腺病毒的擴增及純化

1、重組腺病毒構(gòu)建，擴增及純化基本技術(shù)操作（細菌內(nèi)同源重組AdEasy System）一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質(zhì)粒為例）1.      選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質(zhì)粒多克隆位點。2.      重組質(zhì)粒鑒定： 酶切鑒定或測序。3.      重組質(zhì)粒擴增，純化并準備適量含目的基因的穿梭質(zhì)粒。4.      用PmeI單酶切線性化重組穿梭質(zhì)

2、粒，電泳鑒定質(zhì)粒完全被切開。5.      膠回收線性化質(zhì)粒，以備共轉(zhuǎn)化使用。二 共轉(zhuǎn)化1  大腸桿菌BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)制備²       從新鮮瓊脂板上挑取單個BJ5183細菌，接種于LB培養(yǎng)基中，37振搖過夜。²       接種25ml過夜培養(yǎng)物于500ml LB培養(yǎng)基，37振搖，至OD600 達到0.4。²      

3、; 迅速將培養(yǎng)物置于冰浴中30min，至充分冷卻。²       將菌液轉(zhuǎn)移至預冷的離心管中，4下以2500r/min離心15 min，棄培養(yǎng)液，回收細胞。²       以10ml預冷的10%甘油洗滌沉淀，低溫離心，共兩次。²       加約1ml（適量）預冷的10%甘油重懸沉淀，稀釋懸液100倍，測量OD600，至稀釋濃度為2-3×1010個細胞/ ml (1.0 OD6

4、00約2.5×1010個細胞/ml)。分裝，-80或液氮保存待用。2  病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴增，純化。3  將1-5µl (約1µg) 線性化的穿梭質(zhì)粒及1µl（約100ng/µl）病毒骨架質(zhì)粒（如pAdEasy-1）加入至含約40µl BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)的EP管中混勻,冰上冷卻。4  將混合物加入電轉(zhuǎn)杯，電擊（1250-1500V/mm,5ms）。5  電擊結(jié)束取出樣品，加入1ml SOC或LB培養(yǎng)液，37低速振蕩40min。6  取適當體積的電擊轉(zhuǎn)化細胞液涂于數(shù)個卡那霉

5、素抗性平板（25-50mg/ml），37培養(yǎng)16-20hr。7  次日挑取平板上長出的菌落（選擇最小的菌落）,接種于3ml含25-50mg/ml的LB培養(yǎng)基，37培養(yǎng)10-15hr。8  堿裂法提取質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳篩選，大質(zhì)粒為可能陽性克隆，進一步酶切鑒定。以PacI單酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳如顯示出一條大片段（約30kb）,及一條小片段（約3.0或4.5kb）（同時可進行其它酶切鑒定），則基本確定為陽性克隆。9  取1-5µl 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5大腸桿菌細胞（BJ5183為recA+,質(zhì)粒DNA易發(fā)生突變，DH5或JM109，XL1-

6、blue菌株為重組缺陷性菌株，可穩(wěn)定擴增已鑒定的重組質(zhì)粒），擴增細菌并純化質(zhì)粒。三 重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導293細胞1  293細胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)導24小時前，以方瓶為例，接種2×106  293細胞于25cm2方瓶，使生長密度約50-70%。（也可以使用6孔或96孔板）2  以PacI單酶切重組病毒質(zhì)粒（轉(zhuǎn)導25cm2方瓶約需4µgDNA），完全線性化后，乙醇沉淀，再以20 µl ddH2O溶解。3  脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒（以Lipofectamine為例）:每4µg PacI約需20µl Lipofectamine包裹

7、.質(zhì)粒及脂質(zhì)體分別稀釋于500µl無血清培養(yǎng)基再混合,置于室溫下15-30min。4  以無血清培養(yǎng)基輕輕洗滌培養(yǎng)瓶，另加2.5ml無血清培養(yǎng)基，37放置10min。5  將Lipofectamine-DNA混合物加入培養(yǎng)瓶，37孵箱放置4hr。6  4hr后，棄Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FCS）。如有大量細胞漂浮，可不棄Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培養(yǎng)基，37孵育過夜，再換液。7  培養(yǎng)過程中觀察細胞生長情況。約2周后可觀察到細胞病變（CPE）出現(xiàn)（

