生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心

1、會(huì)計(jì)學(xué)1生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心第一章第一章 蛋白質(zhì)（酶）、核酸的分離純化蛋白質(zhì)（酶）、核酸的分離純化第三章第三章 層析技術(shù)層析技術(shù)第二章第二章 離心技術(shù)離心技術(shù)第四章第四章 電泳技術(shù)電泳技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 引言引言 一、分離純化的意義一、分離純化的意義二、分離純化的要求二、分離純化的要求三、分離純化的一般程序三、分離純化的一般程序第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)（酶）、核酸分離純化的前處理蛋白質(zhì)（酶）、核酸分離純化的前處理 一、材料的選擇與預(yù)處理一、材料的選擇與預(yù)處理 二、細(xì)胞的破碎二、細(xì)胞的破碎 三、細(xì)胞器的分離三、細(xì)胞器的分離 四、提取四、提取第三節(jié)第三節(jié) 分離純化分離

2、純化 一、一、 粗提純粗提純 二、二、 精提純精提純 三、三、 純度鑒定純度鑒定第四節(jié)第四節(jié)生物大分子的濃縮、干燥及保存生物大分子的濃縮、干燥及保存 性質(zhì)性質(zhì) 方法方法v分子大小分子大小 透析、超濾、差速離心、凝膠過(guò)濾透析、超濾、差速離心、凝膠過(guò)濾v溶解度溶解度 等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀v電荷電荷 電泳、離子交換層析電泳、離子交換層析v吸附性質(zhì)吸附性質(zhì) 吸附層析吸附層析v對(duì)配體分子對(duì)配體分子 的生物親和力的生物親和力 親和層析親和層析生物大分子的分離純化的方法很多，主要是根據(jù)分子之間特異性的差異，如分子大小生物大分子的分離純化的方法很多，主要是根據(jù)分子之間特

3、異性的差異，如分子大小 、溶解度、電荷等建立起來(lái)的。、溶解度、電荷等建立起來(lái)的。 蛋白質(zhì)的去除蛋白質(zhì)的去除 主要是利用主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，的雜蛋白分開(kāi)。這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。蛋白質(zhì)，但分辨率低。l 不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同

4、，故鹽析所需要的鹽濃度也不化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)中鹽的濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出分段鹽析分段鹽析2.核酸的粗提純核酸的粗提純n 從細(xì)胞中提取得到的核酸，?；祀s有蛋白質(zhì)及各種從細(xì)胞中提取得到的核酸，?；祀s有蛋白質(zhì)及各種大小的核酸同類物等雜質(zhì)，可采用適當(dāng)方法進(jìn)行粗大小的核酸同類物等雜質(zhì)，可采用適當(dāng)方法進(jìn)行粗提純。提純。n 粗提純中，進(jìn)一步將蛋白質(zhì)除去粗提純中，進(jìn)一步

5、將蛋白質(zhì)除去, ,可用去污劑或有機(jī)可用去污劑或有機(jī)溶劑多次反復(fù)提取。溶劑多次反復(fù)提取。n 從從RNARNA除去混雜的除去混雜的DNADNA，可用，可用DNAaseDNAase將將DNADNA降解掉。降解掉。n 從從DNADNA中除去混雜的中除去混雜的RNARNA，可用，可用RNAaseRNAase將將RNARNA降解掉。降解掉。二、精提純二、精提純1.蛋白質(zhì)精提純蛋白質(zhì)精提純一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級(jí)后，體積較小，雜質(zhì)大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的大部分被除去。進(jìn)一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳柱層析及電泳方法。方法。常用的柱層析方

6、法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、常用的柱層析方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、親和層析。吸附層析、親和層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。焦電泳。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。2.核酸核酸精提純精提純第四節(jié)生物大分子的濃縮、干燥及保存第四節(jié)生物大分子的濃縮、干燥及保存一、濃縮一、濃縮1.1.吸收法吸收法2.2.超濾法超濾法二、干燥二、干燥1.1.真空干燥真空干燥2.2.冷凍真空干燥冷凍真空干燥三、樣品的

