第11章 DNA文庫的構(gòu)建和目標基因的篩選

1、洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程基因文庫基因文庫(gene library)： 指某一生物分離的全部基因的集合。指某一生物分離的全部基因的集合。基因組基因組DNA文庫：文庫： 指將是指某個生物的基因組指將是指某個生物的基因組DNAD

2、NA與適當?shù)妮d體在體外重與適當?shù)妮d體在體外重組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過篩選后得到大量的陽性菌落組后，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過篩選后得到大量的陽性菌落( (或或噬菌體噬菌體) )，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫。cDNA文庫：文庫： 指某生物某一發(fā)育時期、某一組織或某種環(huán)境條件下所指某生物某一發(fā)育時期、某一組織或某種環(huán)境條件下所轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與載體連接轉(zhuǎn)化受片段與載體連接轉(zhuǎn)化受體細胞而形成的克隆的集合。體細胞而形成的克隆的集合。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工

3、程程噬噬菌菌斑斑菌菌落落洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建第二節(jié)第二節(jié) cDNAcDNA基因文庫的構(gòu)建基因文庫的構(gòu)建第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略第四節(jié)第四節(jié) DNADNA文庫的保存文庫的保存 洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程8第一節(jié)第一節(jié) 基因組基因組DNADNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建一、基因組一、基因組DNA文庫的類型文庫的類型1、質(zhì)粒文庫：、質(zhì)粒文庫：容納片段小于容納片段小于10kb，以菌落的形式保存和篩選，以菌落的形式

4、保存和篩選，一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。一般用于對大片段文庫的亞克隆，用于鳥槍法測序等。2、噬菌體文庫：、噬菌體文庫：一般用一般用噬菌體載體，插入型容納片段小于噬菌體載體，插入型容納片段小于7kb，適合于構(gòu)建，適合于構(gòu)建cDNA文庫，置換型容納文庫，置換型容納9-25kb，適合于，適合于構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。構(gòu)建亞克隆文庫或直接構(gòu)建基因組文庫。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程95、亞基因組文庫：、亞基因組文庫：文庫的對象只是基因組的一部分，可用染文庫的對象只是基因組的一部分，可用染色體顯微切割、特定色體顯微切割、

5、特定YAC富集等方法而產(chǎn)生，用于針對特定富集等方法而產(chǎn)生，用于針對特定目標基因?qū)Υ笃挝膸斓纳钊胙芯俊Ｄ繕嘶驅(qū)Υ笃挝膸斓纳钊胙芯俊?、人工染色體文庫：、人工染色體文庫：BAC、YAC、PAC等文庫，最大插入片等文庫，最大插入片段分別為段分別為300kb、1000kb和和150kb，是大片段文庫，主要用，是大片段文庫，主要用于基因組測序和圖譜構(gòu)建。于基因組測序和圖譜構(gòu)建。6、基因組文庫的發(fā)展：略、基因組文庫的發(fā)展：略3、粘粒文庫：、粘粒文庫：一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段一般用于直接構(gòu)建基因組文庫，最長插入片段比比噬菌體文庫略長，達噬菌體文庫略長，達45kb左右。左右。洛陽洛陽師范

6、師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程10二、文庫的代表性和隨機性二、文庫的代表性和隨機性 為保證能從基因組文庫中篩選到某個特定的基因，基因為保證能從基因組文庫中篩選到某個特定的基因，基因組文庫必須有一定的代表性和隨機機。組文庫必須有一定的代表性和隨機機。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程11代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可片段重新組合起來可 以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。 代表性代表性意味著文

7、庫要有意味著文庫要有完備性，完備性，是指在構(gòu)建的基因文庫是指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率。中任一基因存在的概率。 它與基因文庫最低所含克隆數(shù)它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：之間的關(guān)系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )。P ： 任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率任一基因被克?。ɑ虼嬖谟诨蛭膸熘校┑母怕蔲 ：克隆片段的平均大小：克隆片段的平均大小 / 生物基因組的大小生物基因組的大小 。例：假如重組片段大小為例：假如重組片段大小為20kb，要使文庫包含該基因組任一片，要使文庫包含該基因組任一片段的概率達到段的概率達到99%，

