DNA甲基化與癌癥

1、DNA甲基化與癌癥甲基化與癌癥2018.07.25 表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化 DNA甲基化的檢測手段 DNA甲基化與癌癥一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化基因型相同基因型相同現(xiàn)象現(xiàn)象1 1：一個(gè)生物體的不同組織基因表達(dá)模式截然不同一個(gè)生物體的不同組織基因表達(dá)模式截然不同表達(dá)模式迥異表達(dá)模式迥異現(xiàn)象2：同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。 現(xiàn)象現(xiàn)象3 3： 腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因的的DNADNA序列并不發(fā)生變化。序列并不發(fā)生變化?，F(xiàn)象現(xiàn)象4 4：橘生淮南則為橘，生于淮北則

2、為枳，葉徒相似，橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味其實(shí)味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他們出生在不同如果他們出生在不同的地方的地方基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 什么是表觀遺傳學(xué)？什么是表觀遺傳學(xué)？ 表觀遺傳學(xué)：表觀遺傳學(xué)： 基因序列無變化基因序列無變化 基因功能發(fā)生變化基因功能發(fā)生變化 可遺傳并且是可逆的可遺傳并且是可逆的 表觀遺傳學(xué)機(jī)制：表

3、觀遺傳學(xué)機(jī)制： DNADNA甲基化甲基化 組蛋白修飾組蛋白修飾 RNA RNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干擾，microRNA, long non-coding microRNA, long non-coding RNARNA等等) )表觀遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)/ /Epigenetics 基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組DNA序列不變的序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛或潛在的可遺傳性在

4、的可遺傳性)的變化。的變化。 定義定義Epigenetics - On or over the genetic information encoded in the DNA在細(xì)胞基因組上存在兩類信息：在細(xì)胞基因組上存在兩類信息： A- 遺傳學(xué)信息遺傳學(xué)信息 B- 表觀遺傳學(xué)信息表觀遺傳學(xué)信息前者前者維持細(xì)胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料維持細(xì)胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料后者后者怎么建、何時(shí)建、在哪建的附加信息怎么建、何時(shí)建、在哪建的附加信息基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以記載遺傳信息。記載遺傳信息。DNA sequence codin

5、gEpigenetic programming廣泛，多樣，廣泛，多樣，復(fù)雜復(fù)雜 DNA甲基化甲基化 染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑 RNARNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干擾， 非編碼非編碼RNA:microRNARNA:microRNA, , long non-coding RNA long non-coding RNA等等) )表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞命運(yùn)個(gè)體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺 傳調(diào)控基因選 擇表達(dá)表表 觀觀 遺遺 傳傳 學(xué)學(xué)基因表達(dá)前的調(diào)控：DNA甲基化、基因印記、染色質(zhì)重塑基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：ncRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖開關(guān)RNA蛋白翻譯后的修

6、飾：組蛋白的甲基化和乙?；⒎墙M蛋白的共價(jià)修飾DNA甲基化甲基化組蛋白翻譯后修飾組蛋白翻譯后修飾RNA機(jī)制機(jī)制甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移 到其他化合物的過程,可形成各種甲 基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核 酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化 的，這種甲基化涉及基因表達(dá)的調(diào) 控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核 酸(RNA)加工。甲甲 基基 化化DNA DNA 甲基化的概念及機(jī)理甲基化的概念及機(jī)理 1950年，年，Wyatt在在Nature上首次指出測序結(jié)果表明上首次指出測序結(jié)果表明DNA可能存在第可能存在第5堿基。堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移

7、酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAHDNMTs活性甲基化合物活性甲基化合物DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、 胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶 的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主 要發(fā)生在5-CpG-3的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，將一個(gè)甲基添加在DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化位點(diǎn)CpG島或富含島或富含

8、CpG島的區(qū)域島的區(qū)域CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持 或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCG

