神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的變化

1、www.CRTER.org王雪君，等. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的變化神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的變化王雪君1，李 茂2(1青海省婦女兒童醫(yī)院神經(jīng)科，青海省西寧市 810007；2山東大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，山東省濟(jì)南市 276000)引用本文：王雪君，李茂. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的變化J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(45):6827-6833.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.021 ORCID: 0000-0002-2941-5977(

2、王雪君)文章快速閱讀：神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)流程王雪君，女，1969年生，漢族，1992年陜西省中醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，副主任醫(yī)師，主要從事兒童神經(jīng)病學(xué)方面研究。中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2016)45-06827-07稿件接受：2016-10-18將實(shí)驗(yàn)幼鼠分為對(duì)照組、腦脊髓炎模型組、腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組。觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠臨床癥狀的影響，各組幼鼠室管膜下區(qū)Brdu表達(dá)及皮質(zhì)區(qū)Brdu+/ GFAP+表達(dá)情況。 腦脊髓炎模型組、腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組制備實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠

3、模型。對(duì)照組和模型組幼鼠不予處理。對(duì)照組不作處理腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠在發(fā)病當(dāng)天起腹腔注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子(1 000 U/kg)，連用 7 d。 文題釋義：神經(jīng)生長(zhǎng)因子：是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用。神經(jīng)干細(xì)胞：具有分化為神經(jīng)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，能自我更新，并足以提供大量腦組織細(xì)胞的細(xì)胞群。是一類具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，它可以通過(guò)不對(duì)等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。需要強(qiáng)調(diào)的是，在腦脊髓

4、等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細(xì)胞類型產(chǎn)生的子代細(xì)胞種類不同，分布也不同。摘要背景：神經(jīng)生長(zhǎng)因子是一種具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)作用的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。目的：觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼年大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響。 方法：將3周齡Wistar幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、腦脊髓炎模型組、腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組，后2組建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組在發(fā)病當(dāng)天起腹腔注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子(1 000 U/kg)，共7 d，對(duì)照組和模型組幼鼠不予處理。觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠臨床癥狀的影響，以及各組幼鼠室管膜下區(qū)Brdu(神經(jīng)

5、干細(xì)胞標(biāo)記物)、皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+(星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物)的表達(dá)變化。 結(jié)果與結(jié)論：模型鑒定：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型幼鼠在免疫后10 d開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀，對(duì)照組未出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀；模型組幼鼠腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生破壞，炎癥細(xì)胞集中在血管周圍；對(duì)照組腦組織表現(xiàn)正常；臨床癥狀：腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組的癥狀持續(xù)時(shí)間低于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)，平均神經(jīng)功能評(píng)分低于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)；室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)：腦脊髓炎模型組幼鼠高于對(duì)照組(P < 0.05)，發(fā)病后7，21 d腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組

6、室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)顯著高于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)；皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)：腦脊髓炎模型組高于對(duì)照組(P < 0.05)，發(fā)病后7，21 d腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+的表達(dá)顯著高于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)；結(jié)果表明，自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型被成功建立，神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療能夠改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠的臨床癥狀，促3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；幼鼠；

7、星形膠質(zhì)細(xì)胞；治療主題詞：干細(xì)胞；神經(jīng)干細(xì)胞；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；腦脊髓炎；組織工程N(yùn)erve growth factor intervention triggers changes in the neural stem cells of experimental autoimmune encephalomyelitis ratsWang Xue-jun1, Li Mao2 (1Department of Neurology, Women and Childrens Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, Qinghai Province, Chin

8、a; 2Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Shandong University, Jinan 276000, Shandong Province, China)AbstractBACKGROUND: Nerve growth factor is a neurotrophic factor that is involved in the cell regulation and promotes the proliferation of neural stem cells.OBJECTIVE: To observe the ef

9、fect of nerve growth factor on neural stem cells of experimental autoimmune encephalomyelitis rats.METHODS: Wistar rats, 3 weeks of age, were randomly divided into control group, encephalomyelitis model group, nerve growth factor treatment group. Rat models of experimental autoimmune encephalomyelit

10、is were made in the latter two groups. On the day of onset, rats in the nerve growth factor treatment group were given intraperitoneal injection of 1 000 U/kg nerve growth factor for 7 continuous days, and rats in the other two groups given no treatment. Effects of nerve growth factor on clinical sy