8、如用pAdTrack-CMV質(zhì)粒，由于含GFP，可觀察到綠色熒光）。四 重組病毒鑒定1  轉(zhuǎn)導10-14d后，收集細胞沉淀，加入2ml滅菌的PBS混懸，凍融細胞，離心后收集上清保存于-80。2  取30-50% 步驟1中上清，感染50-70%飽和度的25cm2方瓶中293細胞。2-3d后出現(xiàn)明顯細胞病變。3  感染后3-5d,當1/3-1/2細胞漂浮時收集病毒。按步驟1收集細胞并準備病毒上清。通過Western blot和/或PCR鑒定重組腺病毒產(chǎn)生。4  PCR鑒定重組病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K，55孵育1hr，再煮

9、沸5min，離心后取1-2µl作PCR。五 重組病毒擴增，純化1  75cm2方瓶中接種293細胞，至密度達到90%，加入適量病毒上清感染細胞。3-4d后，細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮，則收集所有細胞。約500g轉(zhuǎn)速離心，棄上清。2  以滅菌PBS重懸沉淀，反復凍融4次。4下7000g離心5min.病毒純化至少需要30瓶75cm2方瓶細胞。3  CsCl連續(xù)梯度離心純化：50ml離心管中稱量4.4g CsCl，加入8ml病毒裂解上清液，混勻，體積約為10ml。轉(zhuǎn)移至12ml超速離心管（用于SW41轉(zhuǎn)頭）中，覆蓋約2ml礦物油。平衡后，10下32000

10、rpm離心18-24hr，用注射器抽吸離心出的病毒帶。（也可CsCl不連續(xù)梯度離心：20ml超速離心管中緩慢加入8ml CsCl 1.4 (53 g + 87 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，上面小心加入6 mL CsCl 1.2 (26.8 g + 92 mL 10 mM Tris-HCl，pH=7.9)，再小心加入病毒上清液至體積達到20ml。平衡后，4下 23000rpm離心90min (SW28轉(zhuǎn)頭)，用注射器抽吸下層藍白色病毒帶）4  病毒透析去鹽：配置透析液（10 mM Tris pH 8.0, 2 mM MgCl2, 5% sucrose），滅菌處理

11、。4透析，更換3次透析液，可基本去除CsCl，病毒保存于-80。六 病毒滴度測定（TCID50）1  細胞準備:96孔板中接種100µl 293細胞,每孔細胞數(shù)約104個,以2% DMEM培養(yǎng)2  稀釋病毒液準備：以2% DMEM將病毒液稀釋成8個較高濃度（如10-3-10-10），每個濃度重復10個，每孔加入病毒稀釋液100µl。另留兩排不加病毒液作為陰性對照。37下，孵箱培養(yǎng)10天。3  10d后觀察細胞，記數(shù)每排出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，計算細胞病變率。（如某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0）。4  計算T =

12、10×101 + d (S - 0.5) /mld = Log 10 稀釋度（如為10倍稀釋，d=1）   S = 各濃細胞病變比率之和實驗室重組腺病毒常用質(zhì)粒：病毒骨架質(zhì)粒：pAdEasy-1, pAdEasy-2穿梭質(zhì)粒：p-Shuttle, p-Shuttle-CMV, pAdTrack, pAdTrack-CMV腺病毒的包裝，純化和感染技術(shù)背景：Adeasy系統(tǒng)利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優(yōu)點，并破壞了腺病毒基因組中的早期基因E1，使之成為較為安全、高效的病毒載體。利用帶有 E1 基因的 293 細胞作為包裝細胞，通過倍比擴增，富集病毒顆粒，