7、保存三、樣品的保存1.1.干態(tài)保存干態(tài)保存2.2.液態(tài)保存液態(tài)保存 離心技術(shù)概論離心技術(shù)概論 一般制備離心一般制備離心 超離心技術(shù)超離心技術(shù)第二章第二章 離心技術(shù)離心技術(shù)臺(tái)式高、超速臺(tái)式高、超速離心機(jī)離心機(jī)0.6-10萬(wàn)萬(wàn)rpm離心機(jī)離心機(jī)制備性制備性分析性分析性分析性超速離心機(jī)分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地面臺(tái)式（或地面式）普通離心式）普通離心機(jī)機(jī)大容量冰凍離大容量冰凍離心機(jī)心機(jī)小于小于0.6萬(wàn)萬(wàn)rpm高速冰凍離高速冰凍離心機(jī)心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)萬(wàn)超速冰凍離心超速冰凍離心機(jī)機(jī)2.5-8萬(wàn)或更高萬(wàn)或更高( (分析性超速離心主要用于檢測(cè)大分析性超速離心主要用于

8、檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等) )概述概述一般制備離心一般制備離心v 一般制備離心是指在分離、濃縮、提純樣品中，一般制備離心是指在分離、濃縮、提純樣品中，不必制備密度梯度的不必制備密度梯度的一次完成的離心操作一次完成的離心操作，實(shí)驗(yàn)室用，實(shí)驗(yàn)室用低、高速離心機(jī)可應(yīng)用于此項(xiàng)技術(shù)。低、高速離心機(jī)可應(yīng)用于此項(xiàng)技術(shù)。 臺(tái)式或地面式普通離心機(jī)臺(tái)式或地面式普通離心機(jī)高速冰凍離心機(jī)高速冰凍離心機(jī)科研人員將采集的臍帶血放置到低溫超速離心機(jī)內(nèi)科研人員將采集的臍帶血放置到低溫超速離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行技術(shù)處理進(jìn)行技術(shù)處理超速冰凍離心機(jī)超速冰凍離心機(jī)應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍： 病毒及亞細(xì)胞組份分離病毒

9、及亞細(xì)胞組份分離 蛋白梯度分離蛋白梯度分離 脂蛋白分離脂蛋白分離 RNA梯度沉淀梯度沉淀 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提純提純 v制備性超速離心主要制備性超速離心主要利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加利用離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)分開(kāi)?？祛w粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)分開(kāi)。v沉降系數(shù)指單位沉降系數(shù)指單位(cm)(cm)離心場(chǎng)中顆粒沉降的速度，用離心場(chǎng)中顆粒沉降的速度，用s s表示，其單位是表示，其單位是1 11010- -1313秒，簡(jiǎn)稱秒，簡(jiǎn)稱S S，即，即1S1S1 11010-13-13秒。秒。

10、v沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。v制備超離心的關(guān)鍵是制備超離心的關(guān)鍵是如何根據(jù)顆粒和介質(zhì)的性質(zhì)以及轉(zhuǎn)子的某些參數(shù)來(lái)如何根據(jù)顆粒和介質(zhì)的性質(zhì)以及轉(zhuǎn)子的某些參數(shù)來(lái)確確定定轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間。v顆粒沉降的時(shí)間和速度取決于：離心力、顆粒的大小形狀和密度、沉降介顆粒沉降的時(shí)間和速度取決于：離心力、顆粒的大小形狀和密度、沉降介質(zhì)的密度和粘度。質(zhì)的密度和粘度。超離心技術(shù)超離心技術(shù)一、一、原理和計(jì)算原理和計(jì)算二、二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇轉(zhuǎn)子離心管及選擇三、三、離心技術(shù)類型離心技術(shù)類型四、四、梯度回收梯度回收一、原理和計(jì)

11、算一、原理和計(jì)算（一）離心力和相對(duì)離心力（一）離心力和相對(duì)離心力v當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭以一定的角速度當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)頭以一定的角速度w w（弧度（弧度/ /秒）旋轉(zhuǎn)，顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為秒）旋轉(zhuǎn)，顆粒的旋轉(zhuǎn)半徑為r r（厘米）時(shí)（厘米）時(shí)，任何顆粒均受一個(gè)向外的離心力，此離心力為：，任何顆粒均受一個(gè)向外的離心力，此離心力為： F= mF= m2 2r r 式中，式中，F(xiàn) F通常以地心引力表示，稱為相對(duì)離心力（通常以地心引力表示，稱為相對(duì)離心力（RCFRCF），相對(duì)離心力指在離心力場(chǎng)），相對(duì)離心力指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單

