高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用

1、會(huì)計(jì)學(xué)1高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用高效液相色譜在制藥行業(yè)中的應(yīng)用第1頁(yè)/共76頁(yè)第2頁(yè)/共76頁(yè) 北京創(chuàng)新通恒科技有限公司是一家面向全球的專(zhuān)業(yè)HPLC企業(yè)，主要致力于高效液相色譜系統(tǒng)研制、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和銷(xiāo)售。 創(chuàng)建于2000年，公司總部位于北京市海淀區(qū)中關(guān)村高科技園區(qū)上地信息產(chǎn)業(yè)基地，是一家極具創(chuàng)造力的國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)。十年來(lái)一直秉承“精益求精，追求品質(zhì)，值得信賴(lài)”傳統(tǒng)，根據(jù)用戶(hù)需求，在用戶(hù)關(guān)鍵領(lǐng)域進(jìn)行持續(xù)的技術(shù)研發(fā)。 我們擁有卓越的技術(shù)團(tuán)隊(duì)和專(zhuān)家級(jí)的一流研發(fā)人才，“CXTH DAC800工業(yè)化生產(chǎn)型HPLC系統(tǒng)”研發(fā)投產(chǎn)，將中國(guó)工業(yè)化色譜系統(tǒng)推向世界前列，這是中國(guó)大型純化分離研發(fā)領(lǐng)域的一

2、座里程碑；“CXTH Kilotide500 DNA合成儀”投入使用，彌補(bǔ)中國(guó)大型合成設(shè)備領(lǐng)域的空白。 第3頁(yè)/共76頁(yè)第4頁(yè)/共76頁(yè)第5頁(yè)/共76頁(yè)第6頁(yè)/共76頁(yè)北京創(chuàng)新通恒科技有限公司北京創(chuàng)新通恒科技有限公司北京鋼臣科技有限公司總經(jīng)理辦公室開(kāi)發(fā)部財(cái)務(wù)部營(yíng)銷(xiāo)事業(yè)部中小設(shè)備加工中心應(yīng)用技術(shù)發(fā)展部工業(yè)化設(shè)備加工中心上海辦事處成都辦事處廣州辦事處售后技術(shù)支持中心第7頁(yè)/共76頁(yè)第8頁(yè)/共76頁(yè)第9頁(yè)/共76頁(yè)第10頁(yè)/共76頁(yè)第11頁(yè)/共76頁(yè)第12頁(yè)/共76頁(yè)21.858 125.957 253.634 3-20020406080100120140160180mV71421283542495

3、6637077min第13頁(yè)/共76頁(yè)19.79820.73821.61822.99124.07225.65526.91333.38842.358020406080100120140mV6121824303642485460min第14頁(yè)/共76頁(yè) 第15頁(yè)/共76頁(yè) 第16頁(yè)/共76頁(yè) 第17頁(yè)/共76頁(yè)第18頁(yè)/共76頁(yè)DISCOVERY ACTIVE COMPONENT發(fā)現(xiàn)活性發(fā)現(xiàn)活性第19頁(yè)/共76頁(yè)中藥提取物或發(fā)酵液等的分析譜圖0.5862.4182.9283.7824.0684.5365.2366.6636.9947.9338.77510.11211.33013.36315.658

4、17.61618.78820.04220.89422.70824.17626.54228.57729.74030.97832.93534.88337.24438.25439.30940.51842.35744.26846.96248.88449.74851.37454.71857.30058.94659.833-5051015202530354045mV510152025303540455055min第20頁(yè)/共76頁(yè)0.5862.4182.9283.7824.0684.5365.2366.6636.9947.9338.77510.11211.33013.36315.65817.61618.7

5、8820.04220.89422.70824.17626.54228.57729.74030.97832.93534.88337.24438.25439.30940.51842.35744.26846.96248.88449.74851.37454.71857.30058.94659.833-5051015202530354045mV510152025303540455055min用半制備色譜系統(tǒng)，對(duì)可能具有生物活性的組分，多次進(jìn)樣，分段制備幾十毫克做活性研究，最終確定活性組分第21頁(yè)/共76頁(yè)第22頁(yè)/共76頁(yè)第23頁(yè)/共76頁(yè)0.6280.9201.0891.3221.5311.6591.

