基因診斷與基因治療培訓(xùn)教程

1、目目 錄錄 基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療Gene Diagnosis and Gene Therapy第二十八章第二十八章目目 錄錄目目 錄錄F第一節(jié)第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)F第二節(jié)第二節(jié) 遺傳病的基因診斷遺傳病的基因診斷F第三節(jié)第三節(jié) 傳染病的基因診斷傳染病的基因診斷F第四節(jié)第四節(jié) 腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷F第五節(jié)第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用 F第六節(jié)第六節(jié) 基因治療的概念及策略基因治療的概念及策略 本章內(nèi)容提要本章內(nèi)容提要目目 錄錄目目 錄錄第一節(jié)第一節(jié) 基因診斷學(xué)基礎(chǔ)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)Basis of Gene Diagnostics目目

2、錄錄目目 錄錄基因診斷之父基因診斷之父簡(jiǎn)悅威簡(jiǎn)悅威 1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家年加州大學(xué)華裔科學(xué)家 Kan YW用核酸分子雜交技術(shù)首次對(duì)一例用核酸分子雜交技術(shù)首次對(duì)一例地中海貧地中海貧血進(jìn)行診斷。血進(jìn)行診斷。目目 錄錄目目 錄錄一、一、基因診斷的概念、特點(diǎn)及臨床意義基因診斷的概念、特點(diǎn)及臨床意義 定義：定義： 利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)基因及基利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)基因及基因表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對(duì)人體疾病作出診斷因表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對(duì)人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是的方法?；蛟\斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是DNADNA、RNARNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。，也可以是蛋白質(zhì)或

3、者多肽。 目目 錄錄目目 錄錄診斷依據(jù)診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)改變)lDNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無(wú)到有、癌基因表達(dá)水平其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無(wú)到有、癌基因表達(dá)水平從低到高；從低到高；l基因結(jié)構(gòu)變化，如點(diǎn)突變引起基因失活、染色基因結(jié)構(gòu)變化，如點(diǎn)突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。目目 錄錄目目 錄錄基因診斷的特點(diǎn)基因診斷的特點(diǎn) 高特異性高特異性 高靈敏性高靈敏性 早期診斷性早期診斷性 應(yīng)用廣泛性應(yīng)用廣泛性目目 錄錄目目 錄錄二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)二、基因診斷中常用的分子生

4、物學(xué)技術(shù)n核酸分子雜交（核酸分子雜交（Nucleic acid hybridization） n聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) n單鏈構(gòu)象多態(tài)性（單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） n限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） nDNA序列測(cè)定（序列測(cè)定（DNA sequencing） n生物芯片（生物芯片（biochips） nWestern免疫印跡（免疫印跡（Western blotting） n免疫組織化學(xué)診斷免疫組織化學(xué)診斷 目目 錄錄目目 錄錄（一）核酸分子雜交（一）核酸分子雜交 Nucleic acid hybridization 指兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離指

5、兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離子和有機(jī)溶劑濃度）下，按堿基互補(bǔ)的原則重子和有機(jī)溶劑濃度）下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程。新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程。目目 錄錄目目 錄錄核酸分子雜交流程核酸分子雜交流程 待測(cè)核酸制備待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化濾膜上核酸固化雜交雜交去除未雜交的探針去除未雜交的探針檢測(cè)雜交信號(hào)檢測(cè)雜交信號(hào)核酸探針制備核酸探針制備探針標(biāo)記探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針加入標(biāo)記探針目目 錄錄目目 錄錄 提取提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段生特定長(zhǎng)度的片段凝膠電泳分離凝膠電泳分離 變性處變性處理理DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)

6、合將標(biāo)將標(biāo)記的探針與膜上記的探針與膜上DNA片段雜交，分析雜交信片段雜交，分析雜交信號(hào)。號(hào)。1. Southern 印跡雜交印跡雜交(Southern blotting)目目 錄錄目目 錄錄 RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過(guò)分子雜交檢測(cè)特定到固相支持物上，通過(guò)分子雜交檢測(cè)特定的的mRNA分子的含量與大小。分子的含量與大小。2. Northern印跡雜交印跡雜交(Northern blotting)目目 錄錄目目 錄錄3. 斑點(diǎn)雜交（斑點(diǎn)雜交（dot blotting） 將將RNA或或DNA變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍

7、膜上，用于基因組中特定基因維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。目目 錄錄目目 錄錄 4. 反向斑點(diǎn)雜交反向斑點(diǎn)雜交（reverse dot blotting） 先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品膜上，將樣品RNA或或DNA標(biāo)記變性后進(jìn)行標(biāo)記變性后進(jìn)行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率診斷的效率。目目 錄錄目目 錄錄 寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分寡核苷酸中的堿基錯(cuò)

8、配會(huì)大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對(duì)正常和突變子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對(duì)正常和突變ASO探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交，檢測(cè)點(diǎn)突變，探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交，檢測(cè)點(diǎn)突變，大大大提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。大提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。等位基因特異性寡核苷酸等位基因特異性寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO）目目 錄錄目目 錄錄5. 5. 原位分子雜交原位分子雜交n熒光原位雜交熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization, FISH）n掛鎖掛鎖FISH (FISH with padlock) 目目 錄錄目目 錄錄熒光原

9、位雜交（熒光原位雜交（FISHFISH）目目 錄錄目目 錄錄 6. 固相夾心雜交法固相夾心雜交法(sandwich hybridization) 待測(cè)靶基因序列上兩個(gè)相鄰但不重疊的待測(cè)靶基因序列上兩個(gè)相鄰但不重疊的DNA片段（片段（A、B片段），分別作為捕捉探針（不標(biāo)記片段），分別作為捕捉探針（不標(biāo)記的的A片段）和檢測(cè)探針（標(biāo)記的片段）和檢測(cè)探針（標(biāo)記的B片段），同時(shí)與片段），同時(shí)與靶基因雜交。先將捕捉探針吸附于固相支持物上，靶基因雜交。先將捕捉探針吸附于固相支持物上，與靶基因序列與靶基因序列A部分雜交，再加入標(biāo)記的檢測(cè)探針，部分雜交，再加入標(biāo)記的檢測(cè)探針，檢測(cè)探針與靶基因序列檢測(cè)探針與靶基因

10、序列B部分雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)。部分雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)。目目 錄錄目目 錄錄固相夾心雜交法示意圖固相夾心雜交法示意圖 目目 錄錄目目 錄錄（二）（二） 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction, PCR）模板模板引物引物dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶聚合酶變性變性延伸延伸退火退火目目 錄錄目目 錄錄PCR在基因診斷中的應(yīng)用在基因診斷中的應(yīng)用nRT-PCRRT-PCRn熒光定量熒光定量PCRPCRn多重多重-PCR-PCRnPCR-ASOPCR-ASOnAS-PCRAS-PCRnPCR-SSCPPCR-SSCPnPCR-RFLPPCR-RFLP目

11、目 錄錄目目 錄錄1. RT-PCR目目 錄錄目目 錄錄2. 熒光定量熒光定量PCR熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物目目 錄錄目目 錄錄 3. 多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意圖示意圖 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR目目 錄錄目目 錄錄4. PCR-ASON N：正?；?；：正?；?；H H：雜合子基因；：雜合子基因；M M：突變基因：突變基因ASO1ASO2NHM目目 錄錄目目 錄錄（三）（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA 的突變?cè)斐傻耐蛔冊(cè)斐蒁NA片

12、段中堿基序列不片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開(kāi)來(lái)。差別可使各種序列不同的單鏈分離開(kāi)來(lái)。目目 錄錄目目 錄錄PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意目目 錄錄目目 錄錄正常人正常人純合突變純合突變雜合突變雜合突變+ + PCR-SSCP分析分析 目目 錄錄目目 錄錄 （四）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（四）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）

13、 由于由于DNA 變異產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或原有的酶切變異產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或原有的酶切位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不同位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度或不同數(shù)量的片段。長(zhǎng)度或不同數(shù)量的片段。 可借助核酸分子雜交或可借助核酸分子雜交或PCR進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行檢測(cè)。目目 錄錄目目 錄錄 設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列，在一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列，在PCR擴(kuò)擴(kuò)增后用該限制酶切割增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。PCR-