9、CC CCGCGCGACCCGCTGCpG島特征：A、CpG島主要位于基因的啟動子區(qū)，部分位 于基因的第一個(gè)外顯子區(qū)； B、CpG島甲基化可以直接導(dǎo)致相關(guān)基因的表 觀遺傳學(xué)沉默。高等生物基因組甲基化特點(diǎn)高等生物基因組甲基化特點(diǎn) 1）廣泛性）廣泛性 2）可遺傳性可遺傳性 3）可逆性）可逆性 4）組織特異性）組織特異性 CpG島島(CpG islands) 在結(jié)構(gòu)基因在結(jié)構(gòu)基因5端附近的調(diào)控區(qū)段，端附近的調(diào)控區(qū)段， CG二聯(lián)核苷常常二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。 預(yù)測軟件預(yù)測軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/

10、cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/可遺傳性可遺傳性DNA 修復(fù)修復(fù)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)癌基因代謝癌基因代謝 凋亡凋亡分化分化細(xì)胞周期細(xì)胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能DNA甲基化的生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)態(tài) DNA甲基化的生物學(xué)意義在于： A、基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控 B、保護(hù)基因組的穩(wěn)定性表現(xiàn)：基因在不同時(shí)期不同身體部位特異表達(dá)I.有些基因在發(fā)育早期甲基化II.發(fā)育晚期被誘導(dǎo)去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印記基因高甲基化Cp

11、G甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比CpG島的數(shù)目與基因密度相關(guān)人類基因組甲基化情況人類基因組甲基化情況1%- 2%的人類基因組是CpG群人類基因組CpG島約為28890個(gè) 平均值為每Mb含1 0.5個(gè)CpG島80%- 90%的CpG位點(diǎn)已被甲基化一、一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因因子子對對DNA元件元件的的識別識別與與結(jié)合結(jié)合序列特異性的甲基化DNA結(jié)合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙?；福℉DAC）， 形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄 因子與啟動子區(qū)靶序列的結(jié)合， 從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制沒有甲基化基因表達(dá)沒有甲基化基因表達(dá)基因啟動子區(qū)域基因啟動子區(qū)域

12、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)合不能結(jié)合不能結(jié)合甲基化基因不表達(dá)甲基化基因不表達(dá)甲基化甲基化二、二、序序列列特特異性異性的的甲甲基基化化DNA結(jié)結(jié)合合蛋蛋白與白與啟啟動動子子區(qū)甲區(qū)甲基基化化CpG島結(jié)島結(jié)合合，募募集組集組蛋蛋白白 去乙酰化去乙?；该福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)制復(fù)合合物物，阻，阻止轉(zhuǎn)止轉(zhuǎn)錄因子錄因子與與啟啟動動子區(qū)靶子區(qū)靶序序列列的的結(jié)結(jié) 合，從而影響基因的轉(zhuǎn)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制Sin3AMeCP2啟動子基因轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)啟動子基因基因不表達(dá)染色質(zhì)構(gòu)型的變化伴隨組蛋白的乙?；腿?乙?；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開關(guān)。DNA甲基化能引起染色

13、質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、 DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的 改變，從而控制基因表達(dá)。三、三、DNA甲基甲基化化通過通過改改變?nèi)咀內(nèi)旧|(zhì)結(jié)質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)抑制抑制基基因表因表達(dá)達(dá)DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制二、DNA甲基化的檢測手段亞硫酸氫鹽測序的原理亞硫酸氫鹽測序的原理1. 直接測序法直接測序法1. 直接測序法直接測序法 注： A：癌組織；B：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序克隆測序2. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序克隆測序3. 甲基化特異性甲基化特異性PCR 3

14、. 甲基化特異性甲基化特異性PCR U M U M U M ladder100150200250MSP法檢測抑癌基因法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化啟動子區(qū)的甲基化圖圖 MSP檢測組織切片檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，）結(jié)果，U為非甲基化，為非甲基化，M為甲基化。為甲基化。4. 結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法5. 基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法6. 基于親和純化的甲基化分析方法基于親和純化的甲基化分析方法三、DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥 DN