6、9112.2132.3342.4822.7282.8433.0873.7293.9134.1825.0135.4526.0017.0427.5208.5788.8029.68010.35811.33812.89514.28615.86116.89720.63222.31854.02372.02578.5460200400600800100012001400mV8162432404856647280min第24頁(yè)/共76頁(yè) 小試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：小試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：方法的放大及標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品的制備。方法的放大及標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品的制備。第25頁(yè)/共76頁(yè)中試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：中試級(jí)制備色譜系統(tǒng)：年產(chǎn)公斤

7、級(jí)至百公斤級(jí)年產(chǎn)公斤級(jí)至百公斤級(jí)第26頁(yè)/共76頁(yè)DAC800 型工業(yè)化色譜：型工業(yè)化色譜：年產(chǎn)噸級(jí)年產(chǎn)噸級(jí)第27頁(yè)/共76頁(yè)第28頁(yè)/共76頁(yè)第29頁(yè)/共76頁(yè)第30頁(yè)/共76頁(yè)第31頁(yè)/共76頁(yè)色譜柱的選擇色譜柱的選擇第32頁(yè)/共76頁(yè)第33頁(yè)/共76頁(yè)1.ODS（C18）應(yīng)用范圍最廣的填料，大部分小分子有機(jī)化合物都可進(jìn)行分析2.C8、C4保留要比C18弱，適合用于大分子的多肽和蛋白類(lèi)的分離純化3.氨基柱正反雙模式，主要用于小分子糖類(lèi)化合物4.苯基柱通常用于分離含苯環(huán)的化合物5.氰基柱正反雙模式，和ODS基不同的色譜間作用力，因而氰基柱擁有獨(dú)特的選擇性6.正向硅膠7.環(huán)糊精根據(jù)物質(zhì)光學(xué)性質(zhì)

8、的不同進(jìn)行手性分離第34頁(yè)/共76頁(yè)六通閥的構(gòu)造六通閥的構(gòu)造a. a. Load狀態(tài)狀態(tài)b. b. Inject狀態(tài)狀態(tài) 自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器第35頁(yè)/共76頁(yè)為保證重現(xiàn)性以及峰形為保證重現(xiàn)性以及峰形等，很多情況下需要使等，很多情況下需要使用柱溫箱來(lái)控制柱溫。用柱溫箱來(lái)控制柱溫。第36頁(yè)/共76頁(yè)第37頁(yè)/共76頁(yè)第38頁(yè)/共76頁(yè)分析型色譜：線(xiàn)性色譜指組分在固定性和流動(dòng)相中的平衡濃度呈正比例關(guān)系，即吸附（分配）等溫線(xiàn)為一條直線(xiàn)。用于分離和鑒別樣品中的組分，為此希望能在盡可能小的進(jìn)樣量下，提供盡可能高的組分分辨率。制備色譜：非線(xiàn)性色譜在制備色譜中，進(jìn)樣量一般都比較大，例如在克量級(jí)范圍，這時(shí)樣品

9、在流動(dòng)相和固定相中的比例不再是正比例的關(guān)系，相對(duì)應(yīng)的吸附（分配）等溫線(xiàn)將發(fā)生彎曲。用于分離、富集或純化混合物中的某一或某些組分，為此需要一定的處理量，一般進(jìn)樣量比分析型色譜大得多。能有適當(dāng)?shù)姆蛛x度，并要考慮層析分離過(guò)程的規(guī)模、速率和分離成本。第39頁(yè)/共76頁(yè)線(xiàn)性色譜線(xiàn)性色譜分析分析制備制備非線(xiàn)性色譜非線(xiàn)性色譜理論的放大：非線(xiàn)性色譜第40頁(yè)/共76頁(yè)制制備備色色譜譜峰峰型型第41頁(yè)/共76頁(yè)色譜峰型不再對(duì)稱(chēng)色譜峰型不再對(duì)稱(chēng)色譜峰的保留時(shí)間隨著進(jìn)樣濃度而變化色譜峰的保留時(shí)間隨著進(jìn)樣濃度而變化色譜峰高度（峰面積）與色譜峰高度（峰面積）與進(jìn)樣濃度不成正比進(jìn)樣濃度不成正比非非線(xiàn)線(xiàn)性性色色譜譜的的特特點(diǎn)

