植物組織培養(yǎng)學(xué)期末復(fù)習(xí)要點

1、 植物組織培養(yǎng)學(xué)期末復(fù)習(xí)要點緒論 植物組織培養(yǎng)（Tissue culture）：是指用無菌方法使植物體的離體器官、組織和細(xì)胞在人為提供的條件下生長和發(fā)育的所有培養(yǎng)技術(shù)的總稱，也稱之為離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。 器官：根、莖、葉、花、果實、種子；組織：花藥、胚珠、胚、胚乳、形成層等。 或指將植物的離體器官、組織、細(xì)胞以及去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，放在離體無菌人工控制的環(huán)境條件下培養(yǎng)，對其進(jìn)行克隆，使其生長、分化并成長為完整植株的過程。 組織（tissue)、器官（organ)或細(xì)胞培養(yǎng)：指利用生物體各部分組織、器官或細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，使之形成愈傷

2、組織或完整有機體的技術(shù)。 愈傷組織（callus）：在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無序生長狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。 原生質(zhì)體培養(yǎng)指將微生物或植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞全能性使其再生細(xì)胞壁，并進(jìn)行細(xì)胞分裂分化，形成完整個體的技術(shù)。2）、器官發(fā)生途徑：由愈傷組織或外植體誘導(dǎo)形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方法。 外植體脫分化，高生長素(1,2-D) 愈傷組織再分化低(生長素/細(xì)胞分裂素) 芽高(生長素/細(xì)胞分裂素)根再生植株。 外植體（explant)：由活體（in vivo)植物體上切取下來的，用于組織

3、培養(yǎng)的各種接種材料。包括各種器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等。 按培養(yǎng)材料分為（Gamborg等)：愈傷組織培養(yǎng)：最為常見的組織培養(yǎng)；器官培養(yǎng)：胚、胚乳、珠心、子房、根、莖、葉、花和幼果的部分組織的培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)：懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)；莖尖分生組織培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)。 根據(jù)培養(yǎng)器官的不同：葉培養(yǎng)、根培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)等。 根據(jù)培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)。固體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在含有瓊脂等固化劑的培養(yǎng)基表面進(jìn)行培養(yǎng)。特點：是最常用的方法。該方法簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。液體培養(yǎng)：將培養(yǎng)物放在未加固化劑的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，一

4、般需進(jìn)行震蕩，又稱液體震蕩培養(yǎng)。特點：于液體中氧氣含量較少，常用振蕩培養(yǎng)的方法以確保氧氣的供給；往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，速度一般為50-200rmin，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。  根據(jù)培養(yǎng)物量的多少：大量培養(yǎng)、微量培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)過程中是否需光：光培養(yǎng)、暗培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)方法的不同：平板培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。 按培養(yǎng)過程分為：初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)：指外植體的最初培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復(fù)多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。1904年，Hannig （胚胎學(xué)家）最先成功地培

5、養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚。Haberlandt的觀點：高等植物的組織和器官可以分割成單個細(xì)胞。貢獻(xiàn)：提出細(xì)胞全能性，首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)。1934年，美國植物生理學(xué)家White 用番茄根尖建立起第一個活躍生長的無性繁殖系，從而使非胚器官的培養(yǎng)首先獲得成功。 應(yīng)用領(lǐng)域：快速繁殖、種苗脫毒、遠(yuǎn)緣雜交、突變育種、單倍體育種、種質(zhì)保存、基因工程 、植物性藥物和生物制品的生產(chǎn)。 1、植物的快速繁殖：運用組織培養(yǎng)的途徑，一個單株一年可以繁殖幾萬到幾百萬個植株，而且均來自一單一的個體，遺傳性狀一致。 2、脫除病毒：改善作物的生長狀態(tài)；生產(chǎn)無病毒苗木；提高產(chǎn)品質(zhì)量

6、與產(chǎn)量。 由于病毒的感染嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效地除去植物體內(nèi)的病毒，得到大量的無病毒種苗。主要的方法是培養(yǎng)植物莖尖分生組織，也可以采用熱處理或加入化學(xué)試劑的方法達(dá)到脫毒的效果。如馬鈴薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、培育新品種：生產(chǎn)符合人們需要的特性的新品種。遠(yuǎn)緣雜交：利用組織培養(yǎng)可以使難度很大的遠(yuǎn)緣雜交取得成功，從而育成一些罕見的新物種。 4、植物種質(zhì)資源的保存；5、人工種子的研究； 6、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。：鴨腳樹種子愈傷組織中提取利血平用于降血壓；人參根愈傷組織中提取強心配糖體治療心臟?。患t豆杉細(xì)胞中提取紫杉醇用于抗癌藥

7、物。 7、基因工程：基因工程主要研究DNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后必須通過組織培養(yǎng)途徑才能實現(xiàn)植株再生。 組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)于以下幾個方面：快速繁殖優(yōu)良苗木；獲得脫毒苗；育種上應(yīng)用；工廠化育苗。 第1章     植物組織培養(yǎng)實驗室及操作技術(shù)  組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求：便于隔離、便于操作、便于滅菌、便于觀察。()  實驗室組成包括基本實驗室 (準(zhǔn)備室、緩沖室、無菌操作室、培養(yǎng)室)和輔助實驗室(細(xì)胞生物學(xué)實驗室、溫室、生化分析實驗室)。 基本設(shè)備：

8、冰箱、電爐、酸度計、純水器、天平、培養(yǎng)基分裝器、攪拌器等。  滅菌設(shè)備：蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。 細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡  玻璃器皿：三角瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶；金屬材質(zhì)用具：接種針、解剖刀、鑷子。  1、玻璃器皿洗滌：新購置玻璃器皿：1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用。已用過的玻璃器皿：洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用。  2、塑料器皿洗滌：新的塑料器皿打開即用。已用過的塑料器皿：2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30

9、min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用。 金屬用品洗滌：熱洗衣粉水洗凈沖洗擦干。 滅菌方法：物理方法：物理滅菌干熱、濕熱、射線處理、物理除菌、過濾、離心、沉淀等；化學(xué)方法：消毒劑、抗菌素滅菌。 （1） 培養(yǎng)基滅菌：高溫高壓濕熱滅菌法：壓力在9.8×10410.8×104Pa，溫度在121，滅菌2030min；（2）玻璃器皿滅菌：蒸汽高壓消毒滅菌，干熱消毒滅菌；（3）塑料器皿滅菌：多采用高壓蒸汽消毒滅菌；（4）金屬用具滅菌：灼燒滅菌：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼燒，冷卻后使用。（5）接種室滅菌：接種室紫外燈照射空氣消毒滅菌；超凈工作臺紫外燈照射或