14、RFLP目目 錄錄目目 錄錄ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoR 限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的變化限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的變化目目 錄錄目目 錄錄（五）（五） DNA序列測(cè)定（序列測(cè)定（DNA sequencing）目目 錄錄目目 錄錄DNA序列測(cè)定原理序列測(cè)定原理(雙脫氧末端終止法雙脫氧末端終止法)目目 錄錄目目 錄錄左側(cè)：正常；右側(cè)突變左側(cè)：正常；右側(cè)突變 序列分析用于基因診斷研究序列分析用于基因診斷研究目目 錄錄目目 錄錄（六）生物芯片（六）生物芯片（biochips）n基因芯片（基因芯片（gene chips）n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip

15、)目目 錄錄目目 錄錄基因芯片雜交流程示意圖基因芯片雜交流程示意圖目目 錄錄目目 錄錄基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法方法優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題解決方案解決方案核酸分子雜交核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣結(jié)果可靠但操作繁瑣選擇合適的探針選擇合適的探針 PCRPCR靈敏度、特異性高靈敏度、特異性高設(shè)計(jì)合適的引物設(shè)計(jì)合適的引物 SSCPSSCP操作簡(jiǎn)便、檢出率不高操作簡(jiǎn)便、檢出率不高選擇合適的片段選擇合適的片段 RFLPRFLP結(jié)果可靠但限制較多結(jié)果可靠但限制較多選擇合適的限制酶選擇合適的限制酶 DNADNA測(cè)序測(cè)序可自動(dòng)化，但不適宜廣泛使用可自動(dòng)化，但不適宜廣

16、泛使用與與PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不適宜廣泛效率高，成本高，不適宜廣泛使用使用選擇合適的芯片選擇合適的芯片目目 錄錄目目 錄錄三、三、 基因診斷技術(shù)路線與方法基因診斷技術(shù)路線與方法 n直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常達(dá)是否異常n間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行連鎖分析 根據(jù)對(duì)致病基因或相關(guān)基因的了解程度決根據(jù)對(duì)致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。目目 錄錄目目 錄錄（一）直接診斷途徑（一）直接診斷途徑

17、 必要條件：必要條件： 被檢測(cè)基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系被檢測(cè)基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系 被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定 被檢基因致病的分子機(jī)制（突變位點(diǎn)或表達(dá)變化）被檢基因致病的分子機(jī)制（突變位點(diǎn)或表達(dá)變化）已知已知目目 錄錄目目 錄錄5/5/3/3/RFLP1. 1.點(diǎn)突變的檢測(cè)點(diǎn)突變的檢測(cè)（1 1）有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)改變）有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)改變目目 錄錄目目 錄錄斑點(diǎn)雜交、反向斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交、反向斑點(diǎn)雜交AS-PCR、PCR-SSCP、 PCR-ASO、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序產(chǎn)物直接測(cè)序5/5/3/3/（2 2）無(wú)限制性酶切位點(diǎn)改變）無(wú)限制性酶切位點(diǎn)改

18、變 目目 錄錄目目 錄錄 在在DNA序列上有一段較長(zhǎng)序列的重新排布。序列上有一段較長(zhǎng)序列的重新排布。包括數(shù)十個(gè)堿基到數(shù)千個(gè)堿基的丟失、插入、替包括數(shù)十個(gè)堿基到數(shù)千個(gè)堿基的丟失、插入、替換、重復(fù)和倒位等，以及染色體突變或畸變，包換、重復(fù)和倒位等，以及染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等。征）等。 2. 2. 基因重排的檢測(cè)基因重排的檢測(cè)核酸分子探針雜交與核酸分子探針雜交與PCR 目目 錄錄目目 錄錄BamHIBamHI 2 2 1 1 2 2 10 kb14 kbprobe - -珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血的