11、mptoms of model rats were observed. Expression of Brdu in the subependymal zone and Brdu+/GFAP+ expression in the cortex were detected. RESULTS AND CONCLUSION: Rat models of experimental autoimmune encephalomyelitis appeared to have encephalomyelitis symptoms successively at the beginning of 10-day

12、immunization, while rats in the control group had no symptoms of encephalomyelitis. In the model group, glial cell hyperplasia, inflammatory cell infiltration, damage to vascular endothelial cell proliferation, and perivascular aggregation of inflammatory cells in the rat brain were found, while no

13、abnormal changes in the rat brain were found in the control group. Compared with the model group, the expression of Brdu in the subependymal zone and Brdu+/GFAP+ expression in the cortex were both higher in the model group (P < 0.05), and these expressions were also higher in the nerve growth fac

14、tor treatment group than the model group at 7 and 21 days after onset (P < 0.05). To conclude, these findings suggest that the rat model of autoimmune encephalomyelitis can be successfully established, and nerve growth factor treatment can improve clinical symptoms of experimental autoimmune ence

15、phalomyelitis rats by promoting the proliferation and differentiation of neural stem cells into astrocytes.Subject headings: Stem Cells; Neural Stem Cells; Nerve Growth Factor; Encephalomyelitis; Tissue EngineeringCite this article: Wang XJ, Li M. Nerve growth factor intervention triggers changes in

16、 the neural stem cells of experimental autoimmune encephalomyelitis rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(45): 6827-6833.Wang Xue-jun, Associate chief physician, Department of Neurology, Women and Childrens Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, Qinghai Province, China6831ISSN 2095-43

17、44 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction多發(fā)性硬化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種，病理特點(diǎn)為髓鞘發(fā)生炎癥損傷，并伴有軸索的丟失1-3，隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，多發(fā)性硬化的診斷率越來(lái)越高，多發(fā)性硬化是一種年輕人比較常見(jiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)4-6，多發(fā)性硬化的發(fā)生可能是環(huán)境因素和患者的遺傳易感性共同作用的結(jié)果，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病7-9。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是自身免疫性脫髓鞘病變的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)模型，其病理特征和免疫特征和多發(fā)性硬化相似，被作為多發(fā)性硬化的一種動(dòng)物模型10-13，多發(fā)性硬化的發(fā)生可能原因?yàn)椋?/p>

18、激活外周針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身攻擊性細(xì)胞而誘發(fā)多發(fā)性硬化的啟動(dòng)；正常的免疫調(diào)節(jié)功能失調(diào)；發(fā)生炎癥反應(yīng)引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷14-15。因此，治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的途徑有以下幾種：抑制炎癥反應(yīng)；調(diào)節(jié)趨化分子；影響炎癥因子的釋放和免疫細(xì)胞的激活；增加神經(jīng)保護(hù)因子16。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是一種具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)作用的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育和生長(zhǎng)具有調(diào)控作用，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受損傷，對(duì)神經(jīng)元的再生和修復(fù)具有重要作用17-18。神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)免疫系統(tǒng)也具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用19，可用于難治性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。文章構(gòu)建急性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型，通過(guò)觀

19、察幼鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Brdu及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)變化，探討神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的影響，為臨床治療提供基礎(chǔ)依據(jù)。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 于2013年10月至2015年4月在青海省婦女兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室完成。1.3 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)、3周齡、健康Wistar大鼠42只，體質(zhì)量80-100 g，雌性；豚鼠10只，體質(zhì)量340-380 g，雌性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

20、。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室幼鼠專用鼠籠，按照實(shí)驗(yàn)幼鼠標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。主要試劑和儀器：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(武漢海特生物制藥股份有限公司)；水合氯醛(美國(guó)Sigma公司)；PBS(北京中山生物技術(shù)公司)；完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)；百日咳疫苗(北京生物制品研究所)；Brdu(美國(guó)Sigma公司)；多聚甲醛(北京中山生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；正常馬封閉血清(美國(guó)Sigma公司)；小鼠抗Brdu單克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)；馬抗小鼠IgG抗體(美國(guó)Sigma公司)；辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(美國(guó)Sigma公司)；DAB顯色試劑