8、則，則N(E. coli)=ln(1-0.99)/ln(1-20/4600)=1057N(人人)=ln(1-0.99)/ln(1-20/(3109)=6.9105洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程隨機性：隨機性： 既表示構(gòu)建文庫時要從基因組既表示構(gòu)建文庫時要從基因組DNA獲得隨機斷裂的片段，獲得隨機斷裂的片段，也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。也表示構(gòu)建好的文庫中所有基因要有相等的篩選概率。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程基因文庫的質(zhì)量標準基因文庫的質(zhì)量標準 除了盡可能高的完備性外，一個

9、理想的基因文庫應(yīng)具備除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應(yīng)具備下下列條件列條件： 1 1、重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力；重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力； 2 2、載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克?。惠d體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆； 3 3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序和染色全步查；排序和染色全步查； 4 4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下進行亞克?。豢寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下進行亞克?。?5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失

10、真度小。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增和篩選，文庫繁殖后失真度小。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程 1基因組基因組DNA文庫的載體制備文庫的載體制備 載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備載體的好壞是影響連接成功與否的關(guān)鍵，載體的制備要求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。要求兩點，一是純度高；二是去磷酸化好。三、基因組三、基因組DNA文庫的構(gòu)建流程文庫的構(gòu)建流程 2高質(zhì)量大相對分子量基因組高質(zhì)量大相對分子量基因組DNA的提取和部分酶切的提取和部分酶切 構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對構(gòu)建不同大小插入片段的基因組文庫對DNA相對分子相對分子質(zhì)量

11、要求不同，一般所提取的質(zhì)量要求不同，一般所提取的DNA分子量至少應(yīng)該是文庫分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片段長度的最終平均插入片段長度的35倍。倍。 洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程 3外源外源DNA的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染 一般在構(gòu)建大片段基因組一般在構(gòu)建大片段基因組DNA文庫時，大量連文庫時，大量連接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。接前都要先使用小體系連接來尋找最適的比例。在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細胞和最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價高效率高的感受態(tài)細胞和

12、最佳的轉(zhuǎn)化條件或效價高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白。且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程5、文庫的質(zhì)量檢測、文庫的質(zhì)量檢測 克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高克隆子數(shù)目要足夠多，覆蓋度要足夠高(4-6倍或更高倍或更高)。 覆蓋倍數(shù)覆蓋倍數(shù) = 平均插入片段長度平均插入片段長度 克隆數(shù)克隆數(shù) / 基因組基因組DNA的的長度。長度。 或：或： 覆蓋倍數(shù)覆蓋倍數(shù)=所有探針篩選到的陽性克隆子數(shù)所有探針篩選到的陽性克隆子數(shù) / 總探針數(shù)。總探針數(shù)。 另外，植物基因組文庫中葉綠體另外，植物基因組文庫中葉綠體DNA的比例：小于的比例：小于5%。洛陽洛

13、陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程一、一、cDNAcDNA文庫的特征文庫的特征1 1、基因特異性：基因特異性： 1 1）cDNAcDNA只含有對應(yīng)于成熟只含有對應(yīng)于成熟mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動子、終止的轉(zhuǎn)錄區(qū)，不含啟動子、終止子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。子、內(nèi)含子、基因間隔區(qū)等。 2 2）cDNAcDNA一般較短，平均長度一般較短，平均長度1.5kb1.5kb左右，多數(shù)為左右，多數(shù)為100bp100bp至至10kb10kb。2 2、器官特異性器官特異性3、代謝或發(fā)育特異性、代謝或發(fā)育特異性4、表達量不均勻性、表達量不均勻性洛陽洛陽師范師范學院學院

14、生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程二、二、cDNAcDNA文庫的構(gòu)建步驟文庫的構(gòu)建步驟： 1、細胞總、細胞總RNA的提取和的提取和mRNA分離；分離；2、第一鏈、第一鏈cDNA合成；合成；3、第二鏈、第二鏈cDNA合成；合成；3、雙鏈、雙鏈cDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導入克隆進質(zhì)粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖。宿主中繁殖。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程cDNA文庫構(gòu)建流程圖文庫構(gòu)建流程圖洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程1 1、RNARNA的分離的分離 mRNAmRNA是構(gòu)