19、直接基因診斷的直接基因診斷- -珠蛋白珠蛋白基因不同程度的缺失可引起基因不同程度的缺失可引起不同類(lèi)型的不同類(lèi)型的 - -珠蛋白生成障礙性貧血珠蛋白生成障礙性貧血目目 錄錄目目 錄錄 根據(jù)引物根據(jù)引物3 3 端的互補(bǔ)與否，設(shè)計(jì)一對(duì)與正端的互補(bǔ)與否，設(shè)計(jì)一對(duì)與正?；蛲蛔兡０迮鋵?duì)的特異引物常或突變模板配對(duì)的特異引物等位基因特異等位基因特異PCR AS-PCR（allele specific PCR）目目 錄錄目目 錄錄3. 基因表達(dá)異常的檢測(cè)基因表達(dá)異常的檢測(cè) mRNA的相對(duì)定量分析的相對(duì)定量分析 mRNA的絕對(duì)定量分析的絕對(duì)定量分析 mRNA長(zhǎng)度分析長(zhǎng)度分析目目 錄錄目目 錄錄（二）間接診斷途徑（

20、二）間接診斷途徑1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病突變機(jī)制不清致病突變機(jī)制不清致病位點(diǎn)不便檢測(cè)致病位點(diǎn)不便檢測(cè)目目 錄錄目目 錄錄 DNA多態(tài)性：多態(tài)性：指群體中的指群體中的DNA分子存分子存在至少兩種不同的類(lèi)型，即個(gè)體間同一染色在至少兩種不同的類(lèi)型，即個(gè)體間同一染色體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異。或變異。 多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。2. 2. 遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記目目 錄錄目目 錄錄

21、間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記三代遺傳標(biāo)記：三代遺傳標(biāo)記： RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)）（基于核酸分子雜交技術(shù)） VNTR (variable number of tandem repeats) ; STR (short tandem repeats) SNP(single nucleotide polymorphism)目目 錄錄目目 錄錄7.6kb13kb患患者者正正常常 HBS的間接基因診斷的間接基因診斷 RFLP標(biāo)記的連鎖分析標(biāo)記的連鎖分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印跡雜交印跡雜交N H PN N：正常；：

22、正常；H H：雜合子；：雜合子；P P：患者（純合子）；黃色區(qū)域?yàn)樘结槪夯颊撸兒献樱稽S色區(qū)域?yàn)樘结樐磕?錄錄目目 錄錄 第二節(jié)第二節(jié) 遺傳病的基因診斷遺傳病的基因診斷Gene Diagnosis of Hereditary Diseases目目 錄錄目目 錄錄一、血紅蛋白?。ㄒ?、血紅蛋白?。╤emoglobinopathy） （一）鐮狀細(xì)胞貧血病（一）鐮狀細(xì)胞貧血病 （二）（二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥珠蛋白生成障礙性貧血癥 二、血友病（二、血友?。℉emophilia） 甲型血友病基因診斷甲型血友病基因診斷 三、脆性三、脆性X綜合征綜合征 目目 錄錄目目 錄錄（一）鐮狀細(xì)胞貧血病（一）鐮

23、狀細(xì)胞貧血病一、血紅蛋白病一、血紅蛋白病1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷ASO雜交法雜交法2.HBS的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析3.HBS的的PCR-RFLP分析分析 目目 錄錄目目 錄錄n正常的（正常的（N）的）的ASO探針：探針： 5 -ACT CCT GAG GAG AAG TCT GC-3 n突變的（突變的（M）的）的ASO探針：探針： 5 -ACT CCT GTG GAG GAAG TCT GC-3 1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷ASO雜交法雜交法目目 錄錄目目 錄錄斑點(diǎn)雜交結(jié)果斑點(diǎn)雜交結(jié)果 N N：正常；：正常；M M突

24、變突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者ASO雜交法檢測(cè)雜交法檢測(cè)N-ASOM-ASO正常正常 突變突變 突變突變純合子純合子 雜合子雜合子 純合子純合子5 3 正?；蛘；?.15kb(CCT GAG G)5 3 突變基因突變基因1.35kb(CCT GTG G)鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析Mst酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)（CCTNAGG）2. HBS的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析目目 錄錄0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突變攜帶者突變攜帶者患者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析鐮狀紅細(xì)胞貧血病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析目目 錄錄目

