生物有機(jī)化學(xué)復(fù)習(xí)提綱

1、一、 鞠建華：緒論、酶1 .生物有機(jī)化學(xué)（Bioorganic Chemistry)：有機(jī)化學(xué)和生物化學(xué)的交叉學(xué)科，運(yùn)用有機(jī)化學(xué)的理論和方法在分子水平上研究生命現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)。2 .你還了解哪些天然產(chǎn)物或者分子具有哪些生物學(xué)功能？3共價(jià)鍵、氫鍵、配價(jià)鍵、離子鍵、疏水作用、范德華作用力4化學(xué)鍵，范德華力，氫鍵比較5 R/S構(gòu)型生物分子立體效應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在：影響反應(yīng)的活性和方向性；生物分子間的相互作用等。1. 對(duì)反應(yīng)活性的影響 鄰基效應(yīng)（proximity effects） 2. 對(duì)反應(yīng)立體選擇性的影響（ 酶促反應(yīng)的立體選擇性例子）生物體內(nèi)的基本有機(jī)反應(yīng) 1.水解反應(yīng): 包括酯鍵、酰胺鍵和糖苷

2、鍵的水解。 2.縮合反應(yīng):生成酰胺鍵、酯鍵、糖苷鍵的反應(yīng) , 其它縮合反應(yīng)（羥醛縮合反應(yīng)、克萊森酯縮合反應(yīng)、迪克曼縮合）3. 磷酰化反應(yīng) 4. 氧化和還原反應(yīng)5. 烷基化反應(yīng)（脂肪酸碳鏈增長(zhǎng)反應(yīng)）6. 加成反應(yīng)（親電加成反應(yīng)、親核加成反應(yīng)、環(huán)加成反應(yīng)即迪爾斯-阿爾德反應(yīng)）7. 消除反應(yīng)8. 分子重排反應(yīng)（克萊森重排、頻哪醇重排、法沃爾斯基重排）9. 異構(gòu)化反應(yīng)n 酶（enzyme）是一類由活細(xì)胞產(chǎn)生的，對(duì)其特異底物具有高效催化作用的生物催化劑。n 生物催化（biocatalysis）是指利用酶或者生物有機(jī)體（細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等）作為催化劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程。舉出生活中，酶應(yīng)用的具體例子。1.

3、醫(yī)用：胰蛋白酶用于促進(jìn)傷口愈合和溶解血凝塊，還可用于去除壞死組織，抑制污染微生物的繁殖。 2.日用：加酶洗衣粉3.食用：凝乳酶奶酪生產(chǎn)的凝結(jié)劑，并可用于分解蛋白質(zhì)。 乳糖酶降解乳糖為葡萄糖和半乳糖，獲得沒有乳糖的牛乳制品，有利于乳品的消化吸收。4.美容： 酶對(duì)生物催化的貢獻(xiàn)與一般化學(xué)催化劑的異同？酶為什么需要形成活性中心？共性：在反應(yīng)前后沒有質(zhì)和量的變化；只能催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)；只能加速可逆反應(yīng)的進(jìn)程，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)；作用機(jī)制都降低反應(yīng)活化能不同點(diǎn)：酶效率高；底物特異性；酶在體系內(nèi)處于不斷變化中；催化作用由多種因素調(diào)節(jié)；對(duì)反應(yīng)條件嚴(yán)格為什么酶的催化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)地比非催化劑或一般催化劑高

4、？酶原：酶分子沒有活性的前體物質(zhì)。酶原的激活：在一定條件下，酶原像有活性的酶轉(zhuǎn)化的過程。別構(gòu)調(diào)節(jié)：指小分子化合物與酶蛋白分子活性中心以外的某一部位特異結(jié)合,引起酶蛋白分子構(gòu)像變化、從而改變酶的活性。抑制劑：引起酶活力降低的別構(gòu)效應(yīng)劑。激活劑：引起酶活力增加的別構(gòu)效應(yīng)劑。舉例說明，研究酶抑制劑的現(xiàn)實(shí)意義？醫(yī)學(xué) : 磺胺藥是二氫葉酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，進(jìn)而減少菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡新藥研發(fā):農(nóng)業(yè) : 苯磺?。?磺酰脲類除草劑，抑制乙酰乳酸合成酶（ALS）的抑制劑，通過抑制ALS，阻礙側(cè)鏈氨基酸如纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸的生物合成，導(dǎo)致雜草生長(zhǎng)受破壞而死。畜牧業(yè): 脲酶

5、抑制劑不但能抑制瘤胃內(nèi)脲酶活性，降低瘤胃中氨的濃度，而且可使氨的釋放速度平穩(wěn)，有利于微生物合成菌體豆角、決而提高反芻動(dòng)物對(duì)尿素的利用率,并提高飼料轉(zhuǎn)化率X-衍射晶體學(xué)手段研究酶的意義?v 測(cè)定酶分子的三維結(jié)構(gòu)，明確其三維構(gòu)件及結(jié)構(gòu)域分布。v 從原子級(jí)別，理解酶催化的機(jī)制。v 基于酶分子三維結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。酶作為藥物靶向目標(biāo)，為藥物前期開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支持。相比于化學(xué)合成，酶催化的合成有什么優(yōu)勢(shì)？化學(xué)合成：涉及糖分子中羥基的保護(hù)與脫保護(hù)，步驟多，產(chǎn)率低。 糖苷合成酶：催化糖苷合成，一步反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。u 聚酮類化合物是一大類由細(xì)菌、真菌和植物將低級(jí)羧酸通過連續(xù)的縮合反應(yīng)產(chǎn)生的天然產(chǎn)物，具有多樣的

6、碳骨架結(jié)構(gòu)：u 聚肽類化合物是一類不以mRNA為模板，不需核糖體、tRNA的參與，由非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）催化合成的天然產(chǎn)物。其氨基酸原料除了20種蛋白質(zhì)源的氨基酸外，還含有大量的非蛋白源氨基酸。AT（acyl transferase， ?；D(zhuǎn)移酶）：負(fù)責(zé)將低級(jí)脂肪酸以CoA酯形式通過?；鶖y帶蛋白ACP的輔基； AT結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜镒R(shí)別的特異性決定碳鏈延長(zhǎng)單位的組成，AT結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和相應(yīng)的模塊決定聚酮體鏈的長(zhǎng)度 ACP（acyl carrier protein，?；d體蛋白）：在聚酮鏈延伸中起到?；D(zhuǎn)移的攜帶作用KS（k