15、建是構(gòu)建cDNAcDNA文庫文庫的起始材料。由于的起始材料。由于mRNAmRNA在在總總RNARNA中所占比例很小，因中所占比例很小，因此從總此從總RNARNA中中富集富集mRNAmRNA是構(gòu)是構(gòu)建建cDNAcDNA文庫的一個重要步文庫的一個重要步驟。通過降低驟。通過降低rRNArRNA和和tRNAtRNA含量，可大大提高篩選到含量，可大大提高篩選到目的基因的可能性。目的基因的可能性。利用利用Poly(APoly(A) )尾巴純化或直接提尾巴純化或直接提取取mRNAmRNA。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程2 2、第一鏈、第一鏈cDNAcDNA的

16、合成的合成 由由mRNAmRNA到到cDNAcDNA的過程稱為的過程稱為反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄，由，由反反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶催化。催化。反轉(zhuǎn)錄酶：反轉(zhuǎn)錄酶： AMVAMV和和Mo-MLVMo-MLV。合成合成DNADNA是需要引物引導：是需要引物引導： oligo(dToligo(dT) )引物；隨機引物。引物；隨機引物。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程2 2、第一鏈、第一鏈cDNAcDNA的合成的合成 由由mRNAmRNA到到cDNAcDNA的過程稱為的過程稱為反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄，由，由反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄酶錄酶催化。催化。反轉(zhuǎn)錄酶：反轉(zhuǎn)錄酶： AMVAMV和和Mo-MLVM

17、o-MLV。合成合成DNADNA是需要引物引導：是需要引物引導： oligo(dToligo(dT) )引物；隨機引物。引物；隨機引物。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程3 3、第二鏈、第二鏈cDNAcDNA的合成的合成 cDNAcDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-mRNA-cDNAcDNA雜交雙鏈變成互補雙鏈雜交雙鏈變成互補雙鏈cDNAcDNA的過程。的過程。 自身引導合成法自身引導合成法：置換合成法置換合成法：引導合成法引導合成法：引物引物- -銜接頭合成法：銜接頭合成法： 第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移

18、酶（第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈）在第一鏈 cDNA 的的 3-端加上一段端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的帶接頭序列的 Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補的）短核苷酸鏈作引物合成互補的 cDNA 鏈鏈 。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程244 4、雙鏈、雙鏈cDNAcDNA克隆進質(zhì)?；蚴删w載體并導入宿主中克隆進質(zhì)粒或噬菌體載體并導入宿主中繁殖繁殖 由于平端連接效率低，由于平端連接效率低，雙鏈雙鏈 cDNA 在和在和載體連接之前，要經(jīng)過一系列處理，如同聚物加尾、載體連接之前，

19、要經(jīng)過一系列處理，如同聚物加尾、加接頭和分級分離。加接頭和分級分離。 總總cDNAcDNA的分級分離的分級分離：采用排阻層析柱，去除過：采用排阻層析柱，去除過大和過小的大和過小的cDNAcDNA分子，保留分子，保留500bp500bp至至8kb8kb的總的總cDNAcDNA，以提高連接后文庫的質(zhì)量。以提高連接后文庫的質(zhì)量。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程25三、三、cDNAcDNA文庫的均一化處理文庫的均一化處理1 1、基因組、基因組DNADNA飽和雜交法飽和雜交法 mRNA mRNA水平上，基因之間豐度差異極大。水平上，基因之間豐度差異極大。

20、基因組水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大?；蚪M水平，基因之間拷貝數(shù)差異不大。 將隨機打斷的基因組總將隨機打斷的基因組總DNADNA片段標記為探針，與總片段標記為探針，與總cDNAcDNA單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總單鏈飽和雜交，棄除未雜交的總cDNAcDNA，從，從cDNAcDNA-DNA-DNA雜交體上雜交體上變性釋放除均一化后的總變性釋放除均一化后的總cDNAcDNA，轉(zhuǎn)化宿主。，轉(zhuǎn)化宿主。2 2、基于復性動力學、基于復性動力學(second-order kinetics)(second-order kinetics)原理的均一化處理原理的均一化處理 濃度大的濃度大的DNADNA復性所需時間短