25、目 錄錄目目 錄錄3. HBS的的PCR-RFLP分析分析 正常人的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)正常人的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp兩個(gè)片段，而鐮狀細(xì)兩個(gè)片段，而鐮狀細(xì)胞貧血癥患者的胞貧血癥患者的DNADNA片段不被酶切，仍為片段不被酶切，仍為110bp110bp，雜合子可見(jiàn)三條帶，雜合子可見(jiàn)三條帶正常人正常人雜合體雜合體患者患者M(jìn)arker目目 錄錄目目 錄錄1. PCR-RFLP分析分析 -珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測(cè)突變的檢測(cè) M：pBR322 DNA/Msp I; 1:未酶解片段；未酶解片段； 2：b

26、A/ bA； 3：bA/ bT； 4：bT/ bT注：由于注：由于54bp、114 bp、72 bp片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于200 bp的片段太小，在的片段太小，在0.8的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二）（二） - -珠蛋白生成障礙性貧血癥珠蛋白生成障礙性貧血癥目目 錄錄目目 錄錄 -珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點(diǎn)雜交分析珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點(diǎn)雜交分析2. 2. 反向斑點(diǎn)雜交反向斑點(diǎn)雜交目目 錄錄目目 錄錄二、血友?。ǘ⒀巡。℉emophilia）n甲型血友病是由于血漿凝血因子甲型血友病是由于血漿凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成

27、。）缺陷造成。n甲型血友病的基因突變類(lèi)型已有甲型血友病的基因突變類(lèi)型已有300余種，余種，其中點(diǎn)突變占其中點(diǎn)突變占174種；另有部分患者是由于種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致。的基因倒位所致。目目 錄錄目目 錄錄1. FVIII基因倒位的基因倒位的DNA印跡分析印跡分析 將基因組將基因組DNA用用Nco I，Dra I或或Bcl I等內(nèi)切酶等內(nèi)切酶（酶切位點(diǎn)位于交換點(diǎn)兩側(cè)）消化，用特異探針進(jìn)行（酶切位點(diǎn)位于交換點(diǎn)兩側(cè)）消化，用特異探針進(jìn)行雜交分析，正常人表現(xiàn)為雜交分析，正常人表現(xiàn)為21.5 kb、14 kb和和16 kb三種三種類(lèi)型。類(lèi)型。I

28、型倒位患者表現(xiàn)為型倒位患者表現(xiàn)為20、17.5和和14 kb三種類(lèi)型；三種類(lèi)型；型倒位患者表現(xiàn)為型倒位患者表現(xiàn)為20、16和和15.5 kb三種帶型。在三種帶型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。 目目 錄錄目目 錄錄2. FVIII基因突變的檢測(cè)基因突變的檢測(cè)（1）依賴(lài)于）依賴(lài)于FVIII基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記的連鎖分析的連鎖分析（2）RFLP連鎖分析連鎖分析（3）VNTR分析分析（4）短串聯(lián)重復(fù)序列（）短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）的連鎖分析）的連鎖分析目目 錄錄目目 錄錄三、脆性三、脆性X綜合征綜合征n脆性脆

29、性 X 智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的定的(CGG)n 三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)增以及相鄰三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)增以及相鄰CpG 島的異常甲基化。島的異常甲基化。n正常人中約為正常人中約為 850 拷貝?？截悺男性和女性攜帶者增多到男性和女性攜帶者增多到52200拷貝，相鄰的拷貝，相鄰的CpG 島島未被甲基化，稱(chēng)為前突變（未被甲基化，稱(chēng)為前突變（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表達(dá)的女性中，達(dá)到男性患者和脆性部位高表達(dá)的女性中，達(dá)到2001000拷貝，相鄰的拷貝，相鄰的CpG島也被甲基化，稱(chēng)為全突變（島也被甲基化，稱(chēng)為全突變

30、（full mutation）。）。 n全突變可關(guān)閉相鄰全突變可關(guān)閉相鄰FMR1基因的表達(dá)，基因的表達(dá)，F(xiàn)MR1 mRNA在在幾乎所有患者不表達(dá)或只有低表達(dá)，從而出現(xiàn)臨床癥狀。幾乎所有患者不表達(dá)或只有低表達(dá)，從而出現(xiàn)臨床癥狀。目目 錄錄目目 錄錄脆性脆性X綜合征常用基因診斷方法綜合征常用基因診斷方法1PCR-ASO 2DNA連鎖分析連鎖分析 3Souhern印跡雜交法印跡雜交法4PCR擴(kuò)增擴(kuò)增 第三節(jié)第三節(jié) 傳染病的基因診斷傳染病的基因診斷 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目 錄錄 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）

