細(xì)胞 , 其中同時(shí)表達(dá)白蛋 白的比率為 35±7%。盡管 C 組與 A 組一樣移植了 GFP 陽性 MSCs ,但其鏡下所見與 B 、 D 組相似, 肝內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞存在(圖 4g 、 h 、 y 。2.4 血清肝功能檢測(cè)A 、 B 組受試小鼠血液生化指標(biāo)較之 D 組均有明顯改變 ( P < 0.05 。A 組白蛋白水平明顯高于 B 組(P <0.05 ,兩組 ALT 水平亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

16、(P <0.05 ,而 AST 水平無明顯差異 (P>0.05.(詳見表 1 。3. 討論1999年 Petersen 1首先發(fā)現(xiàn):骨髓中存在肝細(xì)胞的前體細(xì)胞。 Lagasse 2等將成年骨髓細(xì)胞植入患 有先天性 I 型高酪氨酸血癥的 FAH 缺陷小鼠體內(nèi) , 受試小鼠生長狀況良好 , 肝臟生化功能基本恢復(fù) , 并 進(jìn)一步證明 :只有經(jīng)過嚴(yán)格篩選即 c-kit high Thy low Lin Sca-1+(KTLS的造血干細(xì)胞 (hematopoietic stem cells,HSCs 才能分化為肝細(xì)胞。 Avital 3的研究表明:從人和大鼠的骨髓中分離出的 2m -/Thy

17、-1+細(xì)胞 能夠穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞特異基因和功能。 Schwartz4則描述了骨髓中一種多能成體干胞 :MAPCs(muitipotent adult progenitor cells,經(jīng)成纖維細(xì)胞生長因子 -4(fibroblast growthfactor-4,FGF-4 和肝細(xì)胞生長因子 ( hepatocyte growth factor,HGF誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞的過程。也有 一些學(xué)者認(rèn)為所謂骨髓干細(xì)胞跨胚層向肝樣細(xì)胞的橫向分化 (transdifferentiation僅僅是細(xì)胞融合的 結(jié)果 5, 6。骨髓肝干 /祖細(xì)胞的起源究竟為何 ? 骨髓干細(xì)胞中哪一部分更能促進(jìn)肝組織再生從而更適合

18、未 來應(yīng)用于臨床 ? 最近的體內(nèi)外研究 7, 8, 9, 10似乎更傾向于間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchyal stem cells,MSCs。 Lee 8的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí) :經(jīng) HGF 與 oncostatin M相繼誘導(dǎo) 4周 ,MSCs 呈現(xiàn)典型的矩形肝細(xì)胞樣形態(tài) , 表 達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志性基因 , 隨后開始具備肝細(xì)胞功能 :包括白蛋白合成 , 糖原貯存 , 尿素分泌等 .Sato 10比較三種骨髓細(xì)胞 :hMSCs、 CD34+細(xì)胞、 非 -hMSCs/CD34-細(xì)胞異種肝內(nèi)直接移植結(jié)果 : MSCs顯示了更 強(qiáng)的肝細(xì)胞分化潛能。故本實(shí)驗(yàn)選擇 BMSC S 作為供體細(xì)胞。過去通過體外轉(zhuǎn)染報(bào)告

19、基因, Brdu ,核素或熒光染料標(biāo)記移植細(xì)胞應(yīng)用較多,但其標(biāo)記效率或 長期效應(yīng)難以確定。本實(shí)驗(yàn)供體選擇顯性遺傳的表達(dá)綠色熒光蛋白的小鼠,因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的報(bào) 告基因普遍存在,體外擴(kuò)增或體內(nèi)分化不會(huì)導(dǎo)致報(bào)告基因關(guān)閉,可以提供簡單、直觀、穩(wěn)定的標(biāo)記 細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)制備的肝損傷模型與文獻(xiàn)報(bào)告的方法 11相同,通過持續(xù)注射 CCl 4誘導(dǎo)肝硬化, Masson 染色顯示肝小葉大量纖維間隔形成, 提示動(dòng)物模型制作成功。 為了避免受體肝組織自發(fā)熒光的干擾, 我們做了二抗標(biāo)記 Cy3的抗 GFP 間接免疫熒光染色, GFP 與抗 GFP 雙熒光標(biāo)記進(jìn)一步確認(rèn)了移植 細(xì)胞的身份。本移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:移植細(xì)胞并