7、etoacyl-ACP synthase，酮脂酰-ACP 合成酶）：在聚酮鏈的延長(zhǎng)中，起到催化新進(jìn)入的?；?ACP與已延長(zhǎng)的聚酮中間體之間的縮合作用，使聚酮鏈得到進(jìn)一步的延長(zhǎng) KR（ketoreductase，酮基轉(zhuǎn)移酶）：參與聚酮鏈形成過程中酮基的還原，使酮基變?yōu)榱u基DH（dehydratase，脫水酶）：參與聚酮體碳鏈羥基的脫水； ER（enoyl reductase，烯醇還原酶），參與聚酮體碳鏈烯醇式結(jié)構(gòu)中雙鍵的還原反應(yīng)TE（thioesterase，硫脂酶），通常位于PKS合酶C末端，催化聚酮體碳鏈末端羥基與?；?ACP硫酯的羰基進(jìn)行親核性的結(jié)合，使聚酮體環(huán)化，并將其從酶體中釋放酶活力

8、（enzyme activity）指酶促反應(yīng)速率；即規(guī)定條件下在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。 酶的活性單位： 表示酶的相對(duì)含量，指在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所需要的酶量。 酶的比活力:是指單位質(zhì)量（mg）的蛋白質(zhì)所具有某種酶的活性，國(guó)際 標(biāo)準(zhǔn)單位是 U/mg或IU/mg米氏常數(shù)Km值具有重要的參考意義l Km可以判斷酶的專一性和天然底物。 最小的底物通常是酶的最適底物l Km可以用于推斷某一代謝反應(yīng)的方向和途徑 微生物是現(xiàn)代工業(yè)酶開發(fā)的重要源泉，這是為什么？有何實(shí)例？微生物中酶的最適溫度范圍變化極大不可逆抑制（irreversible inhibiti

9、on） 有機(jī)磷化合物 ; 有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物 ; 重金屬鹽; 烷化試劑; 抗生素1. 示例工作的研究背景1.1 什么是酰胺鍵？有機(jī)化學(xué)中，羧酸經(jīng)活化再與胺進(jìn)行親核取代反應(yīng)，形成的化學(xué)鍵即為酰胺鍵 其中羧基可被活化成酰氯、脂、酰基咪唑、酸酐、?；B氮等1.2 酰胺鍵的生物合成多肽與蛋白質(zhì)的生物合成催化合成肽鍵；氨基酸或結(jié)構(gòu)類似物在酰胺鍵合成酶催化下形成酰胺鍵 1.3 相關(guān)工作的研究意義Ø 解析一類化合物的生物合成機(jī)制 Ø 分析一個(gè)關(guān)鍵催化酶的理化性質(zhì) Ø 發(fā)表科學(xué)研究?jī)?nèi)容提供研究參考 Ø 建立后續(xù)開發(fā)工作基礎(chǔ) 2. 制定研究技術(shù)路線和方案3. 實(shí)驗(yàn)工作的

10、開展3.1 獲取目的基因序列并注釋功能3.1.1 mcbA基因的生物信息學(xué)分析-1海洋b-咔啉生物堿Marinacarbolines AD生物合成基因簇僅僅含三個(gè)基因 3.1.2 mcbA基因的生物信息學(xué)分析-2 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能等通過同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析確定McbA的功能，活性位點(diǎn)和功能域3.1.3 mcbA基因的生物信息學(xué)分析-3 同時(shí)找出一系列的同源蛋白進(jìn)行比對(duì)進(jìn)一步分析具體的催化功能 3.1.4 mcbA基因的生物信息學(xué)分析-4 分析發(fā)現(xiàn)McbA是一類ATP依賴性的酰胺鍵合成酶，在進(jìn)化上有獨(dú)特性功能蛋白的進(jìn)化樹分析便于了解酶類型，選取合適的參考對(duì)象3.2

11、 mcbA基因的克隆設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的基因片段，經(jīng)測(cè)序鑒定后的目的片段連接原核表達(dá)載體如pET28a，導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌株3.3 McbA蛋白的表達(dá)純化如何計(jì)算蛋白的分子量？如何進(jìn)行蛋白的表達(dá)純化？如何保證酶蛋白活性穩(wěn)定？3.4 McbA酶促反應(yīng)檢測(cè)方法活性分析方法3.5 McbA酶促反應(yīng)最適條件活性分析基礎(chǔ)（1）材料的選擇 酶的來(lái)源： 野生型來(lái)源：動(dòng)物、植物以及微生物等各種原料 異源宿主來(lái)源:目前多通過將相關(guān)酶基因克隆至異源微生物(大腸桿菌、酵母)宿主中，通過發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)酶制劑。（2）細(xì)胞破碎（3）酶的抽提（4）酶的初步分離濃縮 鹽析法 等電點(diǎn)沉淀法 有機(jī)溶劑分級(jí)分離法

12、 選擇熱變性法（5）酶的純化（6）酶的組合分離純化策略（7）結(jié)晶和保存 結(jié)晶 經(jīng)過各種提純方法獲得較純的酶溶液后，將酶進(jìn)行結(jié)晶。 保存 固態(tài)：除鹽后經(jīng)冷凍干燥得到酶粉，低溫下可以長(zhǎng)期保存。 液態(tài)：除鹽后，濃縮，還在酶溶液中加入甘油、牛血清蛋白、巰基乙醇、半胱氨酸等保護(hù)劑，在低溫下保存（-20 或-80 ）。 1.酶基因的隨機(jī)突變策略（1） 易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化 定義： 從單一酶分子基因出發(fā)，采用不具有35校對(duì)功能Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，通過調(diào)整反應(yīng)條件，改變Taq酶的突變頻率，以一定的頻率引入突變構(gòu)建突變庫(kù)，然后選擇或篩選所要的突變體。 調(diào)整的PCR條件： a) 增加Mg2（穩(wěn)定非

13、互補(bǔ)的堿基對(duì)） b) 添加Mn2（降低聚合酶的特異性） c) 4種底物的濃度不平衡（dATP/dTTP/dCTP/dGTP） 突變頻率的控制 ：理論上每個(gè)靶基因?qū)氲娜〈鷼埢膫€(gè)數(shù)宜在1.55個(gè)之間。 連續(xù)易錯(cuò)PCR：將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次易錯(cuò)PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。 無(wú)性進(jìn)化 ：易錯(cuò)PCR技術(shù)產(chǎn)生的突變只發(fā)生在單一分子內(nèi)部。 （2） DNA改組技術(shù)技術(shù)為代表的有性進(jìn)化 定義： 是從2種以上同源正突變基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因