10、70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種。（6）外植體滅菌：流水沖洗1020min或更長時間0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右或在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右蒸餾水沖洗45次備用。六、無菌操作：1、消毒，更換實驗服、帽子與鞋子，進(jìn)入接種室。2、打開超凈工作臺 和無菌操作室的紫外燈，照射40min左右，后關(guān)閉。3、開啟過濾室風(fēng)機，使無菌風(fēng)吹拂工作臺面和四周的臺壁。4、用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手。5、用沾有70%75%酒精的紗布擦拭盛培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿，放進(jìn)工作臺。6、把解剖刀、剪刀、鑷子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精

11、燈火焰附近切割備用的接種材料。8、打開瓶口，用火焰燒瓶口，轉(zhuǎn)動瓶口使瓶口各部分都燒到。9、取下接種器械，在火焰上消毒。10、把培養(yǎng)材料放入培養(yǎng)瓶，蓋上瓶口。11、接種結(jié)束后，清理和關(guān)閉超凈工作臺。 注意：操作期間應(yīng)經(jīng)常用70%75%的酒精擦拭工作臺和雙手；接種器械應(yīng)反復(fù)在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。 環(huán)境條件：溫度：植物材料一般最適溫度在25±2之間；光照：最常用的光周期是光照16h，黑暗8h；濕度：一般情況下，培養(yǎng)器內(nèi)相對濕度應(yīng)達(dá)100%，培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境的相對濕度在70%80%；氣體：氧氣是愈傷組織生長所必需的；培養(yǎng)基的滲透壓：調(diào)節(jié)滲透壓常常從糖入手；pH：

12、值植物組織培養(yǎng)時培養(yǎng)基的pH值大多在5.06.5。 植物體內(nèi)至少含有幾十種化學(xué)元素，其中大部分元素在植物體內(nèi)起到一定的生理作用：組成各種化合物，參與機體的建造，成為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，參與活躍的新陳代謝；元素之間相互協(xié)調(diào)，以維持離子濃度平衡、膠體穩(wěn)定、電荷平衡等電化學(xué)方面的作用；發(fā)育方面，特定的元素影響植物的形態(tài)發(fā)生和組織、器官建成。 Arnon和Stout（1939）提出的確定植物必需營養(yǎng)元素的3個標(biāo)準(zhǔn)：A、缺乏該元素，植物生育發(fā)生障礙，不能完成其生活史。B、缺乏該元素，就表現(xiàn)為專一的病癥，且這種缺素癥可以用補充改元素來預(yù)防和恢復(fù)。C、該元素在植物營養(yǎng)生

13、理上表現(xiàn)直接的效果，而不是由于土壤的物理、化學(xué)、微生物條件的改進(jìn)而產(chǎn)生的間接效果。 國內(nèi)外公認(rèn)的高等植物所必需的營養(yǎng)元素有16（17）種：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）。 根據(jù)植物體內(nèi)含量多少，可把這些元素分為：大量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9種。微量營養(yǎng)元素：占干物質(zhì)重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg，F(xiàn)e、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7種。 按照國際植物生理協(xié)會的建議：所需濃度 > 0.5mmol/L的元素為大

14、量元素；所需濃度 < 0.5mmol/L的元素為微量元素。 N是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在植物生命活動中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培養(yǎng)基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。K對碳水化合物合成，轉(zhuǎn)移，以及氮素代謝等有密切關(guān)系。Mg、S、Ca是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑，對核蛋白體結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用；S是含S氨基酸的蛋白質(zhì)的組成成分。 Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的成分，對細(xì)胞分裂，穩(wěn)定質(zhì)膜結(jié)構(gòu)有顯著作用，此外，Ca及鈣調(diào)素在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。在微量元素中，鐵的使用最大：一些氧化酶的組成成分；

15、葉綠素形成的必要條件；使用乙二胺四乙酸鐵（EDTA-Fe）鰲合物防止鐵的沉淀。 微量元素的主要作用是作為酶的輔助因子或激活劑參與代謝的調(diào)節(jié)。 3、碳源物質(zhì)包括糖類物質(zhì)、醇類物質(zhì)和有機酸，以糖類物質(zhì)最重要。 糖類物質(zhì)特點：具有熱易變的性質(zhì)；利于吸收和利用；使用濃度一般在2%5%；提供能源和調(diào)節(jié)滲透壓。 4、維生素類：以各種輔酶的形式存在；參與多種代謝活動；對生長，分化等有很好的促進(jìn)作用；主要分為脂溶性維生素和水溶性維生素；常用維生素有VB1和VB6。  5、肌醇：環(huán)己六醇；細(xì)胞壁的構(gòu)建材料；參與碳水化合物、磷脂代謝及離子平衡等生理活動；

16、促進(jìn)活性物質(zhì)發(fā)揮作用。 6、氨基酸：蛋白質(zhì)的組成成分；有機氮源；可直接被細(xì)胞吸收利用；培養(yǎng)基中常用的是甘氨酸。3、外植體消毒：水洗；70%酒精浸約3060s；0.1%升汞浸10min或10%漂白粉上清液浸1015min；無菌水沖洗35次。 4、接種：把經(jīng)表面滅菌處理后植物材料，切碎或分離出器官、組織、細(xì)胞，再經(jīng)無菌操作轉(zhuǎn)接到無菌培養(yǎng)基上的過程。 5、外植體培養(yǎng)：之把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室力，使之生長，分裂或分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。 外植體愈傷組織根、芽試管苗。 同時長芽和根；先長芽，再長根；先長根，再長芽。 外植體胚

17、狀體試管苗（胚狀體途徑）。 外植體根、芽試管苗（器官發(fā)生途徑）。 胚狀體產(chǎn)生的途徑：直接從器官上發(fā)生；從愈傷組織發(fā)生；從游離打得單細(xì)胞發(fā)生；從小孢子發(fā)生。誘導(dǎo)胚狀體比誘導(dǎo)芽的優(yōu)點：數(shù)量多；速度快；結(jié)構(gòu)完整。 組織培養(yǎng)三大難題：污染、褐變、玻璃化現(xiàn)象。 褐變：是指外植體在培養(yǎng)中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，有時使整個培養(yǎng)基變褐色，從而抑制其他酶的活性，影響材料的培養(yǎng)。 玻璃化現(xiàn)象：在長期的離體培養(yǎng)繁殖時，有些試管苗的嫩莖，葉片呈現(xiàn)半透明水漬狀，這種現(xiàn)象稱為玻璃化。 第2章   愈傷