12、位是重力加速度g g（980980厘米厘米/ /秒秒2 2），這時(shí)），這時(shí)RCFRCF可表示如下：可表示如下： RCF = RCF = 2 2r/980r/980 v實(shí)際上，這一關(guān)系式常用每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)實(shí)際上，這一關(guān)系式常用每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)n n（或（或rpmrpm），以更通用表達(dá)式來(lái)表示，由于），以更通用表達(dá)式來(lái)表示，由于=2n/60 =2n/60 于是：于是： RCF=4RCF=42 2（rpmrpm）2 2r/3600r/3600* *980 980 簡(jiǎn)化得：簡(jiǎn)化得： RCF=1.119RCF=1.1191010-5-5 （rpmrpm）2 2r r v一般低轉(zhuǎn)速時(shí)常用一般低轉(zhuǎn)速時(shí)常用rpmrpm

13、來(lái)表示，高轉(zhuǎn)速離心則以來(lái)表示，高轉(zhuǎn)速離心則以g g表示。表示。半徑半徑相對(duì)離心力相對(duì)離心力轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速方法：方法：三點(diǎn)一線三點(diǎn)一線，左對(duì)左，左對(duì)左，右對(duì)右，右對(duì)右v為了便于進(jìn)為了便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的離心力之間的換算，人們?cè)趽Q算，人們?cè)谑降幕A(chǔ)上式的基礎(chǔ)上制作了三者關(guān)制作了三者關(guān)系的列線計(jì)算系的列線計(jì)算圖圖RCF=1.119RCF=1.1191010-5-5 （rpmrpm）2 2r r二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇（一）離心管（一）離心管v常見(jiàn)的玻璃離心管質(zhì)硬且脆，不能承受超離心的壓力。常見(jiàn)的玻璃離心管質(zhì)硬且脆，不能承受超離心的壓力。v用于超離心機(jī)轉(zhuǎn)子中的離心管分為

14、塑料管及不銹鋼管兩類。用于超離心機(jī)轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管兩類。v離心時(shí)樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造離心時(shí)樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故。成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故。 （二）離心管帽（二）離心管帽v超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽。超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽。（三）轉(zhuǎn)子及選擇（三）轉(zhuǎn)子及選擇v 主要有角轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子等幾種類型。主要有角轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子等幾種類型。1 1、角轉(zhuǎn)子、角轉(zhuǎn)

15、子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)，相反，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”。最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速。最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速或減速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)?；驕p速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)

16、。 2 2、水平轉(zhuǎn)子、水平轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到水轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到水平位置（約平位置（約200200800rpm800rpm）時(shí)。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯）時(shí)。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過(guò)離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處于度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過(guò)離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)壁效應(yīng)”，但受振動(dòng)和變速攪

17、亂后對(duì)流現(xiàn)象小得多。，但受振動(dòng)和變速攪亂后對(duì)流現(xiàn)象小得多。3 3、垂直轉(zhuǎn)子、垂直轉(zhuǎn)子角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。4 4、區(qū)帶轉(zhuǎn)子、區(qū)帶轉(zhuǎn)子 三、離心技術(shù)類型三、離心技術(shù)類型v 常用離心技術(shù)一般包括差速離心法，速度區(qū)帶法和等密度梯度沉降法。常用離心技術(shù)一般包括差速離心法，速度區(qū)帶法和等密度梯度沉降法。（一）差速離心法（一）差速離心法原理原理：采用逐漸增加離心速度或低速和高

18、速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆：采用逐漸增加離心速度或低速和高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱為差速離心法。粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離的方法，稱為差速離心法。當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大當(dāng)以一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較和最重顆粒的沉淀，分出的上清液在加大轉(zhuǎn)速下再進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的大、較重顆粒的“沉淀沉淀”及含小和輕顆粒及含小和輕顆?！吧锨逡荷锨逡骸?，如

19、此多次離心處理，即能，如此多次離心處理，即能把液體中的不同顆粒較好分開(kāi)。這時(shí)所得沉淀是不純的，需經(jīng)再懸浮和再離心（把液體中的不同顆粒較好分開(kāi)。這時(shí)所得沉淀是不純的，需經(jīng)再懸浮和再離心（2 23 3次），才能得到較純顆粒。次），才能得到較純顆粒。用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。核、線粒體、溶酶體與過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。已破碎的細(xì)胞已破碎的細(xì)胞 沉淀（細(xì)胞核）沉淀（細(xì)胞核） 上清液上清液 沉淀（細(xì)胞膜碎片、