14、突變的技術(shù)過程。 原理： DNA片段互為模板和引物，進(jìn)行擴(kuò)增和延伸時(shí)堿基序列會(huì)重新排布而形成眾多的突變基因，分離出全長(zhǎng)突變基因后再進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增以進(jìn)行定向選擇。 結(jié)果： 將存在于不同基因中的多種正突變結(jié)合在一起。（3）基因家族之間的同源重組 定義： 又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。 原理： 與DNA改組相同，過程亦相同。 區(qū)別： DNA改組從通過易錯(cuò)PCR等技術(shù)獲得兩個(gè)以上正突變基因出發(fā)進(jìn)行重排；基因家族重排從基因家族中若干同源基因出發(fā)進(jìn)行重排。 2

15、.酶突變基因的定向選擇 酶分子的定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+正向重組+定向選擇（篩選） 定向選擇定義： 是在人工控制條件的特殊環(huán)境下，按照人們所設(shè)定的進(jìn)化方向?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行篩選，以獲得具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。突變基因文庫(kù)的篩選3.酶分子定向進(jìn)化的應(yīng)用a) 提高酶分子的催化效率 n 實(shí)例1：L-天冬氨酸酶的定向進(jìn)化研究 進(jìn)行4輪易錯(cuò)PCR，篩選了3000個(gè)菌落； 得到酶活力提高28倍的突變體，該酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均優(yōu)于天然酶。n 實(shí)例2：-內(nèi)酰胺水解酶定向進(jìn)化研究 經(jīng)過DNA重排技術(shù)其頭孢噻肟的最低抑制濃度為原始菌株的32000倍，其對(duì)抗生素的耐受力增強(qiáng)證明其催化效率相應(yīng)提高。b)

16、 提高酶分子的穩(wěn)定性實(shí)例1：枯草桿菌蛋白酶熱穩(wěn)定性的提高 利用連續(xù)易錯(cuò)PCR和交錯(cuò)延伸方法重組DNA；枯草桿菌蛋白酶最適作用溫度提高17，65的半衰期增加200倍。實(shí)例2：-淀粉酶90的半衰期延長(zhǎng)9-10倍實(shí)例3：T4溶菌酶11個(gè)不同的單點(diǎn)突變株將Tm提高0.8-1.4c) 適應(yīng)人工環(huán)境中提高酶活力或穩(wěn)定性的進(jìn)化d) 改變酶分子的底物特異性二王曉雪：原核生物，基因突變、修復(fù)，抗生素病毒特征:1. 以核酸和蛋白質(zhì)等元件的裝配來(lái)實(shí)現(xiàn)繁殖;2. 離體條件下，以無(wú)生命的生物大分子狀態(tài)存在，可長(zhǎng)期保持侵染活力 3. 有些病毒的核酸能整合至宿主的基因組中，并誘發(fā)潛伏性感染 4. 對(duì)一般抗生素不敏感，對(duì)干擾

17、素敏感5. 形體極其微小，需電鏡觀察6. 無(wú)細(xì)胞構(gòu)造，主要成分僅為核酸和蛋白質(zhì)7. 每種病毒僅含一種核酸，或DNA或RNA8. 無(wú)產(chǎn)能酶系、無(wú)蛋白質(zhì)和核酸合成酶系，利用宿主活細(xì)胞內(nèi)現(xiàn)成代謝系統(tǒng)合成自身的核酸和蛋白質(zhì)組份海洋浮游病毒的計(jì)數(shù):噬菌斑計(jì)數(shù)法 (plaque assay): 噬菌斑：細(xì)菌病毒侵染細(xì)菌細(xì)胞,導(dǎo)致寄主細(xì)胞溶解死亡，在瓊脂培養(yǎng)基表面形成空斑。病毒復(fù)制過程吸附：通過病毒體表面的配體蛋白不宿主細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合侵入：通過胞飲、融合、直接穿入等方式增殖：利用宿主細(xì)胞提供的環(huán)境和物質(zhì)合成大量病毒核酸和蛋白質(zhì)外殼裝配：病毒核酸和蛋白質(zhì)外殼合成后，在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝為成熟病毒顆粒釋放

18、：從被侵染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到外界，分為破胞釋放和芽生釋放噬菌體的吸附可逆吸附，無(wú)特異性，由隨機(jī)碰撞而吸附，靜電作用或氫鍵不可逆吸附，特異性，病毒表面蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合細(xì)菌抵抗噬菌體吸附的不同機(jī)制通過改變表面受體蛋白 通過產(chǎn)生 通過修飾抗原和抗原 噬菌體按照侵染方式可分為：裂解型：侵入相應(yīng)宿主細(xì)胞后正常復(fù)制并最終殺死細(xì)胞，形成裂解循環(huán)。溶源型（溫和型）：溫和噬菌體（溶源型）侵入相應(yīng)宿主細(xì)胞后，其基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中，隨其復(fù)制而同步復(fù)制，這種溫和噬菌體的侵入不會(huì)引起宿主細(xì)胞裂解。溫和噬菌體基因組稱為原噬菌體。存在形式有游離態(tài)和整合態(tài)原噬菌體作為細(xì)菌的調(diào)節(jié)開關(guān)原噬菌體作為基因開關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)菌宿主的毒力

19、原噬菌體作為基因開關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)菌宿主的自發(fā)突變率原噬菌體作為基因開關(guān)調(diào)節(jié)細(xì)菌宿主的生物被膜的形成CRISPR-CasCRISPR/Cas9基因編輯的魔法剪刀手 基因編輯是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可以對(duì)基因組完成精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)InDel突變、敲入、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的刪失等。目前，基因組編輯有三大技術(shù)：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。與傳統(tǒng)的TALEN和ZFN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更便捷、高效，應(yīng)用也更廣泛，目前該技術(shù)成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、斑馬魚、小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾。Case Study 1 有合理的假設(shè)(hypothesis)，設(shè)計(jì)合理可行的方案(

20、a sound and well designed experimental plan)，找到作用機(jī)理(confirm hypothesis)。最常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)斱案 ；前沿和熱門的領(lǐng)域 ；大量閱讀文獻(xiàn)，提煉科學(xué)假設(shè) ；課題組的前期工作積累 1. 提出科學(xué)的假設(shè)： CRISPR system versus Anti-CRISPR2. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)1：噬菌體JBD30存在anti-phage基因發(fā)現(xiàn)2：噬菌體JBD30上的35號(hào)基因提供anti-phage功能發(fā)現(xiàn)3：噬菌體JBD30-35基因可直接提供anti-CRISPR功能發(fā)現(xiàn)4：噬菌體JBD30-35在蛋白水平發(fā)揮作用發(fā)現(xiàn)5：JBD30-