21、，濃度越小復性越遲。復性所需時間短，濃度越小復性越遲。 控制復性時間，使高豐度控制復性時間，使高豐度cDNAcDNA呈雙鏈狀態(tài)，低豐度呈雙鏈狀態(tài)，低豐度cDNAcDNA呈單鏈狀態(tài)，利用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈呈單鏈狀態(tài)，利用羥基磷灰石柱將單鏈和雙鏈cDNAcDNA分開，保分開，保留單鏈留單鏈cDNAcDNA后轉(zhuǎn)化宿主。后轉(zhuǎn)化宿主。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程26四、扣除雜交四、扣除雜交cDNAcDNA文庫文庫 利用分子雜交原理，去除非差異表達基利用分子雜交原理，去除非差異表達基因的因的cDNA，保留差異表達的基因的，保留差異表達的基因的cDN

22、A用于制備文庫。用于制備文庫。tester: 待測樣本的總待測樣本的總cDNA。driver: 表達譜背景一致但不含目的基因的總表達譜背景一致但不含目的基因的總 cDNA。tester與過量的與過量的driver雜交，去除二者共同表雜交，去除二者共同表達的達的cDNA，保留差異表達基因。，保留差異表達基因。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程SSHSSH原理原理洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程2 2、mRNA-mRNA-cDNAcDNA雜交雜交： 過量的驅(qū)動總過量的驅(qū)動總mRNA（末端生物素標（末端生物

23、素標記）與總記）與總cDNA雜交，利用生物素磁珠法將雜交，利用生物素磁珠法將公共表達基因去除。公共表達基因去除。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程29五、全長五、全長cDNAcDNA文庫文庫 cDNA不完整的原因：不完整的原因：mRNA的降解、第二鏈合成中的降解、第二鏈合成中DNA聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶與聚合酶的外切核酶活性、反轉(zhuǎn)錄酶與mRNA模板的脫離模板的脫離(主要受主要受mRNA復雜結(jié)構(gòu)影響復雜結(jié)構(gòu)影響)。1 1、SMARTSMART全長全長cDNAcDNA文庫的構(gòu)建方法文庫的構(gòu)建方法 為為Clontech公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣

24、泛，其獨特公司的專利試劑盒原理，應(yīng)用廣泛，其獨特的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性， RTase自動在反轉(zhuǎn)錄得到自動在反轉(zhuǎn)錄得到的全長的全長cDNA第一鏈的第一鏈的3末端加上末端加上oligo(dC)，利用具，利用具oligo(dG)的接頭引導第二鏈的合成。由于的接頭引導第二鏈的合成。由于oligo(dC)比較短，比較短，因此較短的因此較短的oligo(dG)容易介導合成假全長容易介導合成假全長cDNA。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程SMART技術(shù)構(gòu)建全長技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫的原理文庫的原理洛陽洛陽師范師范學院學院生

25、命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程312 2、Cap-TrapperCap-Trapper法構(gòu)建全長法構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫文庫 在在mRNA的兩端均打上生物素標記，合成的兩端均打上生物素標記，合成cDNA第一第一鏈時用鏈時用dm5 CTP代替代替dCTP，用，用RNase消化單鏈消化單鏈RNA。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程3 3、 TAP法構(gòu)建全長法構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫文庫 Invitrogen公司的試劑盒公司的試劑盒原理，首先利用堿性磷酸酶處原理，首先利用堿性磷酸酶處理使非全長理使非全長mRNA無效化。用