20、不見于健康小鼠肝內(nèi), 這一結(jié)果提示持續(xù)肝損傷刺激可能是 供體 MSCs 增殖分化的必要條件 ,Dabeva 12在一項(xiàng)胎肝細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了這一點(diǎn)。另一方面, 肝損傷引起的某些因子如 SDF1和 MMP9(matrix metalloprotease 的升高, 可能是 MSCs 向肝歸巢的 重要原因 13, 14。研究表明 (15 ,把人 MSCs 移植到處于發(fā)育階段的動(dòng)物模型體內(nèi)的接受環(huán)境后,在多種組織 中觀察到 MSCs 位點(diǎn)特異性的分化。因此,通過干細(xì)胞小生境(niche 提供的微環(huán)境信號(hào)可以從外 部控制干細(xì)胞分化趨勢(shì) 16, 17 。這一結(jié)果支持了這樣的觀點(diǎn):植入環(huán)境而非內(nèi)在的分化

21、程序,決定 了 MSCs 的分化趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞植入受體后 4周,肝內(nèi)約有三分之一的供體 MSCs 表達(dá) 白蛋白;從形態(tài)學(xué)看: GFP陽性細(xì)胞呈類圓形,直徑多在 20µm左右。而一般認(rèn)為 MSCs 體積小, 核漿比大, 根據(jù)我們的觀察, 其最大徑不會(huì)超過 10-15µm。 這一結(jié)果與 Lee 8等的體外觀察結(jié)果吻合: MSCs 向肝樣細(xì)胞分化的過程中也經(jīng)歷了形態(tài)的增大變化。那么為什么還有三份之二的移植細(xì)胞白 蛋白表達(dá)陰性呢?我們推測(cè)原因可能為:(1 . 植入 MSCs 的增殖分化并非同步,彼此處于不同的分 化階段,隨著觀察時(shí)間的延長,將有更多的 MSCs 分化為成熟

22、肝細(xì)胞; (2 . MSCs中真正具備肝細(xì) 胞分化潛能的只是其中的一個(gè)亞群; (3 . 從 MSCs轉(zhuǎn)化而來的肝細(xì)胞同樣受到了 CCl 4的損傷。具 體原因仍然有待進(jìn)一步研究。MSCs 會(huì)否轉(zhuǎn)化為肝內(nèi)其他類型細(xì)胞如肝星狀細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、 Kupffer 細(xì)胞呢? Sato 10否定了 這種可能性,本實(shí)驗(yàn)未作這方面的相關(guān)研究。雖然本實(shí)驗(yàn)未作相關(guān)檢測(cè),但我們推測(cè):MSCs 作為 潛在的肝干細(xì)胞,也有可能轉(zhuǎn)化為膽管細(xì)胞,本課題組的前期研究已證明:大鼠胎肝干細(xì)胞 CK-19表達(dá)陽性 (18 。肝功能檢測(cè)結(jié)果表明:雖然與健康裸鼠相比各指標(biāo)值仍有差異,但在 CCL 4注射相同的情形下, 細(xì)胞移植組術(shù)后

23、4周的血清白蛋白及 ALT 水平明顯好于未行細(xì)胞移植組, 這證明了干細(xì)胞移植的作 用。但是,由于移植細(xì)胞在受體肝組織中所占比例極少(粗略估計(jì)僅在 5%左右 ,其作用機(jī)制不能 僅僅歸因于供體 MSCs 本身轉(zhuǎn)化為肝樣細(xì)胞后發(fā)揮的作用,可能還有其它因素的作用,例如是否通 過某些機(jī)制促進(jìn)了受體肝干 /祖細(xì)胞的招募、活化及分裂和 /或患肝殘存肝細(xì)胞的增殖。本課題組前 期所做的同種異體成年大鼠肝細(xì)胞經(jīng)腹腔移植治療急性肝衰的實(shí)驗(yàn)也提示:盡管植入肝細(xì)胞短期內(nèi) 即遭免疫排斥,仍然顯著提高了實(shí)驗(yàn)組的生存率,免疫組化揭示肝卵圓 細(xì)胞大量增生(甘向陽, 滕皋軍等,待發(fā)表 。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道 (19 :在 CCl 4注