21、盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；堿磷酶標(biāo)記親和素(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；BICP/NBT顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；正常山羊非免疫血清(美國(guó)Sigma公司)；兔抗大鼠GFAP多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)；超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)公司)；圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技公司)；恒冷箱切片機(jī)(英國(guó) SHANDON公司)；恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)。1.4 方法1.4.1 制備完全抗原 將豚鼠用水合氯醛麻醉后，備皮，消毒，切開(kāi)皮膚，剝離皮膚和肌肉，剪開(kāi)椎管和枕骨，取出脊髓，去掉脊膜和馬尾，加入生理鹽水制成脊髓勻漿，再和相同體積的完全弗氏佐劑混合制成油包水乳劑。1.4

22、.2 建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型 將Wistar幼鼠麻醉成功后，將百日咳疫苗注射至幼鼠的左后足背(0.05 mL/只)，然后在幼鼠的4足足墊注射豚鼠脊髓勻漿和完全弗氏佐劑混合液(0.02 mL/只)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為體質(zhì)量下降、皮毛不光滑、食欲不振、雙后肢步態(tài)笨拙、活動(dòng)不靈活。1.4.3 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型幼鼠的神經(jīng)功能評(píng)分 將免疫接種的當(dāng)天算免疫接種0 d，接種后幼鼠給予自由飲水和進(jìn)食，每天對(duì)所有實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，神經(jīng)功能評(píng)分獲2分以上者為發(fā)病。5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)如下2-3：0分為不發(fā)病，1分為尾巴無(wú)力，2分為輕微后肢無(wú)力，3分為嚴(yán)重后肢麻痹

23、，4分為四肢麻痹，5分為瀕死或死亡。1.4.4 實(shí)驗(yàn)幼鼠分組 將42只幼鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，對(duì)照組6只，腦脊髓炎模型組18只，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組18只；其中腦脊髓炎模型組又分為發(fā)病3 d組(6只)、發(fā)病7 d組(6只)、發(fā)病21 d組(6只)；腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組也分為發(fā)病3 d組(6只)、發(fā)病7 d組(6只)、發(fā)病21 d組(6只)。腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠在發(fā)病當(dāng)天起腹腔注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (1 000 U/kg)，連用7 d，對(duì)照組和模型組幼鼠不予處理。1.4.5 標(biāo)本采集和增殖細(xì)胞標(biāo)記 腦脊髓炎模型組及腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠均在發(fā)病3，7，21 d時(shí)取材

24、。增殖的神經(jīng)干細(xì)胞采用Brdu標(biāo)記，將Brdu經(jīng)生理鹽水稀釋后，在幼鼠處死前2 d給予腹腔注射Brdu (60 mg/kg)，1次/d，共2 d。取材方法為：將幼鼠麻醉成功后，打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)右心耳，灌注生理鹽水只流出液清亮，再灌注多聚甲醛至幼鼠尾巴和四肢僵直，1 h后取出腦組織，在多聚甲醛中固定，石蠟包埋，制成4 m厚的切片。1.4.6 腦組織蘇木精-伊紅染色 將腦組織標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇脫水，明礬蘇木精染色，蒸餾水沖洗，鹽酸乙醇分紅，蒸餾水沖洗反藍(lán)，伊紅復(fù)染，乙醇分紅，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。1.4.7 腦組織室管膜下區(qū)Brdu免疫組化染色 二甲苯脫蠟，乙醇脫水，PBS洗滌，H2O2孵育

25、，PBS洗滌，HCl孵育，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，PBS洗滌，加入正常馬封閉血清孵育，加入小鼠抗Brdu單克隆抗體過(guò)夜孵育，PBS洗滌，加入馬抗小鼠IgG抗體孵育，PBS洗滌，加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液孵育，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯進(jìn)行透明，中性樹(shù)膠進(jìn)行封固。陰性對(duì)照組取PBS替代一抗。1.4.8 腦組織皮質(zhì)區(qū)Brdu/GFAP免疫組化染色 二甲苯脫蠟，乙醇脫水，PBS洗滌，HCl孵育，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，PBS洗滌，加入正常馬封閉血清孵育，加入小鼠抗Brdu單克隆抗體過(guò)夜孵育，PBS洗滌，加入馬抗小鼠IgG抗體孵育，PBS洗滌，加入堿磷酶標(biāo)記親和素