10、點(diǎn)第42頁(yè)/共76頁(yè)濃度超載進(jìn)樣體積超載進(jìn)樣PKLangmuir型容量因子降低，峰形從高斯曲線(xiàn)變?yōu)槿切翁岣邩悠返臐舛?，保持進(jìn)樣體積不變；取決于組分在流動(dòng)相中的溶解度峰高不變，峰變寬并呈矩形取決于進(jìn)樣體積，生產(chǎn)效率決定于制備柱直徑，需要小顆粒填料理論的放大：過(guò)載進(jìn)樣第43頁(yè)/共76頁(yè)第44頁(yè)/共76頁(yè)此法時(shí)需很謹(jǐn)慎。第45頁(yè)/共76頁(yè)分析制備應(yīng)用范圍定性、定量檢測(cè)樣品的組成定性分析：檢測(cè)的靈敏度定量分析：分離度、再現(xiàn)性 從混合物中提取、分離、純化樣品樣品中特定成分的高純度獲取，大量、廉價(jià)的制備 填料粒徑5um10um流速0.001-9.999ml/min10080000ml/min進(jìn)樣量0.0

11、1-2mg1-500000mg管路1/16”1/8”1/4進(jìn)樣方式進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥或進(jìn)樣泵流動(dòng)相不回收回收分離方式線(xiàn)性非線(xiàn)性第46頁(yè)/共76頁(yè)第47頁(yè)/共76頁(yè)更大的容更大的容器：儲(chǔ)罐器：儲(chǔ)罐流量更大的流量更大的輸液泵輸液泵50ml定量管定量管1ml進(jìn)樣泵進(jìn)樣泵50ml10mm法蘭柱法蘭柱DAC大體積流大體積流通池通池接溶劑回接溶劑回收系統(tǒng)收系統(tǒng)制備系統(tǒng)制備系統(tǒng)第48頁(yè)/共76頁(yè)分析制備放放大大優(yōu)化分析方法的選擇性?xún)?yōu)化分析方法的選擇性在分析柱上進(jìn)行在分析柱上進(jìn)行超量載樣超量載樣放大到制備柱放大到制備柱設(shè)備的放大：過(guò)程第49頁(yè)/共76頁(yè)原料分析分析柱模擬制備放大至半制備（50DAC）中試放大（150

12、 or 200DAC)工業(yè)化制備（300- 800DAC)完全線(xiàn)性放大第50頁(yè)/共76頁(yè)可完全線(xiàn)性放大原因：可達(dá)到3000030000每米的塔板數(shù)，幾乎與10um10um填料的分析柱柱效相當(dāng)800DAC800DAC柱效測(cè)試結(jié)果圖第51頁(yè)/共76頁(yè)上樣量的調(diào)整：上樣量的調(diào)整：mp/ma=lp/la * rp /raL:柱長(zhǎng)；柱長(zhǎng)；m：進(jìn)樣量；：進(jìn)樣量；r：色譜柱內(nèi)徑：色譜柱內(nèi)徑 p: 制備柱；制備柱；a：分析柱：分析柱重點(diǎn)122設(shè)備的放大：公式第52頁(yè)/共76頁(yè)流速的調(diào)整：流速的調(diào)整：Fp/Fa = Vp/Va = Lp/La * rp /raF ：流速：流速 ；V:柱體積；柱體積；L:柱長(zhǎng)；柱

13、長(zhǎng)；r：色譜柱內(nèi)徑；：色譜柱內(nèi)徑； p: 制備柱；制備柱；a：分析柱：分析柱重點(diǎn)222設(shè)備的放大：公式第53頁(yè)/共76頁(yè)梯度的調(diào)整方法：梯度的調(diào)整方法：tp/ta = Vp/Va * Fp/FaF ：流速：流速 ；V:柱體積；柱體積；t:梯度洗脫時(shí)間梯度洗脫時(shí)間； p: 制備柱制備柱；a：分析柱分析柱重點(diǎn)3第54頁(yè)/共76頁(yè)example樣品：樣品：粗品含量大約68%，白色粉末狀固體，對(duì)熱（能夠耐受100攝氏度）和光穩(wěn)定客戶(hù)要求：客戶(hù)要求：純化后純度大于99%，單雜小于0.8%，回收率達(dá)到70%1 step:了解客戶(hù)需求從分析到制備的過(guò)程：案例第55頁(yè)/共76頁(yè)2 step:原始樣品分析exa