20、沉淀（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體）線粒體、溶酶體） 上清液上清液 沉淀（核糖核蛋白體沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶上清液（可溶性組分）性組分）500 g，10 10 000 g，10 100 000 g，3h（二）速度區(qū)帶法（二）速度區(qū)帶法速度區(qū)帶主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。速度區(qū)帶主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種沉降方法所采這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同生物顆粒（細(xì)胞或細(xì)器

21、）在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。的速度沉降而達(dá)到分離。（三）等密度梯度沉降法（三）等密度梯度沉降法原理原理：等密度梯度沉降（：等密度梯度沉降（isopycnic sedimentationisopycnic sedimentation）適用于分離密度不等的顆）適用于分離密度不等的顆粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂粒。細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)

22、胞或細(xì)胞器分離?；蚣?xì)胞器分離。等密度梯度離心一般常用等密度梯度離心一般常用CsClCsCl、RuClRuCl、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。介質(zhì)梯度不、蔗糖、甘油等做介質(zhì)。介質(zhì)梯度不需預(yù)需預(yù)先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過(guò)離心形成梯先制備，離心時(shí)把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過(guò)離心形成梯度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。度，讓顆粒在梯度中進(jìn)行再分配。常用來(lái)分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。常用來(lái)分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。四、梯度回收四、梯度回收1 1、穿刺法、穿刺法 這是一種簡(jiǎn)易的手工操作法，采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出這是一種簡(jiǎn)易的手工操作法，采用針

23、穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決定取舍或合并。經(jīng)分析決定取舍或合并。 此法對(duì)梯度擾動(dòng)小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不此法對(duì)梯度擾動(dòng)小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼或厚壁塑料管。使用于不銹鋼或厚壁塑料管。2 2、取代法、取代法 回收梯度中最常使用的一種方法，分為向上及向下取代兩種。取代法優(yōu)回收梯度中最常使用的一種方法，分為向上及向下取代兩種。取代法優(yōu)點(diǎn)是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（

24、放射性）系統(tǒng)進(jìn)行流出液點(diǎn)是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進(jìn)行流出液跟蹤，簡(jiǎn)化分析化驗(yàn)工作。缺點(diǎn)是開(kāi)始取代操作時(shí)易引起擾亂，操作需特別跟蹤，簡(jiǎn)化分析化驗(yàn)工作。缺點(diǎn)是開(kāi)始取代操作時(shí)易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時(shí)也不合適。小心，梯度粘度太大時(shí)也不合適。 濃濃取取代代液液 稀稀 濃濃通入空氣、輕液體通入空氣、輕液體收集收集 濃濃 稀稀收集收集3 3、虹吸法、虹吸法 用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級(jí)分離，但虹吸時(shí)易引起分離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的

25、分級(jí)分離，但虹吸時(shí)易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專門(mén)的裝置。離區(qū)帶擾亂，最好使用專門(mén)的裝置。 除取代法和虹吸法外，有時(shí)從管上部直接仔細(xì)地用注射器或吸管除取代法和虹吸法外，有時(shí)從管上部直接仔細(xì)地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也較好。定量移出梯度液，效果也較好。4 4、切割法、切割法 適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管切成薄片適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。梯度的分析梯度的分析分析梯度中的回收物質(zhì)常用紫外吸收法、酶活力測(cè)定法、放射標(biāo)記法。分析梯度中

26、的回收物質(zhì)常用紫外吸收法、酶活力測(cè)定法、放射標(biāo)記法。蛋白質(zhì)、核酸或某些含蛋白質(zhì)、核酸占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞器、病毒可用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸或某些含蛋白質(zhì)、核酸占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞器、病毒可用紫外吸收法測(cè)定。細(xì)胞器一般可測(cè)定標(biāo)志酶活性，通常每一組分至少選二種標(biāo)志酶，如一時(shí)找不到。細(xì)胞器一般可測(cè)定標(biāo)志酶活性，通常每一組分至少選二種標(biāo)志酶，如一時(shí)找不到更好的測(cè)定目的物，也可測(cè)光吸收來(lái)推斷分布的組分，對(duì)于同位素標(biāo)記物，最好是更好的測(cè)定目的物，也可測(cè)光吸收來(lái)推斷分布的組分，對(duì)于同位素標(biāo)記物，最好是測(cè)定其放射活性。此外，某些情況下也可用免疫法，電泳法測(cè)定物質(zhì)在梯度中的分測(cè)定其放射活性。此外，某些情況下也可用免疫法，電