31、HAV系系RNA病毒，利用病毒，利用RT-PCR技術(shù)可從糞便技術(shù)可從糞便中檢測(cè)出甲型肝炎病毒的基因組中檢測(cè)出甲型肝炎病毒的基因組RNA。 n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV） 設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物，擴(kuò)增各型設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物，擴(kuò)增各型HBV DNA片片段；設(shè)計(jì)位于可變區(qū)的引物擴(kuò)增某一亞型段；設(shè)計(jì)位于可變區(qū)的引物擴(kuò)增某一亞型HBV DNA，以便分型。以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV） HCV為正鏈為正鏈RNA病毒，先反轉(zhuǎn)錄成病毒，先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再，再進(jìn)行巢式進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)檢測(cè)HCV。 目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄二、細(xì)菌引起的疾病二、細(xì)菌引起的疾病n結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝

32、桿菌 先設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用先設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出一技術(shù)擴(kuò)增出一383 bp序列，再用探針序列，再用探針雜交，靈敏度可達(dá)到雜交，靈敏度可達(dá)到100個(gè)細(xì)菌水平。個(gè)細(xì)菌水平。n幽門(mén)螺桿菌（幽門(mén)螺桿菌（HP） 主要采用主要采用PCR技術(shù)：檢測(cè)技術(shù)：檢測(cè)HP染染色體色體DNA特異片段；檢測(cè)特異片段；檢測(cè)HP尿素酶尿素酶A基因；用基因；用PCR-RFLP鑒別鑒別HP菌株。菌株。目目 錄錄目目 錄錄三、寄生蟲(chóng)及衣原體感染三、寄生蟲(chóng)及衣原體感染n瘧原蟲(chóng)瘧原蟲(chóng) n卡氏肺孢子蟲(chóng)卡氏肺孢子蟲(chóng)n衣原體感染衣原體感染 診斷方法：核酸雜交和診斷方法：核酸雜交和PCR技術(shù)技術(shù) 目目 錄錄目目 錄錄第四

33、節(jié)第四節(jié) 腫瘤的基因診斷腫瘤的基因診斷Gene Diagnosis of Malignant Tumors目目 錄錄目目 錄錄一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè) 二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷 乳腺癌乳腺癌 結(jié)腸癌結(jié)腸癌 目目 錄錄目目 錄錄一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)1原癌基因的檢測(cè)原癌基因的檢測(cè) ras 基因家族由基因家族由H-ras、K-ras和和N-ras組成。最常見(jiàn)組成。最常見(jiàn)的突變是第的突變是第12、13、59或第或第61位密碼子的點(diǎn)突變。位密碼子的點(diǎn)突變。 胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以K-ras突變?yōu)?/p>

34、主，如第突變?yōu)橹?，如?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸的位密碼子突變，由編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)橥蛔優(yōu)門(mén)GT、GTT或或GAT，少數(shù)突變?yōu)椋贁?shù)突變?yōu)镚CT。 急性淋巴細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病等以急性淋巴細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病等以N-ras突變?yōu)橹?；泌尿系統(tǒng)腫瘤則以突變?yōu)橹鳎幻谀蛳到y(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹?。突變?yōu)橹?。目?錄錄目目 錄錄 PCR 及及PCR-SSCP分析：分析：擴(kuò)增擴(kuò)增ras 基因第基因第12位密碼子點(diǎn)突變部位，再用位密碼子點(diǎn)突變部位，再用SSCP技術(shù)進(jìn)行分技術(shù)進(jìn)行分析，或者直接測(cè)序確定患者析，或者直接測(cè)序確定患者ras原癌基因的點(diǎn)突原癌基因的點(diǎn)突變。變。 核苷