14、mple用分析型HPLC（填料5u甚至更小）對(duì)樣品進(jìn)行分離，并對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行改進(jìn)，直到主峰和雜質(zhì)完全分離，摸索好的條件用來(lái)對(duì)以后純化后的樣品進(jìn)行純度分析。從分析到制備的過(guò)程：案例第56頁(yè)/共76頁(yè)example分析條件：甲醇：乙腈：水=81：12：7檢測(cè)波長(zhǎng)：246nm流速：1.0mL/min柱子：C18，5m，4.6*250mm結(jié)果9.81610.50316.90319.79121.47623.96826.15230.58232.32134.92536.88838.57347.56748.37751.74565.05769.514-5051015202530354045m V918273645

15、5463728190m in從分析到制備的過(guò)程：案例第57頁(yè)/共76頁(yè)3 step:分析柱模擬制備填料粒徑 10um，4.6*250mm的柱子不加非揮發(fā)性的酸堿鹽，重新摸索制備條件主峰和雜質(zhì)分離充分的條件下開(kāi)始做過(guò)載實(shí)驗(yàn)將主峰分段收集，一般為分成10段左右分別測(cè)定純度，計(jì)算回收率，進(jìn)一步優(yōu)化制備條件從分析到制備的過(guò)程：案例第58頁(yè)/共76頁(yè)example制備條件摸索流動(dòng)相填料90%甲醇、75%甲醇、75%乙腈、70%乙腈、60%乙腈。 4種不同品牌的填料60%乙腈XX牌填料C18-10um-100A確定確定從分析到制備的過(guò)程：案例第59頁(yè)/共76頁(yè)example分析柱模擬制備譜圖結(jié)果1.861

16、2.3042.4993.3103.6673.9774.4804.9765.2176.0836.4738.5079.0319.7229.99311.87312.30614.23715.71816.42917.70618.44019.64820.72821.27522.04322.73623.52324.63425.91527.63029.07737.47340.62750.56353.88357.57766.54269.26476.636-200020040060080010001200140016001800mV714212835424956637077min從分析到制備的過(guò)程：案例第60頁(yè)/

17、共76頁(yè)4 step:確定最大上樣量不斷增大上樣量，直到回收率明顯下降理論上樣量：填料質(zhì)量的3-8，可以從3逐漸增大來(lái)確定最大上樣量第61頁(yè)/共76頁(yè)example60%乙腈，進(jìn)樣量4時(shí)，收率為36.3%60%乙腈，進(jìn)樣量3時(shí)，收率為78.9% 選擇上樣量為選擇上樣量為3 第62頁(yè)/共76頁(yè)最終確定的制備條件：最終確定的制備條件：流動(dòng)相：60%乙腈-水上樣量：填料質(zhì)量的3填料：XX牌-C8-10um-100A樣品溶劑：流動(dòng)相從分析到制備的過(guò)程：案例第63頁(yè)/共76頁(yè)5step:放大分析柱模擬制備的條件及上樣量等線(xiàn)性放大到制備柱上重復(fù)幾次，至工藝成熟后，可以每次將主峰只分為4-6段將主峰分段收集

18、，一般為分成10段左右分別測(cè)定純度，計(jì)算回收率，進(jìn)一步優(yōu)化制備條件公式見(jiàn)前面，制備柱規(guī)格根據(jù)實(shí)際樣品量來(lái)決定從分析到制備的過(guò)程：案例第64頁(yè)/共76頁(yè)1.8942.9293.4754.8125.2725.7798.7079.50313.14817.82321.10222.76324.39630.10131.78138.44859.801-10001002003004005006007008009001000110012001300mV7142128354249566370min100DAC中試放大從分析到制備的過(guò)程：案例第65頁(yè)/共76頁(yè)2.3082.5194.1836.9327.2509.2

19、319.93711.01613.66020.77925.33333.22636.80347.14050.12958.49861.76766.42972.57293.867105.554111.164120.013150.434154.642160.709178.884193.359203.958224.722237.749247.848268.147281.174291.291311.088325.082335.198355.473369.472379.571402.282416.757421.099426.881444.226459.217468.851487.684497.334504.572514.188539.792554.269564.3861002003004005006007008009001000110012001300mV