21、35丌影響crRNA丏丌影響Cas功能Case Study 2 實(shí)驗(yàn)中遇到Unexpected結(jié)果，尋找原因，找到新的作用通路。潛在的新發(fā)現(xiàn) ；需要大量的陰性和陽(yáng)性試驗(yàn)證實(shí)unexpected 結(jié)果的可靠性 ；課題組的前期工作積累 在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜脅迫可以誘導(dǎo)CRISPR的功能Unexpected Result: 表達(dá)質(zhì)粒無(wú)法丟失了？證實(shí)表達(dá)質(zhì)粒被降解，突變后可以不被降解解釋原因：表達(dá)質(zhì)粒被CRISPR-cas系統(tǒng)降解機(jī)制的延伸：細(xì)菌的CRISPR-cas系統(tǒng)被激活的方式噬菌體療法的利與弊中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄呾和翻譯的過程，以及遺傳信息從

22、DNA傳遞給DNA的復(fù)制過程。這是所有有細(xì)胞結(jié) 構(gòu)癿生物所遵循的法則。 Promoter: RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合癿的DNA序列。 啟動(dòng)子是基因（gene）的一個(gè)組成部分，控制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）的起始時(shí)間和表達(dá)的程度。啟動(dòng)子就像“開兲”，決定基因的活動(dòng)?；蛲话l(fā) (mutation)一個(gè)基因內(nèi)部可以遺傳癿結(jié)構(gòu)癿改發(fā)，又稱為點(diǎn)突發(fā)，通?？梢鹨欢òm表型發(fā)化 。廣義癿突發(fā)包括染色體畸發(fā)，狹義癿突發(fā)與指點(diǎn)突發(fā)。實(shí)際上畸發(fā)呾點(diǎn)突發(fā)癿界限幵丌明確，特別是微細(xì)癿畸發(fā)更是如此。野生型基因通過突發(fā)成為突發(fā)型基因。突發(fā)型一詞既指突發(fā)基因，也指具有這一突發(fā)基因癿個(gè)體。原核生物的一般構(gòu)造及特性細(xì)胞壁（cell

23、wall）：細(xì)胞壁作用，固定細(xì)胞外形，提供保護(hù)作用。 不同類型的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組分也不同。所有已知癿海洋原核生物在質(zhì)膜外都有細(xì)胞壁。細(xì)菌細(xì)胞壁關(guān)鍵組份是肽聚糖，由兩種交替存在的氨基糖殘基（即N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸）以及少量氨基酸組成癿四肽側(cè)鏈構(gòu)成癿混合聚合物；古菌細(xì)胞壁成分發(fā)化較多，且不含真正的肽聚糖。原核生物基因組原核生物不像真核生物那樣具有完整的細(xì)胞核，其核物質(zhì)沒有特定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也不為核膜所包裹，較集中的分布在細(xì)胞質(zhì)的特定區(qū)域內(nèi)，稱作擬核。 p 海洋細(xì)菌和古菌的大部分基因組以單一環(huán)狀DNA分子癿形式存在。 p 擬核附于質(zhì)膜上，DNA的復(fù)制就在此處収生，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，膜的生長(zhǎng)導(dǎo)致了

24、子代擬核癿分裂。 遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)秱到另一細(xì)菌機(jī)制1. 接合作用：通過菌性毛移動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)到另一細(xì)菌。2. 當(dāng)細(xì)胞裂解后將DNA釋放到環(huán)境中時(shí)可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化 3. 細(xì)菌基因還可以通過噬菌體的普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)移原核生物的特殊構(gòu)造及特性莢膜和糖被：許多海洋原核生物在一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，可分泌一種粘液性的保外基質(zhì)，附著在細(xì)胞壁外，稱為糖被或糖萼。分為莢膜，微莢膜和粘液層等 海洋細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性：菌毛：許多細(xì)菌表面癿纖細(xì)癿頭収樣癿蛋白質(zhì)絲，約1微米纖毛：具有粘附性結(jié)構(gòu)的菌毛，較短，數(shù)目多，纖毛310微米鞭毛：一種從質(zhì)膜呾細(xì)胞壁伸出的絲狀，運(yùn)動(dòng)性附屬物。鞭毛較長(zhǎng)、數(shù)目少。長(zhǎng)約150微米。鞭毛的結(jié)構(gòu)核糖體開關(guān)：

25、蛋白質(zhì)的合成離丌開對(duì)mRNA的“翻譯”。在RNA序列中，有一部分被稱為“核糖開關(guān)”（riboswitch）的區(qū)域，它的狀態(tài)直接決定翻譯過程能否開始。突變：細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的改變，它包括單個(gè)堿基改發(fā)所引起的點(diǎn)突發(fā)，或多個(gè)堿基的缺失、重復(fù)和插入。 突變類型：分類的依據(jù)： p1. molecular nature of the defect（突發(fā)的本質(zhì)） 堿基替換；插入或缺失突變2 phenotypic effect- amino acid sequence of the protein is altered or not（突發(fā)引起的結(jié)果） 正向突變：由原始野生型基因變異為突變型基因反向突變；反之同義

26、突變：堿基改變，但由于密碼子的簡(jiǎn)并性導(dǎo)致編輯的氨基酸不變非同義突變：反之無(wú)義突變：突變導(dǎo)致形成終止子，阻斷氨基酸的翻譯，形成沒有功能的蛋白質(zhì)。中性突變：突變導(dǎo)致氨基酸的改變，但氨基酸的功能沒有變化功能缺失型突變：功能獲得型突變：條件性突變；致死型突變；抑制突變p3. the causative agent of the mutation （突發(fā)的原因） 自發(fā)性突變：自然環(huán)境發(fā)生的誘發(fā)性突變：化學(xué)修飾，（堿基修飾劑如脫氨、羥胺、烷化等、DNA插入劑如溴化乙錠、堿基類似物如5-溴尿嘧啶）物理?yè)p傷誘發(fā)突變，電離輻射、非電離輻射突變與適應(yīng)拉馬克主義：獲得性遺傳達(dá)爾文主義：DNA修復(fù)機(jī)制堿基切除修復(fù)錯(cuò)配