13、并通過CsCl 梯度離心，透析進行分離純化。對絕大多數(shù)的細胞株可以達到近乎100的感染效率。但需要指出的是 Adeasy 同樣具有所有病毒載體或轉(zhuǎn)染試劑都不可避免的細胞毒性問題。所需試劑：? 293細胞；? 重組好的腺病毒質(zhì)粒；? Pac I限制性內(nèi)切酶；? 質(zhì)?；厥障嚓P(guān)試劑；? 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑；? TBS：10mMTris, 0.9% NaCl,pH8.1;? 40%CsCl：28.45gCsCl 溶于42.7ml 的TBS 中，4度保存；? 15%CsCl：9.085gCsCl 溶于47.69ml 的TBS 中，4度保存；? Beckman 離心管：14*89 mm，SW41 轉(zhuǎn)頭

14、；? Polybrene(sigma)，10 mg/ml；? 透析袋：Spectrum Co. （成卷供應，帶少量甘油，硫化物與重金屬），MW=800014400；? 滅菌甘油。操作流程：1. 293細胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells 在轉(zhuǎn)染前24小時接種于1或2個60mm 培養(yǎng)盤中，使之在轉(zhuǎn)染時細胞匯合率為50-70%；2. 在轉(zhuǎn)染前，用Pac I處理目的質(zhì)粒（一般一個60mm 細胞盤需要6gDNA）。處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20l 無菌水中；3. 用PEI或其他轉(zhuǎn)染試劑將6gPac I處理過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞；14. 8 個小時后移去混合液

15、，加入 4 ml DMEM 完全培養(yǎng)液（10% CBS，1%Pen/Strep）；5. 在轉(zhuǎn)染后 7 到 10 天用細胞刮（而不是胰酶）將細胞從瓶中刮下并移入 50ml錐形管。離心后將細胞重懸于2.0ml PBS 或全培液中。于液氮中凍結(jié)細胞，37水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進行4 次。注意保存時不要反復凍融，可保存于-20；6. 將293細胞以50-70%的匯合率鋪于60mm 培養(yǎng)盤中，以30-50%的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明顯的細胞裂解或CPE現(xiàn)象；7. 在有 1/3 到 1/2 的細胞脫離漂浮時，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可進一步通過Westernbl

16、ot 或PCR（5l 病毒上清加上10l PCR-gradeProteaseK，55消化1小時，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2l 進行PCR反應）證實重組腺病毒的存在；78. 按步驟5的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到10 infectiousparticles/ml 的病毒。每輪的擴增應能提高一個數(shù)量級的梯度；9. 為了進一步擴增，將步驟8獲得的病毒上清進一步感染100 mm 培養(yǎng)盤的細胞，按步驟5的方法收集病毒，并進而將其感染150mm 細胞培養(yǎng)盤中的293細胞，以獲得足夠量的病毒；10. 將15%CsCl 和40%CsCl 加入Beckman 離心管中制備CsCl 梯

17、度溶液；11. 將最終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；12. 超速離心，30000rpm，4度離心16個小時；13. 離心后，應有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16號針頭將這一條帶收集；14. 在TBS 中透析一小時，隨后在含有10甘油的TBS 中透析兩次，每次一小時；15. 將純化的腺病毒分裝于EP 管中；16. 在Eppendorf Biophotometer中測量透析液中的總蛋白量，1g病毒蛋白相當于4×109病毒顆粒；17. 長期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反

18、復凍溶；218. 由于腺病毒對不同細胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細胞毒副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細胞數(shù)1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細胞；加入相對培養(yǎng)液體積1：1000的Polybrene。在 37度下平板離心30分鐘；19. 感染 812 小時后換液。將含有病毒的培養(yǎng)液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液。參考文獻：1Proc. Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 95, pp. 25092514, March 1998，Asimplifiedsystem for generatingrecombinant adenoviruses.2Current Protocols inHumanGenetics (2004)12.4.1-12.4.25.病毒感染力的滴定（TCID50的測定）實驗操作步驟、計算方法2009-11-28 15:20一、實驗目的    了解病毒感染力測