27、泳法測(cè)定物質(zhì)在梯度中的分布，亞細(xì)胞成分可用電鏡或光學(xué)顯微鏡觀察分析各分部的組分，最后分析結(jié)果。布，亞細(xì)胞成分可用電鏡或光學(xué)顯微鏡觀察分析各分部的組分，最后分析結(jié)果。引言引言層析法的基本原理層析法的基本原理層析法的分類層析法的分類第一節(jié)第一節(jié) 吸附層析技術(shù)吸附層析技術(shù)第二節(jié)第二節(jié) 分配層析技術(shù)分配層析技術(shù)第三節(jié)第三節(jié) 凝膠過(guò)濾層析技術(shù)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)第四節(jié)第四節(jié) 離子交換層析法離子交換層析法第五節(jié)第五節(jié) 親和層析法親和層析法第六節(jié)第六節(jié) 高壓液相層析（高壓液相層析（HPLCHPLC）n按操作形式不同分類：按操作形式不同分類：柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣

28、品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。分配層析法（液分配層析法（液- -液層析法，液層析法，LLCLLC）原理：原理：利用混合物利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配分配系數(shù)系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。的不同而達(dá)到分離各組分

29、的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動(dòng)相流過(guò)固定相。動(dòng)相流過(guò)固定相。分配系數(shù)：分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。 K=cK=c1 1/c/c2 2v分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。特點(diǎn)：特點(diǎn)：液液-

30、-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周圍充滿液體流動(dòng)相，每厘，固定相周圍充滿液體流動(dòng)相，每厘米柱中液相體積為米柱中液相體積為1cm3。若在柱頂加入。若在柱頂加入1cm3溶劑溶劑,其中含其中含32mg樣品，同時(shí)應(yīng)有相樣品，同時(shí)應(yīng)有相同體積的溶劑從柱底流出，此時(shí)樣品處于柱中同體積的溶劑從柱底流出，此時(shí)樣品處于柱中A位置。若樣品的分配系數(shù)是位置。若樣品的分配系數(shù)是1，則，則它在固相與液相間等量分配。若再有

31、它在固相與液相間等量分配。若再有1cm3的溶劑加到柱上，的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著部分中的溶劑帶著16mg的物質(zhì)向下移動(dòng)到的物質(zhì)向下移動(dòng)到B，A和和B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配，中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配，不同組分的含量不同組分的含量 不同組分在柱中的位置不同組分在柱中的位置上部上部中部中部下部下部不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時(shí)：不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時(shí)：二、凝膠的種類和性質(zhì)二、凝膠的種類和性質(zhì) 1.1.交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)Sephadex) 1) Sephadex G 1) Sephadex G G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的1010倍。倍。 G G

32、 反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。 2 2） Sephadex LH-20Sephadex LH-20，是，是Sephadex G-25Sephadex G-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。用于分離不溶于水的物質(zhì)。2.2.瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Sepharose ;pharmacia;Bio-Gel)Sepharose ;pharmacia;Bio-Gel) 依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀

33、結(jié)構(gòu)越密集。 3.3.聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠商品名為生物膠-P-P（Bio-Gel P)Bio-Gel P)。 4.4.聚苯乙烯凝膠（聚苯乙烯凝膠（Styrogel) Styrogel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。LogMLogMA AB BC CLogMLogM測(cè)測(cè)V V測(cè)測(cè)蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，量有關(guān)， LogM=LogM=（k

34、k1 1-k-k2 2）VeVe（VeVe為洗脫體積）為洗脫體積）先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的VeVe，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)VeVe作圖得一直線，再測(cè)出作圖得一直線，再測(cè)出待測(cè)樣品的待測(cè)樣品的VeVe，查標(biāo)準(zhǔn)曲，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。線即可確定分子量。+若選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，則帶正電荷的物質(zhì)與若選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H H+ +發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。若發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。若選擇陰離子交換樹(shù)脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與選擇陰離子交換樹(shù)脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OHOH- -發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。物質(zhì)在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固