27、修復(fù)核酸切除修復(fù)生物膜突變Single-nucleotide polymorphism （SNP）單核苷酸多態(tài)性基因組水平上由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上?？股厥悄承┪⑸锏拇渭?jí)代謝產(chǎn)物或合成的類似物，在小劑量的情況下能抑制微生物的生長(zhǎng)和存活 ，對(duì)宿主不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性。 來(lái)源：生物合成、化學(xué)全合成、半合成（增加穩(wěn)定性；降低毒副作用；擴(kuò)大抗菌譜減少耐藥性；改善生物利用度提高療效 ）應(yīng)用：1. 抑制病原菌的生長(zhǎng) 用于治療細(xì)菌感染性疾病 2. 具有抗腫瘤活性 用于腫瘤的化學(xué)治療 3. 免疫抑制和刺激動(dòng)植物生長(zhǎng)作用 抗生素

28、不僅用于醫(yī)療，而且還應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和食品工業(yè)等方面 主要類別：作用機(jī)制：抗生素耐藥性是指細(xì)菌對(duì)藥物所具有的相對(duì)抵抗性。（固有耐藥性/獲得耐藥性），以該藥對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度表示。耐藥性機(jī)制：1.使抗生素分解或失去活性： 細(xì)菌產(chǎn)生一種或多種水解酶或鈍化酶來(lái)水解或修飾迚入細(xì)菌內(nèi)的抗生素使之失去生物活性。2. 使抗菌藥物作用的靶點(diǎn)發(fā)生改變：由于細(xì)菌自身發(fā)生突變或細(xì)菌產(chǎn)生某種酶的修飾使抗生素的作用靶點(diǎn)（如核酸或核蛋白）的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使抗菌藥物無(wú)法發(fā)揮作用。3. 細(xì)胞特性的改變：細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的改變或其它特性的改變使抗菌藥物無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)4. 細(xì)菌產(chǎn)生藥泵將進(jìn)入細(xì)胞的抗生素泵出細(xì)胞：細(xì)菌產(chǎn)生的一

29、種主動(dòng)運(yùn)輸方式，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出至胞外。5. 改變代謝途徑：如磺胺藥不對(duì)氨基苯甲苯酸（PABA），競(jìng)爭(zhēng)二氫喋酸合成酶而產(chǎn)生抑菌作用。耐藥性來(lái)源：固有耐藥性：是由細(xì)菌染色體基因決定、代代相傳，不會(huì)改變的，如鏈球菌對(duì)氨基糖苷類抗生素天然耐藥。獲得性耐藥性：由于細(xì)菌與抗生素接觸后，由質(zhì)粒介導(dǎo)，通過改變自身的代謝途徑，使其不被抗生素殺滅。如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶而耐藥。新抗生素三史大勇：蛋白質(zhì)，氨基酸，維生素蛋白質(zhì)的主要功能： 1、催化功能：酶催化生命過程中的一切生物化學(xué)變化，絕大多數(shù)酶是由蛋白質(zhì)組成的。 2、免疫防御作用：生物體能夠產(chǎn)生蛋白質(zhì)抗體，是防御外來(lái)細(xì)菌或病毒入侵的基本機(jī)制。 3

30、、轉(zhuǎn)運(yùn)功能：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠攜帶各種物質(zhì)通過細(xì)胞膜，維持正常的物質(zhì)交換過程。 4、調(diào)控作用：生物體內(nèi)的許多激素，如胰島素等以及它們的受體，大都是蛋白質(zhì)產(chǎn)生或構(gòu)成的，這些調(diào)控蛋白在許多生命過程中起著重要的調(diào)控作用。 5、形成生物體的基本形體結(jié)構(gòu)：如動(dòng)物的骨骼、肌肉、皮膚等物質(zhì)的成分。 6、運(yùn)動(dòng)功能：肌肉蛋白的拉伸和收縮產(chǎn)生各種形態(tài)的運(yùn)動(dòng)。 7、神經(jīng)刺激的產(chǎn)生和傳導(dǎo)：調(diào)節(jié)機(jī)體的生命活動(dòng)。羧酸分子中烴基上的一個(gè)或幾個(gè)氫原子被氨基取代生成的化合物叫氨基酸。八個(gè)必需氨基酸（一兩色素本來(lái)淡些）賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸。兩性離子（dipolarrion ，dipola

31、r ion）又稱為兼性離子（zwitterions），也稱為偶極離子，在同一個(gè)氨基酸分子上含有等量的正負(fù)兩種電荷，由于正負(fù)電荷相互中和而呈電中性。 等電點(diǎn)（isoelectric point）（PI）一個(gè)氨基酸總可以找到一個(gè)pH值，在該pH值下，正、負(fù)離子的濃度完全相等，此時(shí)向陽(yáng)極移動(dòng)和向陰極移動(dòng)的離子彼此抵消（即沒有凈的遷移），或者說，電場(chǎng)中不顯示離子的遷移。將此時(shí)的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。 氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng)1. 茚三酮反應(yīng)（ninhydrin reaction）：凡是有游離氨基的氨基酸都可以和茚三酮發(fā)生呈紫色的反應(yīng)。(例外：Pro黃色；Asn棕色)2. 桑格反應(yīng)（Sanger re

32、action）：氨基酸+DNFB-DNP-氨基酸（黃色），在弱堿性溶液中。 2，4-二硝基氟苯（DNFB ）；應(yīng)用于鑒定多肽鏈氨基末端的氨基酸。3. 艾德曼反應(yīng)(Edman reaction) ，也稱作艾德曼降解法（Edman degradation）； 異硫氰酸苯酯（PITC）+-氨基酸 苯氨基硫甲酰氨基酸 苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）+少一個(gè)殘基的肽（硝基甲烷溶劑中用甲酸處理）。 用于鑒定多肽鏈中的N-末端的氨基酸。氨基酸殘基（residue）：多肽鏈中氨基酸，參與肽鍵形成，已經(jīng)不是原來(lái)完整的氨基酸分子。殘基用某氨酰稱呼。 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可劃分為四級(jí)，以描述其不同的方面：一級(jí)結(jié)構(gòu)：組成蛋白質(zhì)多