26、孵育，PBS洗滌，BICP/NBT顯色，PBS洗滌，H2O2孵育，PBS洗滌，加入正常山羊非免疫血清孵育，加入兔抗大鼠GFAP多克隆抗體孵育，PBS洗滌，加入山羊抗兔IgG抗體孵育，PBS洗滌，加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液孵育，PBS洗滌，AEC顯色，PBS洗滌，ClearmountTM封固。1.4.9 圖像采集 用顯微攝影圖像分析系統(tǒng)采集圖片，每只幼鼠選擇5張標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。1.5 主要觀察指標(biāo) 神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠臨床癥狀的影響；各組幼鼠室管膜下區(qū)Brdu表達(dá)情況；各組幼鼠皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)

27、方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，取P=0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。2 結(jié)果 Results 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 納入Wistar幼鼠42只，隨機(jī)分為3組，全部進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)脫失。 2.2 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型的建立和鑒定行為學(xué)改變：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠在免疫后出現(xiàn)食欲減退，體質(zhì)量下降，在免疫后10 d出現(xiàn)第1例發(fā)病，隨后幼鼠陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病時(shí)間集中在免疫后12-13 d，發(fā)病的表現(xiàn)一般為先出現(xiàn)活動(dòng)不靈活，步態(tài)笨拙，癥狀不斷加重，最后出現(xiàn)后肢癱瘓。對(duì)照組大鼠體質(zhì)量隨著生長(zhǎng)不斷增加，觀察1個(gè)月沒(méi)有出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀。蘇

28、木精-伊紅染色結(jié)果：實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠的腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞增生，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生破壞，炎癥細(xì)胞呈“袖套”狀集中在血管周圍(見(jiàn)圖1)。對(duì)照組的腦組織表現(xiàn)正常。2.3 神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠臨床癥狀的影響 在神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療后第21天時(shí)對(duì)腦脊髓炎模型組幼鼠和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的臨床癥狀進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的癥狀持續(xù)時(shí)間明顯低于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的平均神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)，見(jiàn)表1。表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療能夠改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦

29、脊髓炎幼鼠的臨床癥狀。2.4 腦脊髓炎模型組和對(duì)照組幼鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Brdu表達(dá)情況比較 由表2看出，腦脊髓炎模型組幼鼠的室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)均高于對(duì)照組 (P < 0.05)，其中以腦脊髓炎發(fā)病后3 d組幼鼠的室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)最高，明顯高于腦脊髓炎發(fā)病7 d組、腦脊髓炎發(fā)病21 d組和對(duì)照組(P < 0.05)。2.5 腦脊髓炎模型組和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物Brdu表達(dá)情況比較由表3看出，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠腦脊髓炎發(fā)病7 d和21 d組時(shí)室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)均顯著高于腦脊髓炎模型組，差異有顯著性意義(P

30、< 0.05)，其中腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠以腦脊髓炎發(fā)病后7 d組的室管膜下區(qū)Brdu表達(dá)最高，顯著高于腦脊髓炎發(fā)病3 d組和21 d組(P < 0.05)。2.6 腦脊髓炎模型組和對(duì)照組幼鼠皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)情況比較 由表4看出，腦脊髓炎模型組幼鼠的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)高于對(duì)照組(P < 0.05)，其中以腦脊髓炎發(fā)病后3 d組幼鼠的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)最高，明顯高于腦脊髓炎發(fā)病21 d組和對(duì)照組(P < 0.05)。2.7 腦脊髓炎模型組和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)情況比較 由表5看出

31、，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠腦脊髓炎發(fā)病7 d組和21 d組的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)均顯著高于腦脊髓炎模型組(P < 0.05)，其中腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠以腦脊髓炎發(fā)病后7 d組的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)最高，顯著高于腦脊髓炎發(fā)病3 d組和21 d組(P < 0.05)。3 討論 Discussion多發(fā)硬化癥是一種T細(xì)胞引起一種自身免疫性疾病20，主要發(fā)生在青少年人群中，女性多于男性，發(fā)病多與患者的自身免疫調(diào)節(jié)功能異常有關(guān)21，目前尚沒(méi)有 B A表3 腦脊髓炎模型組和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的Brdu表達(dá)情況比較 (±s，n=6)T