18、組織培養(yǎng) 愈傷組織培養(yǎng)(callus culture):是指將外植體接種到人工培養(yǎng)基上，在激素作用下，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、生長和分化的培養(yǎng)過程。 l 誘導(dǎo)愈傷組織的關(guān)鍵主要是培養(yǎng)條件，其中激素的成分和濃度是最重要的因素。 l 環(huán)境條件：光對細(xì)胞形態(tài)發(fā)生具有誘導(dǎo)反應(yīng)；溫度有利于器官發(fā)生。 不同種植物的器官組織產(chǎn)生的愈傷組織器官分化明顯不同，差異顯著：雙子葉植物比單子葉及裸子植物易于發(fā)生愈傷組織；二倍體比單倍體易。 個體發(fā)育年齡：幼嫩部位易誘導(dǎo)形成愈傷組織，也易誘導(dǎo)器官分化；愈傷組織繼代次數(shù)越多，器官分化能力愈低。

19、60;從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個時期：誘導(dǎo)期、分裂期、分化期。 2，4-D對細(xì)胞中RNA的轉(zhuǎn)錄合成有促進(jìn)作用常用于遇傷組織的誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)期細(xì)胞生理指標(biāo)的變化：氣體交換增加，如氧氣的吸收增加；RNA含量增加（增加到300%）；蛋白質(zhì)的周期性增加(每個細(xì)胞的總增加量為200%）；代謝相關(guān)酶類增加。 分裂期是指外植體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。 分裂期細(xì)胞的主要表現(xiàn): 1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。2.每個細(xì)胞平均鮮重下降。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡。4細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.細(xì)胞中RNA含量減少，而DNA含量保持

20、不變。6.隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。分裂期愈傷組織的共同特征：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。 優(yōu)良的愈傷組織須具備以下特性中的2-3個：1、高度的胚性或再分化能力。2、易散碎，以便用之建立優(yōu)良的懸浮系，并能分離出原生質(zhì)體。3、旺盛的自我增殖能力，以建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。4、經(jīng)長期繼代保存而不喪失胚性。 分化期是指愈傷組織細(xì)胞停止分裂，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)和生理上的變化,形成一些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞的時期。 分化期細(xì)胞特點：細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變。形成瘤狀或片狀

21、的分生組織結(jié)節(jié)。或維管組織結(jié)節(jié)。細(xì)胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。 根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：生根的愈傷組織、滲出粘性多糖的愈傷組織、易碎的愈傷組織、木質(zhì)化的愈傷組織。 愈傷組織的繼代培養(yǎng)：培養(yǎng)物在培養(yǎng)基上生長一段時間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng),這個過程叫做繼代培養(yǎng)。 繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。一般在2528下進(jìn)行固體培養(yǎng)時，每隔45周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。通過繼

22、代培養(yǎng)，可使愈傷組織無限期地保持在不分化的增殖狀態(tài)。培養(yǎng)基中的N，大多數(shù)都用硝態(tài)氮，對細(xì)胞分化起重要作用。 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)：一般使用的濃度為0.1-10mgL。使用植物生長調(diào)節(jié)劑時，要注意種類和濃度，特別是生長素和細(xì)胞分裂素的比值。  生長素與細(xì)胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發(fā)育的方向:是愈傷組織、長根還是長芽。生長素/細(xì)胞分裂素：高：利于根的形成；適中：利于愈傷組織的形成；低：利于芽的形成。 培養(yǎng)基中加入糖、各類B族維生素、肌醇和甘氨酸等，可滿足愈傷組織生長和分化的要求。各種氨基酸和嘌呤、嘧啶類物質(zhì)，可促進(jìn)器官分化。水解酪蛋白中含有多種

23、氨基酸，助于器官分化。酰胺類往往有促進(jìn)器官形成的作用。 培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng)；液體培養(yǎng)。 在愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用全暗、周期性光照、散射性光照三種方式。愈傷組織的誘導(dǎo)需弱光或不需光。繼代培養(yǎng)一般需光。器官發(fā)生階段，一般周期性光照比較好。此時光對器官的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)。24-28可較好地形成芽和根。 形態(tài)建成：外植體細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下發(fā)生脫分化、再分化，產(chǎn)生芽和根，或者形成胚狀體，發(fā)育成苗或完整植株。 愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式: 不定芽方式；胚狀體方式。 不定芽方式：外植體脫分化，高生長素(1,2-D) 愈傷組織再分化低

24、(生長素/細(xì)胞分裂素) 芽高(生長素/細(xì)胞分裂素)根再生植株。 愈傷組織的器官發(fā)生順序有四種情況：（1）愈傷組織僅有根或芽器官的分別形成，即無根的芽或無芽的根；（2）先長芽，后長根，多數(shù)情況；（3）先長根，再從根的基部長芽。這種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對于單子葉植物；（4）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株植株。 胚狀體：指在組織培養(yǎng)中，由一個非合子細(xì)胞(體細(xì)胞)，經(jīng)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程（經(jīng)過原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉胚5個時期），形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。 體細(xì)胞胚:不同于合子胚；不同于孤雌/雄胚；不同于器官

25、發(fā)生方式形成的幼苗。 合子胚:胚狀體質(zhì)量 萌發(fā)率高，質(zhì)量好 萌發(fā)率低，質(zhì)量差 來源 受精卵 體細(xì)胞 胚柄 有，明顯 即使有也不明顯形態(tài) 固定，體積相對較小復(fù)雜，常有兩個以上的子葉，體積較大變異率低胚狀體發(fā)生途徑與器官發(fā)生途徑形成植株的區(qū)別: 胚狀體具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端；而不定芽和不定根都為單向極性。 胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系。而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。 胚狀體維管組織的分布是獨立的“Y”