26、無效化。用處理以移去全處理以移去全長長mRNA的帽子結(jié)構(gòu)，然后為的帽子結(jié)構(gòu)，然后為脫帽后的全長脫帽后的全長mRNA的的5末端末端接上人工接頭，利用具接上人工接頭，利用具oligo(dT)的人工接頭進行反的人工接頭進行反轉(zhuǎn)錄，得到的全長轉(zhuǎn)錄，得到的全長cDNA第一第一鏈的兩端就打上了特別設(shè)計的鏈的兩端就打上了特別設(shè)計的人工接頭，可用人工接頭，可用PCR法對全法對全長總長總cDNA進行放大，酶切后進行放大，酶切后與載體連接。與載體連接。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程33六、其它六、其它cDNAcDNA文庫文庫表達表達cDNAcDNA文庫：文庫： 用

27、表達載體構(gòu)建全長用表達載體構(gòu)建全長cDNAcDNA文庫，文庫的每一個克隆子可文庫，文庫的每一個克隆子可以表達出蛋白，利用蛋白對克隆子進行篩選。以表達出蛋白，利用蛋白對克隆子進行篩選。雙雜交全長雙雜交全長cDNAcDNA文庫：文庫： 將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿將表達文庫與酵母雙雜交系統(tǒng)結(jié)合使用，利用酵母作宿主，通過融合蛋白的酵母雙雜交對克隆子進行篩選，用于鑒主，通過融合蛋白的酵母雙雜交對克隆子進行篩選，用于鑒定可與特定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄因子定可與特定蛋白相互作用的基因，主要為轉(zhuǎn)錄因子。重組酶克隆策略的重組酶克隆策略的cDNAcDNA文庫：文庫： 將重組酶的特異識

28、別序列將重組酶的特異識別序列attP1attP1和和attP2attP2構(gòu)建到每個構(gòu)建到每個cDNAcDNA的兩端，在非消化情況下實現(xiàn)與載體的重組連接，避免了基的兩端，在非消化情況下實現(xiàn)與載體的重組連接，避免了基因被切斷。因被切斷。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程34第三節(jié)第三節(jié) 基因克隆的篩選策略基因克隆的篩選策略 大型基因組大型基因組文庫文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成，從其中篩選分離出某一個特定基因并組克隆組成，從其中篩選分離出某一個特定基因并不是件簡單的事。不是件簡單的事。一、表型篩選法一、表型篩選法 一

29、些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥一些具有特殊功能的蛋白質(zhì)編碼基因（如抗藥性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以賦予宿主特定性基因、結(jié)合蛋白編碼基因等）可以賦予宿主特定的表型，可以采用特殊的正選擇篩選的表型，可以采用特殊的正選擇篩選程序（如程序（如抗藥抗藥性篩選法性篩選法等）直接篩選，宿主多為突變體。等）直接篩選，宿主多為突變體。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程35二、雜交篩選和二、雜交篩選和PCR篩選篩選 1、雜交篩選、雜交篩選 洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程362、PCR篩選法：篩選法： 將文庫

30、貯存于多個將文庫貯存于多個96或或384孔板中，首先通過孔板中，首先通過PCR確定目標基因所在的特定確定目標基因所在的特定PCR板板(主混合池篩選主混合池篩選)，然，然后通過后通過PCR確定目標基因在確定目標基因在特定特定PCR板上的特定行和列板上的特定行和列(行混合池篩選和列混合池篩行混合池篩選和列混合池篩選選)，最后通過逐個克隆的，最后通過逐個克隆的PCR確定目標基因所對應(yīng)的確定目標基因所對應(yīng)的克隆子?？寺∽?。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程37三、免疫篩選三、免疫篩選 首先制備和純化得到目標基因的抗體，然后利用抗體來首先制備和純化得到目標基因的抗體，然后利用抗體來篩選目標基因所在的表達文庫，得到目標基因所對應(yīng)的克隆篩選目標基因所在的表達文庫，得到目標基因所對應(yīng)的克隆子。子。 方法有原位檢測和免疫沉淀檢測。方法有原位檢測和免疫沉淀檢測。洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程1、原位檢測法、原位檢測法濾濾膜（固定抗體）膜（固定抗體）+洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因因 工工 程程2、免疫沉淀檢測法、免疫沉淀檢測法菌落菌落沉淀素沉淀素洛陽洛陽師范師范學院學院生命科學系生命科學系 韓建明韓建明基基 因