32、able 3 Expression of Brdu expression in the subependymal zone in the model and nerve growth factor treatment groups時(shí)間腦脊髓炎模型組腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組tP發(fā)病后3 d43.45±2.7539.23±3.021.7350.438發(fā)病后7 d32.17±2.1450.22±6.2410.4860.000發(fā)病后21 d 18.32±1.7932.15±3.769.3470.000圖1 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎及對(duì)照組幼

33、鼠腦組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果(×100)Figure 1 Hematoxylin-eosin staining of the brain tissue in experimental autoimmune encephalomyelitis and control rats圖注：圖A為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠腦組織；B為對(duì)照組幼鼠腦組織。表4 腦脊髓炎模型組和對(duì)照組幼鼠的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)情況比較 (±s，n=6)Table 4 Expression of Brdu+/GFAP+ expression in the cortex in the model

34、and control groups表注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與腦脊髓炎發(fā)病3 d比較，bP < 0.05。組別Brdu+/GFAP+細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)照組2.38±1.35b腦脊髓炎模型組 3 d20.78±3.01a7 d19.34±2.43a21 d7.21±1.64ab表1 腦脊髓炎模型組和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的臨床癥狀比較 (±s，n=6)Table 1 Comparison of clinical symptoms of encephalomyelitis between model and nerve

35、growth factor treatment groups指標(biāo)腦脊髓炎模型組腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組tP癥狀持續(xù)時(shí)間(d)13.14±2.118.77±1.7911.4860.000平均神經(jīng)功能評(píng)分(分)4.01±0.142.78±0.1814.7350.000表5 腦脊髓炎模型組和腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)情況比較 (±s，n=6)Table 5 Expression of Brdu+/GFAP+ expression in the cortex in the model and nerve growt

36、h factor treatment groups表2 腦脊髓炎模型組和對(duì)照組幼鼠室管膜下區(qū)的Brdu表達(dá)情況比較 (±s，n=6)Table 2 Expression of Brdu expression in the subependymal zone in the model and control groups表注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與腦脊髓炎發(fā)病3 d比較，bP < 0.05。組別Brdu表達(dá)對(duì)照組14.11±1.98b腦脊髓炎模型組 3 d43.45±2.75a7 d32.17±2.14ab21 d18.32

37、77;1.79ab時(shí)間腦脊髓炎模型組腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組tP發(fā)病后3 d 20.87±3.0222.54±3.51.4530.634發(fā)病后7 d 19.47±2.6431.49±3.5813.8430.000發(fā)病后21 d 7.46±1.2519.33±2.9611.3760.000表注：與對(duì)照組比較，aP < 0.05；與腦脊髓炎發(fā)病3 d比較，bP < 0.05。非常有效的治療方法。目前認(rèn)為多發(fā)性硬化癥的發(fā)病有兩個(gè)時(shí)期：炎癥反應(yīng)時(shí)期和變性時(shí)期22，調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的免疫性T淋巴細(xì)胞，可以糾正機(jī)體的免疫功能異常，達(dá)到治

38、療多發(fā)性硬化的目的23，遺傳因素在多發(fā)性硬化癥的發(fā)病中也發(fā)揮著一定作用24-25，雙胞胎人群的發(fā)病率高于正常人群26-28，多發(fā)性硬化癥的發(fā)病可能為免疫功能異常和遺傳因素共同作用的結(jié)果。多發(fā)性硬化癥的發(fā)病率和寒冷程度有關(guān)，在比較寒冷的地區(qū)發(fā)病率比較高29，多發(fā)病硬化癥和分子遺傳也有一定的關(guān)系，分子遺傳因素在多發(fā)硬化癥患者的免疫調(diào)節(jié)和自我識(shí)別方面發(fā)揮重要作用30-31。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是比較理想的多發(fā)硬化癥的動(dòng)物模型，被廣泛應(yīng)用于多發(fā)硬化癥的實(shí)驗(yàn)研究。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以和相應(yīng)的受體結(jié)合促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡32-34。神經(jīng)生長(zhǎng)因