26、字形。而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。  胚狀體方式比不定芽方式有更多的優(yōu)點：胚狀體產(chǎn)生的數(shù)量比不定芽多；胚狀體可以制成人工種子，便于運輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。 以煙草葉片愈傷組織誘導(dǎo)為例：葉片表面消毒；在無菌條件下切去主脈及大的側(cè)脈成；5×5mm2 的小塊；培養(yǎng)在MS瓊脂培養(yǎng)基+2mg/L NAA+0.5mg/L BA上；28恒溫室內(nèi)，每天光照10小時；培養(yǎng)三天或更多天，葉組織的切口邊緣膨大；培養(yǎng)6-10天后，葉色漸轉(zhuǎn)淡綠，整個葉組織明顯增大，在切口處形成少量愈傷組織；形成的愈傷組織接種到誘導(dǎo)芽形成的培

27、養(yǎng)基中；28恒溫室內(nèi)，每天光照10小時；兩周后，可觀察到愈傷組織周圍形成綠芽；再培養(yǎng)可長成煙草苗。 初生愈傷組織接種到培養(yǎng)基上后，細(xì)胞核內(nèi)的變化：正常有絲分裂；先核內(nèi)復(fù)制，后有絲分裂；先核碎裂，后有絲分裂。初生愈傷組織的異質(zhì)細(xì)胞群體性反映了外植體中的染色體狀況。反映了愈傷組織誘導(dǎo)期間核變異的結(jié)果。在誘導(dǎo)中，會出現(xiàn)二倍體、多倍體、單倍體、非整倍體與染色體結(jié)構(gòu)變異體等。 愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用：1、加快了園藝植物新品種和良種繁育速度；2、培育無病毒苗木；3、獲得倍性不同的植株；4、克服遠(yuǎn)緣雜交困難；5、利于種質(zhì)資源長期保存和遠(yuǎn)距離運輸；6、提供育種中間材料；7、誘發(fā)和離體篩選突變體

28、；8、制造人工種子。 第3章    器官培養(yǎng) 器官培養(yǎng):是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的離體培養(yǎng)，包括根、莖、葉、花、果實、種子等。 培養(yǎng)目的:以器官作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)中最主要的一個方面，進(jìn)行的植物種類最多，應(yīng)用的范圍也最廣.研究器官的功能、分化、形態(tài)建成；快速繁殖：如利用莖、葉和花器培養(yǎng)建立的試管苗；獲得脫毒苗：利用莖尖培養(yǎng)可得到脫毒試管苗；種質(zhì)保藏；突變育種：植物器官作誘變處理，用器官培養(yǎng)可得到突變株，進(jìn)行細(xì)胞突變育種。 根培養(yǎng)的意義:1) 是進(jìn)行根系生理研究的最優(yōu)良實驗體系;2)&#

29、160;是研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；3）可建立快速生長的根無性系。 植株再生培養(yǎng)：根段的離體培養(yǎng)也可以用來再生植株。第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分化、在愈傷組織上分化成小植株。  影響因素：基因型、培養(yǎng)基、生長物質(zhì)、pH、環(huán)境條件。 莖尖培養(yǎng)是切取莖的先端部分或莖尖分生組織部分，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。  莖尖培養(yǎng)類型：莖尖分生組織培養(yǎng)：對長度0.1mm左右，含1-2個葉原基的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，即微莖尖培養(yǎng)；目的是獲得無病毒植株。  普通莖尖培養(yǎng)：對幾毫米至幾十毫米長的莖尖、芽尖及側(cè)芽的培養(yǎng)，目

30、的是快速繁殖和用于植物開花生理的。 莖尖培養(yǎng)的意義：無性系快速繁殖；培養(yǎng)無病毒苗，品種改良；理論基礎(chǔ)研究。 普通莖尖培養(yǎng): 這種培養(yǎng)技術(shù)簡單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時間短。 莖尖培養(yǎng)步驟如下：(1)取材: 挑選雜菌污染少，生長不久的莖尖。木本植物可在取材前對莖尖噴幾次滅菌藥劑。以保證材料不帶或少帶菌。用于普通莖尖培養(yǎng)，可先從植物的莖、藤或匍匐枝上切取2CM以上的頂梢。(2)消毒接種: 將采集到的莖尖切成0.51.0cm長，并將其大葉除去，休眠芽預(yù)先剝除鱗片。 將莖尖置于流水沖洗24h，再在95的酒精中處理30s，然

31、后在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸58min，最后用無菌水沖洗數(shù)次，準(zhǔn)備接種。(3)接種: 為了減少污染，可在接種前再剝掉一些葉片，使莖尖為0.5cm左右大小。這樣取莖尖大小只能作為快速繁殖。有些植物的莖尖由于多酚氧化酶的氧化作用而變褐。所以在接種時，不能用生銹的解剖刀，動作要敏捷，隨切隨接，減少傷口在空氣中暴露的時間，也可配制15Vc液，將切下的莖尖材料浸入處理一下。不同植物對生長素的反應(yīng)是不同的。 莖尖在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)生長太慢、生長太快和生長正常等三種類型。生長太慢即接種后莖尖不增大，只是莖尖逐漸變綠，出現(xiàn)綠色小點，細(xì)胞逐漸老化而進(jìn)人休眠狀態(tài)，或者逐漸變褐死亡。引起的原因是

32、生長素濃度太低，或是溫度過低或過高； 生長太快型是接種后莖尖迅速增大，在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，并迅速增殖，而莖尖不伸長，久之莖尖也形成愈傷組織，從而喪失發(fā)育成苗的能力。引起的原因一是生長素濃度過高，引起細(xì)胞瘋狂分裂而導(dǎo)致愈傷組織的形成。二是光照太弱或溫度太高。 生長正常型是接種后莖尖基部稍增大并形成少量愈傷組織，莖尖顏色逐漸變綠，并逐漸伸長，葉原基發(fā)育成可見的小葉，進(jìn)而形成小苗。 莖段培養(yǎng)是指不帶芽和帶1個以上定芽或不定芽的，包括塊莖、球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)莖段的主要目的是快繁。其次也可探討莖細(xì)胞的生理特點，以及進(jìn)行育種上的篩選突變體的過程。莖段培養(yǎng)用

33、于快速繁殖的優(yōu)點在于：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快；芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無性繁殖植物的快速繁殖問題等。 取材時注意莖的基部比頂部切段，側(cè)芽比頂芽的成活率低，所以應(yīng)優(yōu)先利用頂部的外植體，但由于每個新梢僅一個頂芽，也可利用腋芽，莖上部的腋芽培養(yǎng)效果較好。 還應(yīng)注意盡量在生長期取芽，在休眠期取外植體，成活率降低。 在莖段培養(yǎng)中，促進(jìn)腋芽增殖用6-BA是最為有效的，依次為Kt和Zt等。生長素雖不能促進(jìn)腋芽增殖，但可改善苗的生長。GA對芽伸長有促進(jìn)作用。 繼代擴繁是莖段培養(yǎng)的主要一步。這可由二種途徑解決：一是促進(jìn)腋芽