15、A甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，DNA甲基化改變包括高甲基化和去（低）甲基化。 對不同腫瘤細(xì)胞的DNA分析表明，癌變細(xì)胞中出現(xiàn)基因突變的概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細(xì)胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系 高甲基化抑癌基因沉默 低甲基化原癌基因被激活CpG島抑癌基因高甲基化抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處于高甲基化狀態(tài)，因而抑癌基因沉默，使得細(xì)胞脫離正常的細(xì)胞周期，進(jìn)入腫瘤發(fā)生過程。 原癌基因激活正常細(xì)胞中，由于甲基化作用原癌基因多處于沉默狀態(tài)，但在多種腫瘤細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)原癌基因處于低甲基化狀態(tài)

16、，并且低甲基化狀態(tài)與其蛋白表達(dá)升高密切相關(guān)，表明低甲基化狀態(tài)可使原癌基因激活。腫瘤細(xì)胞的特性： 現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征:1.逃避細(xì)胞死亡(resisting cell death)2.對生長抑制信號不敏感( evading growth suppressors )3.誘導(dǎo)新血管生成(inducing angiogenesis)4.無限的復(fù)制潛能(enablingreplicative immortality)5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移(activatinginvasion and metastasis)6.持續(xù)的增殖信號(sustainingproliferative signaling) 另

17、外，近年的研究又提出了新的兩點(diǎn):能量代謝的改變(reprogramming of energymetabolism)和逃避免疫系統(tǒng)的破壞(evading immune destruction)以上幾點(diǎn)在細(xì)胞發(fā)生癌變的過程中有著重要的意義.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮重要作用.1.逃避細(xì)胞死亡 通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號分子等刺激時(shí)會發(fā)生凋亡，但是癌細(xì)胞卻可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖. 例如，p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因，可以促使損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡.50%的癌癥中存在p53基因的突變失活. p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)容易因?yàn)槊摪被饔冒l(fā)生5

18、mC-T的轉(zhuǎn)換.同時(shí)，INK4a/ARF基因啟動子區(qū)域的甲基化可以使表達(dá)下降，導(dǎo)致原來受抑制的MDM2表達(dá)上升，MDM2進(jìn)而結(jié)合p53并使后者發(fā)生蛋白質(zhì)水平的降解，使細(xì)胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥2.對生長抑制信號不敏感 細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長的調(diào)控存在多種機(jī)制。 在丙肝病毒感染的肝細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因啟動子的甲基化，p16表達(dá)水平下降從而促進(jìn)了細(xì)胞的分裂，在丙肝誘導(dǎo)的肝癌中起著重要的作用DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥3.誘導(dǎo)新血管生成 新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管生成首先需要金屬蛋白

19、酶分解細(xì)胞外基質(zhì)，再通過血管內(nèi)皮生長因子來誘導(dǎo)血管生成。 組織金屬蛋白酶抑制劑可以抑制金屬蛋白酶的活性，同時(shí)與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合阻止血管生成。腫瘤細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制劑的下調(diào)有一部分原因是由于啟動子區(qū)域的甲基化引起的.血小管反應(yīng)蛋白（TSP1）是另一個(gè)抑制血管生成的蛋白，TSP1基因啟動子區(qū)域甲基化引起基因表達(dá)抑制，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成.DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥4.無限的復(fù)制潛能 癌細(xì)胞無限的復(fù)制潛能主要與端粒酶活性的升高有關(guān)。端粒酶可以利用RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，解決DNA復(fù)制時(shí)末端缺失的問題。正常情況下端粒酶只有在受精卵和十細(xì)胞中才有活性，而腫瘤細(xì)胞大