39、子的功能主要為維持膽堿能神經(jīng)元的存活，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)元和外周神經(jīng)元的發(fā)育和生長(zhǎng)，并維持神經(jīng)元的活性35。神經(jīng)生長(zhǎng)因子為水溶性，分子量比較大，正常情況下難以通過(guò)血腦屏障，采用納米技術(shù)制備的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠通過(guò)血腦屏障，并且能夠改善學(xué)習(xí)和記憶能力36，甘露醇靜脈滴注能夠暫時(shí)開(kāi)放血腦屏障，提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的療效37。神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病，神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療阿爾茨海默病能夠改善患者的臨床癥狀，副反應(yīng)比較小38，神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)外周神經(jīng)損傷有具有一定的治療效果39，可以治療糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變。Brdu是一種胸腺嘧啶脫核尿苷類似物，在細(xì)胞增殖州的S期嵌入細(xì)胞核的DNA，

40、是有增殖活性細(xì)胞的標(biāo)志物，故其陽(yáng)性細(xì)胞表示新生成的神經(jīng)干細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型，觀察神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠臨床癥狀的影響，并動(dòng)態(tài)觀察各組幼鼠室管膜下區(qū)Brdu表達(dá)及皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組幼鼠在免疫后出現(xiàn)食欲減退，體質(zhì)量下降，在免疫后10 d出現(xiàn)第1例發(fā)病，隨后幼鼠陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為先出現(xiàn)活動(dòng)不靈活，步態(tài)笨拙，癥狀不斷加重，最后出現(xiàn)后肢癱瘓。對(duì)照組幼鼠沒(méi)有出現(xiàn)腦脊髓炎癥狀。蘇木精-伊紅染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎幼鼠的腦組織中膠質(zhì)細(xì)胞增生，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生破壞，炎癥細(xì)胞呈“袖套”狀集中在血管

41、周圍；而對(duì)照組的腦組織表現(xiàn)正常。腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的癥狀持續(xù)時(shí)間明顯低于腦脊髓炎模型組，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠的平均神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于腦脊髓炎模型組。室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)方面，腦脊髓炎模型組幼鼠的室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)高于對(duì)照組；腦脊髓炎發(fā)病后3 d組幼鼠的室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)高于腦脊髓炎發(fā)病7 d組、腦脊髓炎發(fā)病 21 d組和對(duì)照組；腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠腦脊髓炎發(fā)病7 d組和21 d組室管膜下區(qū)Brdu的表達(dá)均明顯高于腦脊髓炎模型組，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠以腦脊髓炎發(fā)病后7 d組的室管膜下區(qū)Brdu表達(dá)水平最高。腦脊髓炎模型組幼鼠腦脊髓炎發(fā)病

42、3 d組、7 d組和21 d組的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，以腦脊髓炎發(fā)病后3 d組幼鼠的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)水平最高；腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠腦脊髓炎發(fā)病3 d組和7 d組的皮質(zhì)區(qū)Brdu+/GFAP+表達(dá)均明顯高于腦脊髓炎模型組，腦脊髓炎神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療組幼鼠以腦脊髓炎發(fā)病后7 d組的Brdu+/GFAP+表達(dá)水平最高。由此可見(jiàn)，自身免疫性腦脊髓炎幼鼠模型被成功建立，神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎能夠改善模型幼鼠的臨床癥狀，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖并分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。作者貢獻(xiàn)：2位作者均參與文章的設(shè)計(jì)、實(shí)施和評(píng)估，均經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)。利益沖突：所

43、有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。實(shí)驗(yàn)方案中有關(guān)動(dòng)物倫理問(wèn)題已經(jīng)青海省婦女兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)。文章查重：文章出版前已經(jīng)過(guò)CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)研究和撰寫(xiě)的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù))記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)

44、人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 梁雪梅.多發(fā)性硬化癥的臨床分析J.中國(guó)醫(yī)藥指南,2014, 12(10):258-259.2 郭柳彩,陳瑩.神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療周圍性面癱的系統(tǒng)評(píng)價(jià)J.當(dāng)代醫(yī)學(xué),2011,17(10):110-112.3 Lamers I, Maris A, Severijns D,et al.Upper Limb Rehabilitation in People With Multiple Sclerosis: A Systematic Review.Neurorehabil Neural Repair. 2016. pii:1545968315624

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