34、的快速生長，二是誘導(dǎo)形成大量不定芽。第一種途徑的好處是不會產(chǎn)生變異，能保持品種優(yōu)良特性。且方法簡便，可在各種植物上使用，每年從一個芽可增殖10萬株以上。第二種途徑會產(chǎn)生變異。繼代增殖過程注意選用培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑。 生根培養(yǎng)的目的是使再生的大量試管苗形成根系，獲得完整的植株。創(chuàng)造適于根的發(fā)生和生長的條件，主要是降低或除去細(xì)胞分裂素而加入生長素。由于在苗增殖時施用了較高濃度的細(xì)胞分裂素，并促使苗中保持著一定的量，因此，在生根培養(yǎng)中不需要加細(xì)胞分裂素。 生根培養(yǎng)時增強光照有利于發(fā)根，且對成功地移栽到盆缽中有良好作用。故在生根培養(yǎng)時應(yīng)增加光照時間和光照強度，但強光直接照射根部，會

35、抑制根的生長，所以在生根培養(yǎng)時最好在培養(yǎng)基中加0.3活性炭，以促進(jìn)生根。 移植：這是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵一環(huán)。試管苗是在恒溫、保濕、營養(yǎng)豐富、激素適當(dāng)和無菌條件下生長的。植物的組織發(fā)育程度不佳，植株幼嫩，表皮角質(zhì)層變薄，抵抗力減小減弱。移植是一個由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)的過程。因此，在馴化時要進(jìn)行煉苗。然后洗凈瓊脂，小心移栽，初期濕度要大，基質(zhì)通氣濕潤，保濕保溫，更要精心管理等。 離體葉的培養(yǎng)是指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉等葉組織的無菌培養(yǎng)。1、制備外植體：    幼嫩葉片-水洗-消毒-無菌水洗。 2、影響培養(yǎng)因素：6-BA和KT

36、利于芽的形成；2,4-D利于愈傷組織形成。極性：葉片腹面向上放置利于芽的分化。損傷：常從葉柄、葉脈的切口處形成愈傷組織和芽。 離體葉組織中再生植株發(fā)生途徑：直接產(chǎn)生不定芽；離體葉愈傷組織不定芽；離體葉愈傷組織胚狀體不定芽；離體葉小鱗莖或球狀體；離體葉愈傷組織小鱗莖或球狀體。 生根培養(yǎng)：取高2以上、帶有4-6片葉的小苗切下；接在MS+IBA 0.6mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)；7天后開始生根；12-15天可得到生根良好的小植株。 第4章 胚胎培養(yǎng) 胚胎培養(yǎng)是指將植物的胚胎與母體分離，培養(yǎng)在人工的培養(yǎng)基上形成幼苗的過程，包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚

37、乳培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)以及子房培養(yǎng)。 胚胎培養(yǎng)的意義：克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性.在高等植物的種間和屬間雜交后代胚敗育，胚發(fā)育不全而不能正常萌發(fā)，因而得不到雜種種子，用胚胎培養(yǎng)和試管受精技術(shù)就可以解決這些問題。使胚胎發(fā)育不完全的植株獲得后代. 縮短育種年限，提高育種效率。 胚培養(yǎng)是指采用人工的方法將胚從種子、子房或胚珠中分離出來，再放在無菌的條件下，讓其進(jìn)一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。又分為幼胚培養(yǎng)和成熟胚培養(yǎng)。 幼胚是指子葉期以前的幼小胚。幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種上有極大的利用價值。 由于胚越小就越難培養(yǎng)。所以，盡可能采用較大的胚進(jìn)行胚養(yǎng)。 

38、成熟胚一般指子葉期后至發(fā)育完全的胚。它培養(yǎng)較易成功，在含有無機大量元素和糖的培養(yǎng)基上，就能正常生長成幼苗。 由于種子外部有較厚的種皮包裹，不易造成損傷，易于進(jìn)行消毒，因此，將成熟或未成熟種子用70酒精進(jìn)行幾秒鐘的表面消毒，再用無菌水沖洗3-4次，然后在無菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。  1、幼胚培養(yǎng)過程：取子房；常規(guī)表面消毒；解剖鏡下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚。固體培養(yǎng)。 幼胚的發(fā)育方式：1）胚性發(fā)育：繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育；2）早熟發(fā)育：迅速萌發(fā)成幼苗；3）產(chǎn)生愈傷組織：再分化形成多個胚狀體或芽原基。 培養(yǎng)基：成熟胚

39、對培養(yǎng)基要求不高，而幼胚要求較高，常用的培養(yǎng)基有Tukey，MS，B5，Nitsch培養(yǎng)基，其中前者適于成熟胚培養(yǎng)，其他適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。幼胚需要較高的蔗糖濃度，以提供較高的滲透壓，但由于幼胚在自然條件下賴以生存的是無定形的液體胚乳，并具有較高的滲透壓，所以人工培養(yǎng)基中要創(chuàng)造高滲透壓的條件，使它可以調(diào)節(jié)胚的生長，并能抑制中早熟萌發(fā)中的細(xì)胞延長，以及抑制胚的萌發(fā)，避免把細(xì)胞的伸長狀態(tài)轉(zhuǎn)化為分裂狀態(tài)。 糖類：在胚培養(yǎng)中除要求有較高的蔗糖濃度、高滲透壓以外，還要求有較高濃度的氨基酸及無機鹽。附加成分：天然提取物的作用 椰乳對胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用，如番茄胚在含有50椰乳的培

40、養(yǎng)基中可維持生長。溫光條件：對于大多數(shù)植物的胚來說，在2530為宜，但是，早熟果樹如桃的種胚，必須經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長，而馬鈴薯胚以20為好。光照可以促進(jìn)某些植物胚的轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長，而黑暗則利于胚根生長。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。 一般認(rèn)為IAA可使胚的長度增加，加入BA可提高胚的生存機會。 培養(yǎng)方式：幼胚培養(yǎng)適于液體培養(yǎng)，成熟胚適于固體培養(yǎng)。 胚培養(yǎng)的應(yīng)用：1)在遠(yuǎn)緣雜交育種中:克服雜種胚不能正常發(fā)育；2)克服珠心胚（來自珠心或珠被的細(xì)胞進(jìn)入胚囊液泡中形成不定芽胚的現(xiàn)象，或完全由珠心發(fā)育的胚稱為珠心胚，染色體為單倍）的干擾,提高育種效率；