20、多具有高活性的端粒酶。 端粒酶的重要組成部分是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。它的活性與端粒酶活性高度相關(guān). 引起人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶激活的啟動子甲基化有位置特異性，即與啟動子特定部位的甲基化及相關(guān)區(qū)域整體的非甲基化相關(guān)。DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移 組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變的重要特征，近年來這力一面的研究進(jìn)展迅速.細(xì)胞骨架的異常調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 DFNAS是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因.DFNAS可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而DFNA基因啟動子甲基化后的表達(dá)抑制導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移幾率增大DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥6.持續(xù)的增殖信號 大部分的癌細(xì)胞不需要外界的生長刺激因子的作用就可以

21、完成增殖，原因是細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了變化，導(dǎo)致促增殖因子作用的增強(qiáng)。 在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞中SFRPs的啟動子區(qū)域的高甲基化使其表達(dá)抑制，引起了Wnt通路的過度激活而刺激細(xì)胞分裂，因而細(xì)胞在不需要外界生長刺激因子的作用下就可以不斷增殖。DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥 與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，還包括基因組范圍內(nèi)以非編碼重復(fù)序列為主的DNA整體水平的低甲基化.DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥1. 特定基因的甲基化水平降低 CT ( cancer/testis antigen genes)抗原屬于MACE (

22、melanoma and germ cell expressed)基因家族，正常情況下只在生殖細(xì)胞表達(dá)。 CT抗原在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活與它的啟動子區(qū)域的去甲基化相關(guān)。 近年來，白血病基因，乳腺癌基因，結(jié)腸直腸癌，腎細(xì)胞癌基因肝癌基因中都發(fā)現(xiàn)了由啟動子低甲基化所引起的腫瘤相關(guān)基因的過表達(dá).DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥2.基因組范圍整體DNA甲基化的降低基因組范圍DNA甲基化的程度可以通過甲基化敏感的DNA酶來檢測。在多種癌癥當(dāng)中都發(fā)現(xiàn)了基因組范圍整體水平的DNA甲基化降低，包括許多重復(fù)序列甲基化水平的下降。正常組織細(xì)胞的甲基胞嘧啶含量約4%，而癌細(xì)胞則為

23、大約2%一3%。DNA甲基化水平的降低可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期階段。腫瘤細(xì)胞在基因缺乏區(qū)域(gene-poor areas)的DNA甲基化水平明顯下降，而基因啟動子區(qū)域的甲基化差異則相對較小，提示這些非編碼區(qū)域的甲基化水平降低可能與腫瘤發(fā)生有更密切的關(guān)系.DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥診斷表觀遺傳學(xué)的改變是細(xì)胞癌變的重要特征之一，因此，細(xì)胞DNA甲基化的變化可以作為癌癥早期診斷的重要依據(jù)。甲基化生物標(biāo)記的不斷發(fā)現(xiàn)使這一技術(shù)在臨床的應(yīng)用成為可能。 甲基化特異的PCR技術(shù)(methylation-specific PCR MSP)的出現(xiàn)，使得細(xì)胞DNA甲基化水平的檢測變得十分方便。DNA甲基化檢測穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測且其異常程度常與癌癥的進(jìn)展相關(guān).因此，相對于傳統(tǒng)的基因突變檢測有很大的優(yōu)勢。在許多癌癥中都己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了癌癥相關(guān)基因甲基化水平的改變，如外周血細(xì)胞的DNA低甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān)，隨著全基因組甲基化圖譜的繪制，相信會有更多的甲基化生物標(biāo)記投入到臨床癌癥的診斷中。與基因的突變不同，表觀遺傳學(xué)的改變大都是可逆的，因此，利用藥物來改變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)可能是治療癌癥的一條新途徑。目前的甲基化酶抑制劑主要有zebularine和 5-ADC 。 5-ADC在試驗(yàn)中顯示了對骨髓增生癥、白血病和實(shí)體腫瘤都有明顯的療效。Zeb