33、肽鏈的線性氨基酸序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)：依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團(tuán)間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要為螺旋和折疊。超二級(jí)結(jié)構(gòu)：是指多肽鏈上若干相鄰的構(gòu)象單元彼此作用，進(jìn)一步組合成有規(guī)則的結(jié)構(gòu)組合體結(jié)構(gòu)域：是指存在于球狀蛋白質(zhì)分子中的兩個(gè)或多個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、在空間上能辯認(rèn)的三維實(shí)體，每個(gè)由二級(jí)結(jié)構(gòu)組合而成，充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。三級(jí)結(jié)構(gòu)：通過多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元素在三維空間的排列所形成的一個(gè)蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)：用于描述由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物分子。構(gòu)型和構(gòu)象構(gòu)型（configuration）:立體異構(gòu)體中取代原子（基團(tuán)）在空間的取向。構(gòu)型改變涉及共價(jià)鍵的形成與破壞

34、。構(gòu)象（conformation）:分子中原子的三維空間排列。單鍵旋轉(zhuǎn)時(shí)取代基團(tuán)可能形成的不同的立體結(jié)構(gòu)，僅涉及氫鍵的建立與破壞，不涉及共價(jià)鍵的變化。維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)作用力1、氫鍵：氫鍵是由多肽鏈中電負(fù)性很強(qiáng)的氮原子或氧原子與NH或OH的氫原子之間相互作用形成的一種吸引力。氨基酸中的=NH亞氨基、-C=O羰基和-OH羥基在蛋白質(zhì)中可形成氫鍵。氫鍵對(duì)維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起著極其重要的作用。 2、鹽鍵：是存在于蛋白質(zhì)中帶有正、負(fù)電荷的側(cè)鏈基團(tuán)之間的一種靜電吸引作用。如谷氨酸R基中的羧基；賴氨酸R基中的氨基；精氨酸R基上的胍基和組氨酸中的咪唑基等。 3、疏水作用：是由氨基酸中的非極

35、性疏水側(cè)鏈基團(tuán)相互接近而形成的一種作用力，如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸的側(cè)鏈都是疏水基團(tuán)，在水介質(zhì)中總是趨于避開水相而在分子內(nèi)部形成疏水區(qū)。4、范德華引力：是分子間弱的作用力。5、二硫鍵：二硫鍵是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中唯一的共價(jià)鍵，它是由一條或兩條多肽鏈中的兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基氧化后形成的。 6、配位鍵：兩個(gè)原子之間由單方面提供共用電子對(duì)形成的共價(jià)鍵稱為配位鍵。含有金屬離子的蛋白質(zhì)中，金屬離子與多肽鏈的連接往往是配位鍵。為什么蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體？1) 這是由于蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團(tuán)，如NH2、COOH、CONH2、OH、SH等，和水有高度親和性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇

36、時(shí)，很容易被吸附，在蛋白質(zhì)顆粒表面形成一層高密度水膜或稱水化層。水膜的存在使蛋白質(zhì)顆粒相互隔開，顆粒之間不會(huì)因碰撞而聚集成大顆粒。2) 在非等電點(diǎn)狀態(tài)時(shí)，相同蛋白質(zhì)顆粒表面帶有同性電荷，使顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互聚集變性作用在理化因素的影響下，天然蛋白質(zhì)分子內(nèi)部原有的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，其理化性質(zhì)和生物學(xué)功能都隨之改變或喪失，但并未導(dǎo)致一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，這種現(xiàn)象叫變性作用復(fù)性蛋白質(zhì)的變性作用如不過于劇烈，高級(jí)結(jié)構(gòu)松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)象，并恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性變構(gòu)效應(yīng)是指在寡聚蛋白分子中，一個(gè)亞基由于與其他分子結(jié)合而發(fā)

37、生構(gòu)象變化，并引起相鄰其他亞基的構(gòu)象和功能的改變。簡(jiǎn)述血紅蛋白與肌紅蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異同，簡(jiǎn)述其與氧結(jié)合情況。肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)構(gòu)上的不同之處：肌紅蛋白是單鏈蛋白，血紅蛋白是由四個(gè)亞基組成的寡聚蛋白，相同之處是：血紅蛋白的每個(gè)亞基和肌紅蛋白都具有相同的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 血紅蛋白和肌紅蛋白與氧結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出不同的結(jié)合模式。血紅蛋白的氧結(jié)合曲線是S形曲線；而肌紅蛋白的氧結(jié)合曲線是雙曲線。 S曲線說明在血紅蛋白分子與氧結(jié)合的過程中，其亞基之間存在相互作用。血紅蛋白四聚體在開始與氧結(jié)合時(shí)，其氧親和力很低，即與氧結(jié)合的能力很小。一旦其中一個(gè)亞基與氧結(jié)合，亞基的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并逐步引起其余亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變

38、，從而提高其余亞基與氧的親和力；同樣道理，當(dāng)一個(gè)氧與血紅蛋白亞基分離后，能降低其余亞基與氧的親和力，有助于氧的釋放。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定，第四個(gè)亞基與氧的親和力比第一個(gè)亞基大200-300倍。 血紅蛋白與氧結(jié)合的型曲線具有重要的生理意義。在肺部由于氧分壓高，脫氧血紅蛋白與氧的結(jié)合接近飽和；在肌肉中氧分壓低，氧合血紅蛋白與肌紅蛋白相比能釋放更多的氧，以滿足肌肉運(yùn)動(dòng)和代謝對(duì)氧的需求?？梢?，血紅蛋白比肌紅蛋白更適合運(yùn)輸氧。舉例說明蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。（簡(jiǎn)述）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是高級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。有相似一級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象和功能也有相似之處。如垂體前葉分泌的ACTH的第4至10個(gè)氨基酸殘

39、基與促黑激素（-MSH、-MSH）有相似序列，因此，ACTH有較弱的促黑激素作用。但蛋白質(zhì)分子關(guān)鍵活性部位氨基酸殘基的改變，可導(dǎo)致其功能改變。如鐮刀形紅細(xì)胞性貧血是因其Hb的-鏈上一個(gè)氨基酸發(fā)生改變所致（由正常的-6-Glu變?yōu)?6-Val）。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)，如Hb由T型（緊密型）變?yōu)镽型（疏松型），Hb與氧的親和力增大約200倍氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng)1. -NH2參加的反應(yīng)1. 1烷基化反應(yīng)1.1.1氨基酸與2,4-二硝基氟苯DNFB反應(yīng) 1.1.2氨基酸與苯異硫氰酸酯（PITC）反應(yīng)1.1.3含硫氨基酸的烷基化反應(yīng)-S-腺苷甲硫氨酸（SAM）1. 2?；磻?yīng)1.2.1氨基酸