41、3)縮短育種周期：縮短休眠期；4)測定休眠種子的萌發(fā)率；5)理論研究中的應(yīng)用。 胚乳培養(yǎng)是指將胚乳從母體上分離出來，在無菌的環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。胚乳培養(yǎng)過程：胚乳愈傷組織形態(tài)發(fā)生胚狀體發(fā)育成苗或不定芽苗。 卡諾氏固定液適用于一般植物組織和細(xì)胞的固定,常用于根尖,花藥壓片及子房石蠟切片等.有極快的滲透力,固定后用95%酒精沖洗至不含冰醋酸為止；如果材料不馬上用,需轉(zhuǎn)入70%酒精中保存.固定液的重要特性是能迅速穿透細(xì)胞，將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達(dá)到優(yōu)良染色效果。  F.A.A固定液又稱標(biāo)準(zhǔn)固定液,

42、萬能固定液.適用于一般根,莖,葉,花藥,子房組織切片.在植物形態(tài)解剖研究上應(yīng)用極廣,此固定液最大優(yōu)點是兼有保存劑作用,但對染色體的觀察效果較差. 胚乳培養(yǎng)的應(yīng)用:胚乳培養(yǎng)可得到三倍體植株，產(chǎn)生無籽果實?；蚣颖缎纬闪扼w植株進(jìn)行育種。胚乳培養(yǎng)可得到倍性不同的愈傷組織，可分離和篩選各種類型的非整倍體植株。 胚珠培養(yǎng)是指將授粉的子房在無菌的條件下解剖后，取出胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。有時也把胚珠連同胎座一起取下來培養(yǎng)。 胚珠培養(yǎng)可以解決像蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體，用于單倍體育種。

43、60; 胚珠培養(yǎng)類型：受精胚珠的培養(yǎng)，未受精胚珠的培養(yǎng)。胚珠的發(fā)育：受精胚珠：一是形成種子；二是形成愈傷組織。未受精胚珠：形成單倍體植株。 將胚珠培養(yǎng)成植株的關(guān)鍵是選擇胚的發(fā)育時期。實驗證明發(fā)育到球形胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功，另外為了培養(yǎng)成功，可取用帶胎座甚至帶部分子房的胚珠進(jìn)行培養(yǎng)。 子房培養(yǎng)是指將子房從母體上分離出來，在無菌的人工環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其生長發(fā)育形成幼苗的過程。 第5章   花藥和花粉培養(yǎng) 花粉和花藥的培養(yǎng)(pollen and anther culture)是指花粉在培養(yǎng)基上改變

44、其正常發(fā)育和機能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。 花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進(jìn)而分化成植株的技術(shù)。 花粉培養(yǎng)是將花粉從花藥中分離出來進(jìn)行離體培養(yǎng)的過程。 適宜時期：單核期,尤其是單核中、晚期(單核靠邊期)。 Ø 壓片染色法：是檢測花粉發(fā)育時期的簡便有效方法，常用染色劑為醋酸洋紅。 花藥培養(yǎng)過程：預(yù)處理:低溫冷藏是最常用的方法,另有離心、低劑量輻射、化學(xué)試劑處理。表面消毒：因為未開放的花蕾中的花藥為花被包裹，本身處于無菌狀態(tài)，可僅用7

45、0酒精棉球?qū)⒒ǖ谋砻娌料醇纯?。也可按對其他器官消毒處理方法進(jìn)行，先用70的酒精浸一下后，在飽和漂白粉溶液中浸1020min，或用0.1升汞液消毒7lOmin，然后用無菌水洗35次。將花蕾剪下放入水中，在冰箱45下保持34d。接種：接種時把花蕾用解剖刀、鑷子小心剝開花蕾，取出花藥，注意去掉花絲，然后散落接種到培養(yǎng)基上，一個l0ml的試管可接種20個花藥。培養(yǎng)溫度在2328左右，每天1116h的光照，光照強度20004000Lx。脫分化培養(yǎng)時，可用MS + 2,4-D的培養(yǎng)基，或N6+2,4-D的培養(yǎng)基，經(jīng)1030d，可誘導(dǎo)生成愈傷組織，或少數(shù)生成胚狀體。培養(yǎng)：一種植物的花藥可

46、以在一種培養(yǎng)基上長幼苗，而在另一種培養(yǎng)基上則形成愈傷組織。如水稻通常在含有生長素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，而在不含任何激素的N6培養(yǎng)基上長出胚狀體。但在辣椒的花藥培養(yǎng)中，只要培養(yǎng)基合適，甚至可以在同一花藥上一部分花粉形成胚狀體，而另一部分只形成愈傷組織。植株的誘導(dǎo)：誘導(dǎo)愈傷組織分化芽或根，需將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。       花粉-愈傷組織-苗；花粉-胚狀體-苗. 花粉培養(yǎng)成苗途徑與花藥培養(yǎng)比較:相同點：胚狀體成苗途徑、愈傷組織再分化成苗途徑。不同點：花粉培養(yǎng)：需進(jìn)行花粉的分離，特殊的花粉誘導(dǎo)培養(yǎng)。難度更

47、大。 簡單的花粉分離方法是花粉從花藥中擠出后，用鑷子取出花粉空殼，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此法適于微室栽培，但往往有藥壁等體細(xì)胞混入。 花粉培養(yǎng)的方法：看護(hù)培養(yǎng)法：在裝有50ml液體培養(yǎng)基的小培養(yǎng)皿中，用解剖針?biāo)洪_花藥釋放出花粉，形成花粉懸浮液，最后稀釋至0.5ml培養(yǎng)基中，含有10個花粉粒的細(xì)胞懸浮液?？醋o(hù)培養(yǎng)時，把花藥放在瓊脂培養(yǎng)基表面上，然后在每個花藥上覆蓋一小塊圓片濾紙。用移液管吸取l滴已準(zhǔn)備好的花粉粒懸浮液，滴在每個小圓片濾紙上。培養(yǎng)在25和一定光照強度下，大約一個月長出細(xì)胞群。由于完整的花藥發(fā)育過程釋放出有利于花粉發(fā)育的物質(zhì)，并通過濾紙供給花粉，促進(jìn)了花粉的發(fā)育。培養(yǎng)