24、射后立即行細(xì)胞移植,可以減輕肝纖維化程度。但是,本實(shí)驗(yàn) Masson 染色顯示 MSCs 移植并不能明顯改善持續(xù) CCl 4注射所致的肝纖維化,提示肝星狀細(xì)胞一旦 大量活化,肝纖維化過程難以逆轉(zhuǎn)令我們感到困惑和難以解釋的現(xiàn)象是:HE 染色片中, A 組沿匯管區(qū)出現(xiàn)的大量異形細(xì)胞,我們?cè)詾槭墙?jīng)過增殖的供體 MSCs ,但卻與綠色熒光細(xì)胞不完全符合,而且未行細(xì)胞移植的 B 組也 可見到類似細(xì)胞, 但較為稀少。 正常裸鼠則未有上述現(xiàn)象。 我們難以解釋這一現(xiàn)象, 勉強(qiáng)的解釋是:受體自身的骨髓干細(xì)胞在持續(xù)肝損傷刺激下遷移至匯管區(qū)周圍增殖分化,供體 MSCs 有促進(jìn)這種遷 移即 “ 召喚 ” 的作用。作

25、為一種潛在的新的肝干細(xì)胞來源, MSCs 的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的:可自體獲取,避免了免疫排 斥問題; 體外擴(kuò)增容易和黏附貼壁性強(qiáng), 在 3個(gè) /cm2下, 經(jīng)過兩周 MSC 可以擴(kuò)增 600倍 (20 。 巨大的增 殖性是應(yīng)用其進(jìn)行細(xì)胞治療的基礎(chǔ),而良好的貼壁性則有利于細(xì)胞的分離純化。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果 初步證實(shí):持續(xù)肝功能損傷可以有效誘導(dǎo) MSCs 向肝遷移增殖,部分 MSCs 在肝細(xì)胞持續(xù)損傷的微環(huán) 境下有向肝樣細(xì)胞 (hepatocyte-like cells橫向分化的潛能, MSCs移植可以在一定程度上修復(fù)受損肝 功能。目前仍然需要解決的問題是:MSCs 橫向分化與修復(fù)受損肝功能的具體機(jī)制;

26、未來臨床應(yīng)用的 安全性、適應(yīng)證以及臨床療效的評(píng)估,與其它治療方法的關(guān)系等。參考文獻(xiàn)1. Petrsen B E, Bowen W C, Patrene K D, et al. Bone marrow as a potential sourse of hepatic oval cellsJ.Science, 1999, 284: 1168-1170.2. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate intohepatocytes in vivo.Nat

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38、 Gao-jun, JU Sheng-hong,et al.Laboratory of Molecular Imaging, Department of Radiology, Zhong Da Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, ChinaAbstractObjective To observe whether bone mesenchymal stem cells (MSCs have the potential to transdifferentiate into functional hepatocyte-like cells

39、in the special “niche” as well as the therapeutic feasibility to repair damaged liver. Methods 20 nude mice were randomly divided into four groups (n=5 in each group: Group A:. 1.0mL/kg of carbon tetrachloride(CCl4 (dessolved in olive oil by ratio of 1:1 was injected into the peritoneum of mice twic

40、e a week for 5 weeks. GFP-positive MSCs(1×106cells were injected into the caudal tail vein 1 week after the first dose of CCl 4;Group B: treated with CCl4 as in A,but received the same volume of saline; Group C:normal nude mice with GFP-positive MSCs Transplanted in the same way as in A. Group

41、D: normal controls.4 weeks after the cell transplantation,all animal subjects were killed. Liver function tests (LFT , histologyof HE and Masson stainingas well as double immunofluorescent staining for GFP and albumin were studied in all groups. Results The hepatic fibrosis in group A & B confir

42、med the success of model for liver damage and there was no marked difference in the percent of the area occupied by collagen between two groups(10.5±1.5 vs. 12.7±1.6, t =-2.238, P >0.05 . GFP-positive MSCs were mainly observed around portal area or interspace of lobules in group A. Some of GFP-positive cells also express albumin(35±7% .While in group B,C or D,there is no such findings. The level of serum albuminin group A wa