40、的-氨基與適當(dāng)?shù)孽；瘎┳饔每梢缘玫锦０?1.2.2一個(gè)氨基酸分子的羧基與另外一個(gè)氨基酸分子的氨基發(fā)生?；磻?yīng)生成酰胺鍵-在蛋白質(zhì)化學(xué)中稱為肽鍵1.2.3酰氯或酸酐在微堿中溶液中的與氨基酸的?；磻?yīng)1. 3脫氨基反應(yīng)氨基酸在生物體內(nèi)經(jīng)氨基酸氧化酶的催化即脫去-氨基而轉(zhuǎn)變成酮酸1.4與亞硝酸反應(yīng)收集反應(yīng)放出的氮?dú)猓捎脕?lái)測(cè)定氨基酸的含量，這種測(cè)定氨基酸含量的方法稱為范斯萊克（Van slyke）氨基測(cè)定法。1.5形成西佛堿的反應(yīng)氨基酸的-氨基能與某些醛類化合物反應(yīng)生成弱堿（西佛堿）2.-羧基參加的反應(yīng) 2.1成鹽、成酯反應(yīng)2.2成酰氯的反應(yīng)氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰

41、氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。2.3疊氮反應(yīng)2.4脫羧基反應(yīng)將a-氨基酸加熱時(shí)，可脫去CO2得到胺3.-NH2和-COOH共同參加的反應(yīng)3.1與茚三酮反應(yīng)三酮在弱酸中與-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)（max=570nm）。3.2成肽反應(yīng)一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱肽鍵。4. 側(cè)鏈R基參加的反應(yīng) 4.1酪氨酸的酚羥基在3和5位上容易發(fā)生親電取代反應(yīng)，例如發(fā)生碘化或硝化，分別生成一碘酪氨酸和二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸。酪氨酸的酚基還可以與重氮化合物(例如對(duì)氨基苯磺酸的重氮鹽

42、)結(jié)合生成桔黃色的化合物。4.2組氨酸的側(cè)鏈咪唑基 與重氮苯磺酸也能形成相似的化合物，但顏色稍有差異，呈棕紅色。4.3精氨酸的側(cè)鏈胍基在硼酸鈉緩沖液(pH8-9, 25-35)中，與1，2-環(huán)己二酮反應(yīng)，生成縮合物一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本流程蛋白質(zhì)或多肽的水解1、酸性水解 得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分別為完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則完全被破壞，半胱氨酸不能從樣品中直接測(cè)定。酪氨酸部分被水解液中的痕量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解，損失分別為10%和5%2、堿性水解 多數(shù)氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破壞，其他的氨基酸外消旋化，僅色氨酸是穩(wěn)定的，所以此法僅限

43、于測(cè)定色氨酸的含量。3、酶水解 優(yōu)點(diǎn)是水解過程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。因?yàn)槊杆鈼l件溫和，對(duì)天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無(wú)破壞作用。 缺點(diǎn)是反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，水解的產(chǎn)物為較小的肽段，水解不完全。另外，因?yàn)槊副旧硪彩堑鞍踪|(zhì)，對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有干擾4.微波輻射能水解 微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全水解的時(shí)間大大縮短，在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時(shí)間可從過去的幾十小時(shí)縮短到幾十分鐘特殊氨基酸的保護(hù)色氨酸的保護(hù) 半胱氨酸的保護(hù) 蛋白質(zhì)的末端測(cè)定N-末端的測(cè)定 1. 二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法） 2. 二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法） 3

44、. 異硫氰酸苯酯法（PITC法、Edman法） 4. DABITC法 5. 氨肽酶法 C-末端的測(cè)定 1.羧肽酶法 2.硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法） 3.肼解法封閉N-末端的測(cè)定 1.乙?；疦-末端 2.吡咯烷酮羧酸末端 3.甲?；┒?肽鏈的部分降解：1、化學(xué)裂解法（溴化氰）；2、酶解法；3、羥胺裂解法；4、部分酸水解氨基的保護(hù)方法 1）叔丁氧基羧基（t-Boc）：t-Boc基是常用的氨基保護(hù)基。二叔丁基二碳酸酯與氨基酸作用形成t-Boc-氨基酸，可以有效地達(dá)到保護(hù)氨基的作用。2）芐氧羰基（CBz）: 肽鍵形成的方法 :氨基酸的-羧基不可能直接與氨基作用形成肽鍵，通常是采用下面兩種方法

45、進(jìn)行。（1） 羥基活化法 酰氯法：氨基酸的羧基可以轉(zhuǎn)變成酰氯： 酸酐法：氨基酸的羧基也可以轉(zhuǎn)變成活潑的酸酐基： ?；B氮法：此法的優(yōu)點(diǎn)是不易引起氨基酸消旋化。（2）活性酯法?；B氮在使用和儲(chǔ)存時(shí)容易分解，通常將它與N-羥基丁二酰亞胺反應(yīng)，產(chǎn)物是一種穩(wěn)定的結(jié)晶化合物，稱為“活性酯”小結(jié)：1、氨基的保護(hù)方法：叔丁氧基羧基，芐氧羰基。 2、羧基的保護(hù)方法：形成酯基。 3、肽鍵形成：羥基活化法（酰氯法、酸酐法、酰基疊氮法），活性酯。 4、偶聯(lián)劑和肽鍵的形成：碳二亞胺，Woodward 試劑。 5、多肽合成的策略：逐步增長(zhǎng)法，片段組合法。 6、多肽的固相合成：通常選擇聚苯乙烯為載體。 7、組合合成法合成

46、多肽：并行合成法，均分合成法。 8、酶促肽的合成：酶促半合成人工胰島。 組合合成法合成多肽簡(jiǎn)述。兩條途徑：并行合成法和均分合成法。前者合成速度較慢，合成容量小，現(xiàn)在已經(jīng)很少應(yīng)用。均分合成法是目前應(yīng)用最廣的一種方法。均分合成法的基本原理是：每一個(gè)合成步驟分別合成出x組中間體，混合均勻后再平均分成x份，分別延長(zhǎng)一個(gè)結(jié)構(gòu)單元。反應(yīng)產(chǎn)物再混合均分成x份，再延長(zhǎng)一個(gè)結(jié)構(gòu)單元，直至完成全部合成。eg：合成目標(biāo)：C-端為Ala，其他三個(gè)氨基酸組成為Glu，Phe和Lys的四肽。這種類型的四肽庫(kù)共有異構(gòu)體數(shù)目應(yīng)為33=27個(gè)。1、中心法則： 是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳

47、信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法則。 2、蛋白質(zhì)合成體系： l mRNA（遺傳信息的載體） l 遺傳密碼（密碼子）（連續(xù)性、簡(jiǎn)并性、通用性、方向性、擺動(dòng)性） l t RNA和氨基酸的活化 l rRNA和核蛋白體（多肽鏈合成場(chǎng)所） l 輔助因子（起始因子、延長(zhǎng)因子、釋放因子） l 供能物質(zhì)和無(wú)機(jī)離子（ATP、GTP、Mg2+、K+） 3.蛋白質(zhì)生物合成過程包括三個(gè)階段：氨基酸的活化與搬運(yùn)；氨基酸羧基的活化是通過與tRNA結(jié)合成氨基酸酰-tRNA而實(shí)現(xiàn)的（1）氨基酰-tRNA合成酶活化氨基酸在核蛋白體上的縮合 （起始 延

48、長(zhǎng) 終止）1.多肽鏈合成的起始：指mRNA和起始氨基酰-tRNA分別與核蛋白體結(jié)合而形成翻譯起始復(fù)合物的過程。（1）原核生物翻譯起始復(fù)合物形成 a. 核蛋白體大小亞基分離；b. mRNA在小亞基定位結(jié)合；c. 起始氨基酰-tRNA的結(jié)合； d. 核蛋白體大亞基結(jié)合（2）真核生物翻譯起始復(fù)合物形成 真核生物翻譯起始復(fù)合體的形成過程與原核生物類似，但參與的蛋白因子更多。 核蛋白體大小亞基分離； 起始氨基酰-tRNA結(jié)合； mRNA在核蛋白體小亞基就位； 核蛋白體大亞基結(jié)合。（3）真核與原核生物起始區(qū)別2. 肽鏈的延長(zhǎng)包括多肽鏈合成的進(jìn)位、成肽和轉(zhuǎn)位三步反應(yīng)（1）進(jìn)位（entrance）進(jìn)位又稱注冊(cè)

49、(registration)，即與mRNA下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的A位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF-T參與。（2）成肽（peptide bond formation）是由轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase)催化的肽鍵形成過程。即在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將P位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨?；螂孽；D(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其a-氨基縮合形成肽鍵。此步驟需Mg2+，K+。（3）轉(zhuǎn)位（translocation）延長(zhǎng)因子EF-G有轉(zhuǎn)位酶( translocase )活性，可結(jié)合并水解1分子GTP，促進(jìn)核蛋白體向mRNA的3'側(cè)移動(dòng)相當(dāng)于一個(gè)密碼的距離，同時(shí)使

50、肽酰基tRNA從A位移到P位。此步驟需GTP和Mg2+參與。此時(shí)，核蛋白體的A位留空，與下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA即可再進(jìn)入，重復(fù)以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長(zhǎng)。已失去蛋氨?；螂孽；膖RNA從核蛋白體E位上脫落。3. 肽鏈的終止核蛋白體沿mRNA鏈滑動(dòng)，不斷使多肽鏈延長(zhǎng)，直到終止信號(hào)進(jìn)入A位。（1）識(shí)別：RF識(shí)別終止密碼，進(jìn)入核蛋白體的A位。 （2）水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)轷ッ富钚?，多肽鏈與tRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。（3）脫離（釋放）：模板mRNA、RF以及空載tRNA與核蛋白體脫離多肽鏈合成后的加工修飾。 多肽鏈折疊為天然的三維結(jié)構(gòu)肽鏈；一級(jí)結(jié)構(gòu)的修飾；高級(jí)結(jié)構(gòu)

51、修飾4.多肽鏈合成的能量消耗4n1遺傳密碼（名詞解釋）DNA編碼鏈或mRNA上的核苷酸，以3個(gè)為一組（三聯(lián)體）決定1個(gè)氨基酸的種類，稱為三聯(lián)體密碼。mRNA的三聯(lián)體密碼是連續(xù)排列的，因此，mRNA的核苷酸序列可以決定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。論述遺傳密碼的特點(diǎn)1） 遺傳密碼為三聯(lián)體：模板從mRNA5端的起始密碼子開始，到3端的終止密碼稱為開放讀碼框架。在框架內(nèi)每3個(gè)堿基組成1個(gè)密碼子，決定1個(gè)氨基酸。（2）遺傳密碼的種類：遺傳密碼共64個(gè)，其中61個(gè)密碼子分別代表各種氨基酸。3個(gè)為肽鏈合成的終止信號(hào)。位于5端的AUG，除了代表甲硫蛋氨酸外，還是肽鏈合成的起始信號(hào)。（3）遺傳密碼的連續(xù)性：對(duì)mRNA分子

52、上密碼子的閱讀方法叫讀碼。正確讀碼是每3個(gè)相鄰堿基一組，不間斷地連續(xù)讀下去，直到出現(xiàn)終止密碼為止。mRNA上堿基的插入和缺失，可導(dǎo)致框移突變。（4）遺傳密碼的簡(jiǎn)并性：有61個(gè)密碼子代表20種氨基酸，每個(gè)密碼子只代表一種氨基酸，而多數(shù)氨基酸都有24個(gè)密碼子，這種由幾個(gè)密碼子編碼同一氨基酸的現(xiàn)象稱為簡(jiǎn)并性。從密碼表上可看出密碼子的第3位堿基通常是簡(jiǎn)并的。（5）遺傳密碼的擺動(dòng)性：指密碼子與反密碼子配對(duì)不遵從堿基配對(duì)規(guī)律，此不嚴(yán)格的配對(duì)關(guān)系稱為擺動(dòng)性。如丙氨酰 tRNA反密碼子的第1位堿基I可以與密碼子第3位的A、C或U配對(duì)。遺傳密碼的擺動(dòng)性使一種tRNA可以識(shí)別幾種代表同一種氨基酸的密碼子。（6）遺傳密碼的通用性：從細(xì)菌到人的遺傳密碼都市通用的，但近年發(fā)現(xiàn)哺乳類動(dòng)物線粒體的蛋白質(zhì)合成體系中有個(gè)別例外。如UAG不代表終止密碼子，而代表色氨酸；CUA不代表亮氨酸，而代表蘇氨酸。（7）遺傳密碼的防錯(cuò)系統(tǒng)：由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有4個(gè)密碼的氨基酸，其第三位的堿基被替換，仍編碼同一種氨基酸，從遺傳密碼表可以看出，只要遺傳密碼的第二位是U，則第一位和第三位不論怎么變化，其編碼的氨基酸總是疏水性的，如第二位是C，則其編碼的氨基酸是非極性的或極性不帶電荷的，若第二位為A或G，則編碼的氨基酸R基是親水性的，第一位是A或C