48、的花粉形成胚有兩個途徑：一是花粉核分裂產(chǎn)生營養(yǎng)核和生殖核，以后生殖核退化，營養(yǎng)核則繼續(xù)分裂23周，形成多核花粉，由此形成多核的原胚；二是花粉核直接分裂，再形成胚。 溫室培養(yǎng)法：取含有5080粒花粉的一滴培養(yǎng)液放在溫室培養(yǎng)裝置中，為了防止花粉破裂，應(yīng)在低溫條件下(4以下)接種，然后在20下培養(yǎng)。 花粉培養(yǎng)過程：取花蕾（鏡檢）消毒取花藥預(yù)培養(yǎng)數(shù)天分離花粉接種培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生。 基本培養(yǎng)基：MS和H培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。 u 細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；生長素可誘

49、導(dǎo)愈傷組織形成。 u 細(xì)胞分裂素與生長素比值高時可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗。 基本培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對花粉的誘導(dǎo)生長有一定作用。其原因是花粉母細(xì)胞的滲透壓比花絲等體細(xì)胞高的緣故，即高濃度的蔗糖不利于藥壁、花絲等體細(xì)胞的生長，而利于花粉的生長。 較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。 由花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的花粉植物不僅有單倍體，還有二倍體、三倍體及非整倍體。 l單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生殖、孤雄生殖、無配子生殖。 單倍體植株染色體加倍的方法：單倍體植株營養(yǎng)體瘦小，只含一套染色體而不能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，

50、不能開花結(jié)實，需經(jīng)加倍處理使之成為純和二倍體。 1、自然加倍：通過花粉細(xì)胞核有絲分裂或核融合染色體可自然加倍，從而獲得一定數(shù)量的純合二倍體，其優(yōu)點是不會出現(xiàn)畸形，不足之處是隨機性強，難以掌握和利用。 2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實的二倍體植株。 3、從愈傷組織再生：將單倍體植物（孢子體）的莖段、葉柄、根莖切下，置適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)生愈傷組織，反復(fù)繼代后再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，即可獲得較多二倍體植株。  花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用-單倍體植株育種：1、誘導(dǎo)形

51、成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；常規(guī)育種中，雜交后代自第二代（F2）起開始出現(xiàn)分離，多樣化的性狀分離要持續(xù)到F6代后才能穩(wěn)定。2、有利于篩選隱性突變體，提高選擇效率;3、有利于隱性基因控制性狀的選擇：雜交育種中常因等位基因中隱性基因被顯性基因掩蓋，而使隱性基因控制的性狀不表現(xiàn)，要連續(xù)種植數(shù)代，直至隱性基因純合才出現(xiàn)該基因的性狀。4、快速獲得自交系的超雄株：通常采用連續(xù)人工自交方法，獲得一個自交系至少需6年。 (1)花藥培養(yǎng)是器官培養(yǎng)，花粉培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)。(2)花藥培養(yǎng)一般選擇花粉的單核期進(jìn)行接種。(3)花藥培養(yǎng)包括：選擇材料-消毒-接種培養(yǎng)-愈合組織生成-分化出單倍體植株。(4

52、)花粉的發(fā)育途徑包括：營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育、生殖細(xì)胞發(fā)育、營養(yǎng)和生殖細(xì)胞同時發(fā)育及花粉均等分裂發(fā)育。(5)花粉培養(yǎng)包括花粉的分離-預(yù)處理-培養(yǎng)過程。 第6章   細(xì)胞培養(yǎng)(分為單細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)) 單細(xì)胞培養(yǎng):分離的單細(xì)胞看護(hù)培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、平板培養(yǎng)單細(xì)胞無性系。 制備單細(xì)胞: 愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物(常); 用纖維素酶和果膠酸酶從組織分離。 由組織器官(莖段)經(jīng)愈傷組織分離單細(xì)胞步驟：1）誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；2）愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織松散性；3）將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培

53、養(yǎng)物。優(yōu)點：細(xì)胞團(tuán)成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。 單細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法:看護(hù)培養(yǎng)法、微室培養(yǎng)法、固體平板培養(yǎng)法、液體淺層培養(yǎng)法. 影響單細(xì)胞培養(yǎng)的因子:1)條件培養(yǎng)基；2)初始細(xì)胞植板密度(>臨界密度)；3)生長物質(zhì)；4)pH；5)CO2。 看護(hù)培養(yǎng)法：指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。用途：誘導(dǎo)形成單細(xì)胞系。用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個細(xì)胞，并使其生長和增殖。這個愈傷組織塊稱為看護(hù)愈傷組織. 12 看護(hù)培養(yǎng)（1）優(yōu)點：簡便易行。效果好，易于成功。 （2）缺點：不能在顯

54、微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長過程。 v 微室培養(yǎng)法:將單細(xì)胞培養(yǎng)在少量的培養(yǎng)基中。 v 用途:主要用來觀察細(xì)胞生長、分裂、形成細(xì)胞團(tuán)的過程。 微室培養(yǎng)（1）優(yōu)點：在培養(yǎng)過程中，可以連續(xù)進(jìn)行顯微觀察一個細(xì)胞的生長、分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的全部過程；（2）缺點：培養(yǎng)時間較短. 注意事項:微室內(nèi)無氣泡。微室厚度小于20微米，蓋玻片 的厚度要在0.170.18毫米左右。觀察時要保持溫度和培養(yǎng)時的一致 。 平板培養(yǎng)法:將單個細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。該方法是Bergmann(1960年)

55、首創(chuàng)。用途:分離單細(xì)胞無性系，研究其生理、生化、遺傳上的差異而設(shè)計的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。 初始植板密度：單細(xì)胞固體平板培養(yǎng)時，細(xì)胞懸浮液接種到瓊脂培養(yǎng)基上最初細(xì)胞密度。 條件培養(yǎng)基：曾懸浮培養(yǎng)過一段時間組織或細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。 植板效率（或植板率）：已形成細(xì)胞團(tuán)的百分?jǐn)?shù)（即每100個鋪在平板上的細(xì)胞中有多少個能長出細(xì)胞團(tuán)）。 平板培養(yǎng)的基本技術(shù)：（1）單細(xì)胞懸浮液的制備；(2)懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制；（3）瓊脂培養(yǎng)基配制:0.7 % 瓊脂條件培養(yǎng)基；（4）平板制作；（5)培養(yǎng)。 細(xì)胞懸浮