35、酸雜交技術(shù)（如核苷酸雜交技術(shù)（如ASO）：）：檢測(cè)檢測(cè)ras基因基因第第12位密碼子點(diǎn)突變。位密碼子點(diǎn)突變。2. ras原癌基因突變常用的檢測(cè)方法原癌基因突變常用的檢測(cè)方法目目 錄錄目目 錄錄3抑癌基因抑癌基因p53的檢測(cè)的檢測(cè) np53基因以密碼子第基因以密碼子第175位、第位、第248位、第位、第249位、位、第第273位及位及 第第282位點(diǎn)突變率最高。在結(jié)直腸癌、位點(diǎn)突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌，都可見(jiàn)異常的乳腺癌、小細(xì)胞肺癌，都可見(jiàn)異常的p53基因基因蛋白。蛋白。np53的基因診斷方法有的基因診斷方法有 （1）PCR-SSCP分析技術(shù)分析技術(shù) （2）DNA序列分析序列分

36、析 （3）PCR-RFLP分析分析目目 錄錄目目 錄錄（一）乳腺癌（一）乳腺癌 1乳腺癌常見(jiàn)基因變異乳腺癌常見(jiàn)基因變異 5%10%乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（基因（breast cancer gene）的突變。）的突變。 BRAC1突變易致乳腺癌。突變分布于整個(gè)編突變易致乳腺癌。突變分布于整個(gè)編碼序列，沒(méi)有明顯的突變簇或突變熱點(diǎn)。碼序列，沒(méi)有明顯的突變簇或突變熱點(diǎn)。70%的缺的缺失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止。失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止。BRCA1在在N端的一半部位截短，與乳腺

37、癌和卵巢癌端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；而在的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；而在C端截短則主要與乳腺癌高危端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。有關(guān)。 BRCA2基因在基因在30%40%的散發(fā)性乳腺癌有雜的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（合性缺失（LOH）。突變提高乳腺癌易感性。）。突變提高乳腺癌易感性。二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷目目 錄錄目目 錄錄（1）PCR法檢測(cè)法檢測(cè)BRCA1基因突變基因突變（2）熒光原位雜交（）熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)）檢測(cè)BRCA2基基因擴(kuò)增因擴(kuò)增2乳腺癌基因診斷方法乳腺癌基因診斷方法目目 錄錄目目 錄錄（二）結(jié)腸癌（二）結(jié)腸癌 1.結(jié)腸癌常見(jiàn)基因變異結(jié)腸癌

38、常見(jiàn)基因變異 在癌發(fā)展過(guò)程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。在癌發(fā)展過(guò)程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。 APC（adenomatous polyposis coli）是結(jié)腸癌發(fā)）是結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中第一個(gè)突變基因。生過(guò)程中第一個(gè)突變基因。K-ras原癌基因突變也是原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。結(jié)腸癌形成的早期事件。 DCC（deletion of colorectal cancer）基因失活）基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因DPC4和和MADR2也可能會(huì)因也可能會(huì)因18q等位基因丟失而失活。等位基因丟失而失活。 p53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過(guò)程的晚期現(xiàn)

39、象?；虻耐蛔兪墙Y(jié)腸癌發(fā)展過(guò)程的晚期現(xiàn)象。 DNA修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或或hPMS2基因的突變所致的基因的突變所致的DNA錯(cuò)錯(cuò)配修復(fù)缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。配修復(fù)缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷目目 錄錄目目 錄錄（1）PCR-SSCP法：法：對(duì)腺瘤樣息肉病人對(duì)腺瘤樣息肉病人APC基基因因PCR-SSCP技術(shù)進(jìn)行分析。技術(shù)進(jìn)行分析。（2）異源雙鏈）異源雙鏈PCR法：法：檢測(cè)檢測(cè)APC基因變異?；蜃儺?。（3）蛋白質(zhì)免疫印跡法：）蛋白質(zhì)免疫印跡法：檢測(cè)因基因突變而縮檢

40、測(cè)因基因突變而縮短了的短了的APC蛋白。蛋白。 2結(jié)腸癌基因診斷方法結(jié)腸癌基因診斷方法第五節(jié)第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄n重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)連多次重復(fù)，稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。在人群中存在變異，形成多態(tài)性。n串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體上。串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體上。n重復(fù)單位重復(fù)單位625 bp長(zhǎng)，