35、程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘何镔|(zhì)在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。便可將混合物中的組分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。+CC配基配基蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)1.配基固相化配基固相化2.親和吸附親和吸附固體載體固體載體3.解吸附解吸附C引言引言第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理第二節(jié)第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第三節(jié)第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳第四節(jié)第四節(jié) 免疫電泳免疫電泳一一、概述、概述二二、聚丙烯酰胺凝膠的制備、聚丙烯酰胺凝膠的制備三三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系、凝

36、膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系四四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳引言引言.+-EQEQ6 6r r（2）（3）（4）EQEQ6 6r r（4）V=.Q Q.6 6r r 由由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影響溶液粘度凡能影響溶液粘度的因素如的因素如溫度溫度，影響分子，影響分子帶電量帶電量Q Q及解離度及解離度的因素如的因素如pHpH的改變，都會(huì)對(duì)有效遷移率，產(chǎn)生影響的改變，都會(huì)對(duì)有效遷移率，產(chǎn)生影響。一、概述一、概述 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electropho-polyacrylamide gel elec

37、tropho-resisresis，PAGEPAGE）是以）是以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)穩(wěn)定，對(duì)pHpH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。質(zhì)。 聚丙烯酰胺凝膠是由聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體丙烯酰胺單體（acry-lamideacry-lamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱AcrAcr）和）和交聯(lián)劑交聯(lián)劑N N，N N - -甲叉甲叉雙丙烯

38、酰胺雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamidemethylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱BisBis）在催化劑作用下合成的。）在催化劑作用下合成的。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2

39、 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N - -甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1.1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑通常采用化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨過(guò)硫酸銨，此外還需要加速劑，此外還需要加速劑TEMEDTEMED（N N，N N，N N ，N N - -四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMEDTEMED的加入，可使過(guò)硫酸銨形成的加入，

40、可使過(guò)硫酸銨形成氧自由基，這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺單體形成自由基，從而與甲叉雙丙烯氧自由基，這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺單體形成自由基，從而與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定孔徑的聚丙烯酰胺。酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定孔徑的聚丙烯酰胺。.2.2.光聚合光聚合三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%8.38.38.96.7+-水平板式電泳槽水平板式電泳槽垂直板式電泳槽垂直板式電泳槽電泳條帶電泳條帶lXo#s%v(y0B3E6I9LdOgRjVmYp

41、!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgSjVmYq!t&w-z1D4G7JbMePhTkWoZr$u(x+A2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcOfRiUmXp#s&v)z0C3F7IaLdPgSkVnYq$t*w-A1D5G8JbNeQhTlWo#r%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnZq$t*x-A1D5G8K

42、bNeQiTlWo#r%v(y+B3E6H9LcOgRjUmYp!s&w)z1C4F7JaMdPhSkWnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y0B3E6I9LcOgRjVmYp!t&w)z1C4G7JaMePhSkWnZr$u*x+A2D5H8KcNfQiUlXo#s%v)y0B3F6I9LdOgRjVmYq!t&w-z1C4G7JbMePhTkWnZr$u(x+A2E5H8KcNfRiUlXp#s%v)y0C3F6IaLdOgSjVnYq!t*w-z1D4G8JbMeQhTkWoZr%u(x+B2E5H9KcNfRiUmXp#s&v)y0

43、C3F7IaLdPgSjVnYq$t*w-A1D4G8JbNeQhTlWoZr%u(y+B2E6H9KcOfRjUmXp!s&v)z0C4F7IaMdPgSkVnYq$t*x-A1D5G8JbNeQiTlWo#r%u(y+B3E6H9LcOfRjUmYp!s&w)z0C4F7JaMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNfQiTlXo#r%v(y+B3E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3aMdPhSkVnZq$u*x-A2D5G8KbNeQiTlXo#r%v(y+B3

44、E6I9LcOgRjUmYp!t&w)z1C4F7JaMePhSkWnZq$u*x+A2D5H8KbNfQiUlXo#s%v(y0B3F6I9LdOgRjVmYp!t&w-z1C4G7JaMePhTkWnZr$u*x+A2E5H8KcNfQiUlXp#s%v)y0B3F6IaLdOgSjVmYq!t*w-z1D4G7JbMeQhTkWoZr$u(x+B2E5H9KcNfRiUlXp#s&v)y0C3F6IaLdPgSjVnYq!t*w-A1D4G8JbMeQhTlWoZr%u(x+B2E6H9KcOfRiUmXp!s&v)z0C3F7IaMdPgSkVnYq$t

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