56、培養(yǎng)：將離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的無菌培養(yǎng) 特點：1）細(xì)胞可不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；       2）能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。 懸浮培養(yǎng)類型：成批培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)。 成批培養(yǎng)/分批培養(yǎng)：將愈傷組織培養(yǎng)在一定容積的密閉容器中進(jìn)行培養(yǎng)。它是進(jìn)行細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。 成批培養(yǎng)特點：培養(yǎng)基體積固定；必須適當(dāng)攪拌；培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長，其數(shù)目不 斷發(fā)生變化，呈S增長；但要進(jìn)行下一批培

57、養(yǎng)，則生長一定時間后，需要繼代轉(zhuǎn)移。  細(xì)胞生長曲線：延遲期、對數(shù)生長期、直線生長期、緩慢期、靜止期。 成批培養(yǎng)的方法：(1)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；(2)往返震蕩培養(yǎng)；(3)旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)；(4)攪動培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持其恒定體積的培養(yǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)的特點：（1）新鮮培養(yǎng)基的不斷加入,保證了養(yǎng)分的充分供應(yīng)；（2）可使細(xì)胞保持在增殖旺盛的對數(shù)生長期中；（3）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。 連續(xù)培養(yǎng)的種類：(1)半連續(xù)培養(yǎng)：每隔一定時間倒出一定量的懸浮液，同時補充加入等量的新鮮

58、培養(yǎng)液。(2)連續(xù)培養(yǎng)：封閉式：培養(yǎng)基維持恒定，細(xì)胞不斷增加；開放式：注入的與流出的（含細(xì)胞）相等，細(xì)胞最高速生長。 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)主要應(yīng)用：1、植物有用物質(zhì)的生產(chǎn)：在植物組織培養(yǎng)研究中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞中含有各種特殊的代謝產(chǎn)物。2、誘發(fā)和篩選突變體：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生一些突變體，常采用不同培養(yǎng)基來進(jìn)行選擇，也就是把懸浮細(xì)胞培養(yǎng)于缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)或生長因子，或是添加某種抑制劑的培養(yǎng)基里，使突變細(xì)胞和正常細(xì)胞區(qū)別開來。 3、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞分離：利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方法，對細(xì)胞原生質(zhì)進(jìn)行分離，在適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使之生成完整植株，或?qū)υw的生理特性進(jìn)行觀察、研究。

59、0;4、食品生產(chǎn)：通過對許多食用植物培養(yǎng)組織的細(xì)胞團(tuán)生產(chǎn)的研究。 連續(xù)培養(yǎng)的方法:（1）濁度恒定法;（2）化學(xué)恒定法。 第7章  原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 原生質(zhì)體：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細(xì)胞。多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料：葉肉細(xì)胞；禾本科植物：愈傷組織或懸浮細(xì)胞。 分離方法：機械分離法；酶法分離法。 機械分離法首先使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離,然后切開細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體。 (1)優(yōu)點：能排除酶的有害影響。(2)缺點：原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；方法繁瑣費力；局限性大。 酶的種類:構(gòu)成植物細(xì)胞壁的三個主要成分是：

60、果膠質(zhì)（占細(xì)胞壁的5） 、纖維素（25-50%）、半纖維素（53%）。纖維素酶類（Cellulase）：纖維素酶是從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑 ，可降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體 。果膠酶類（Pectolyase）：果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來 。半纖維素酶類（Hemicellulase）：降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。 崩潰酶：一種粗制酶。蝸牛酶：主要用于分離小孢子（花粉母細(xì)胞和四分體細(xì)胞）的原生質(zhì)體。 電子天平具有操作簡單，性能穩(wěn)定，稱量速度快，靈敏度高等特點。 注意事項：天

61、平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺或木臺上，室內(nèi)要求清潔、干燥及較恒定的溫度，同時應(yīng)避免光線直接照射到天平上。稱量時應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。前門僅在檢修或清除殘留物質(zhì)時使用。電子分析天平若長時間不使用，則應(yīng)定時通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。天平箱內(nèi)應(yīng)放置吸潮劑（如硅膠），當(dāng)吸潮劑吸水變色，應(yīng)立即高溫烘烤更換，以確保吸濕性能。揮發(fā)性、腐蝕性、強酸強堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。  酶的配比及濃度:胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞用活性大的酶組合，濃度大，用量多，每克材料用酶10-20毫升；葉片、子葉、下胚軸等

62、反之。 滲透壓穩(wěn)定劑及pH:甘露醇，山梨醇，蔗糖，葡萄糖，麥芽糖等及氯化鉀或鈣，磷酸二氫鉀，硫酸鎂等可作穩(wěn)定劑。25-30度，PH5.6-5.8 分離原生質(zhì)體方法:兩步分離法: 先用高糖液使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離，再用機械法破碎組織，適用液泡大的細(xì)胞.一步分離法:用離析酶和纖維素酶。 分離原生質(zhì)體時，首先要讓酶制劑大量地吸附到細(xì)胞壁的纖維素上去，因此，一般先將材料分離成單細(xì)胞，然后分解細(xì)胞壁。采用將酶液減壓滲入組織，或?qū)⒔M織切成薄片等方法，都可增加酶液與纖維素分子接觸的機會。 酶處理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纖維素酶，

63、果膠酶和半纖維素酶組成混合酶溶液，材料在其中處理一次即可得到分離的原生質(zhì)體。植物材料須按比例和酶液混合才能有效地游離原生質(zhì)體，一般去表皮的葉片需酶量較少，而懸浮細(xì)胞則用酶量較大。每克材料用酶液1030ml不等。 酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在無菌條件下將葉面晾干、順葉脈輕輕撕下表皮。若去表皮很困難，也可直接將材料切成小細(xì)條，放入酶液中。對于懸浮細(xì)胞等材料，若細(xì)胞團(tuán)的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過濾一次，將原細(xì)胞團(tuán)去掉，留下較均勻的小細(xì)胞團(tuán)時再進(jìn)行酶解。 酶解處理一般地在黑暗中靜止進(jìn)行，在處理過程中偶爾輕輕搖晃幾下。對于懸浮細(xì)胞，愈