41、稱(chēng)為小衛(wèi)星長(zhǎng)，稱(chēng)為小衛(wèi)星DNA。重復(fù)單位重復(fù)單位26 bp長(zhǎng)，如（長(zhǎng)，如（TA）n, (CGG)n等，等，稱(chēng)為微衛(wèi)星稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA。一、一、DNADNA指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記目目 錄錄目目 錄錄 可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR) 人類(lèi)染色體上小衛(wèi)星人類(lèi)染色體上小衛(wèi)星DNA的高度可變區(qū)的高度可變區(qū)（HVR）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat，TR）組成，）組成，TR的核心序列的核心序列同源性很高，等位同源性很高，等位HVR的長(zhǎng)度由于的長(zhǎng)度由于TR的重復(fù)的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。次數(shù)不同而有很

42、大的差別，具高度多態(tài)性。目目 錄錄目目 錄錄 DNA長(zhǎng)度多態(tài)除可用長(zhǎng)度多態(tài)除可用Southern印跡雜交法印跡雜交法檢測(cè)外，還可以通過(guò)檢測(cè)外，還可以通過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出。擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP） 1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家年，英國(guó)遺傳學(xué)家Jeffeys等人用等人用TR的核心的核心序列為探針進(jìn)行序列為探針進(jìn)行RFLP分析時(shí)，檢測(cè)到許多分析時(shí)，檢測(cè)到許多HVR，并產(chǎn)生相應(yīng)的圖，并產(chǎn)生相應(yīng)的圖譜，所得圖譜具有高度譜，所得圖譜具有高度的個(gè)體特異性，達(dá)到了的個(gè)體特異性，達(dá)到了如

43、同人類(lèi)指紋那樣的高如同人類(lèi)指紋那樣的高度專(zhuān)一性，所以稱(chēng)其為度專(zhuān)一性，所以稱(chēng)其為DNA指紋圖譜（指紋圖譜（DNA fingerprinting）。）。 Alec John JeffreysOxford, United Kingdom 目目 錄錄目目 錄錄目目 錄錄人類(lèi)人類(lèi)DNADNA指紋圖指紋圖目目 錄錄目目 錄錄二、二、DNA指紋與法醫(yī)學(xué)診斷指紋與法醫(yī)學(xué)診斷n個(gè)體識(shí)別和親子鑒定：個(gè)體識(shí)別和親子鑒定： DNA指紋技術(shù)是從指紋技術(shù)是從基因水平檢測(cè)基因水平檢測(cè)DNA的高度多態(tài)性，個(gè)體識(shí)的高度多態(tài)性，個(gè)體識(shí)別率高。別率高。n以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血型

44、、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和型、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和HLA分型，分型，個(gè)體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)個(gè)體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認(rèn)證。一認(rèn)證。目目 錄錄目目 錄錄法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù)法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù)nVNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列/小衛(wèi)星）的小衛(wèi)星）的核酸分子雜交分析核酸分子雜交分析nSTR（短串聯(lián)重復(fù)序列（短串聯(lián)重復(fù)序列/微衛(wèi)星）的微衛(wèi)星）的PCR分分析析nSNP的基因芯片檢測(cè)的基因芯片檢測(cè)目目 錄錄目目 錄錄1單位點(diǎn)探針檢測(cè)及單位點(diǎn)探針檢測(cè)及PI值的計(jì)算值的計(jì)算 父權(quán)指數(shù)（父權(quán)指數(shù)（Paternity Index，PI）值、父）值、父

45、權(quán)相對(duì)指數(shù)或親子關(guān)系概率值計(jì)算方法基本一權(quán)相對(duì)指數(shù)或親子關(guān)系概率值計(jì)算方法基本一致。致。 PI值表示爭(zhēng)議父作為親父比隨機(jī)男人作為值表示爭(zhēng)議父作為親父比隨機(jī)男人作為親父的可能性大多少倍，親父的可能性大多少倍，PI值大于值大于1表示傾向表示傾向肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于0時(shí)表示排除父子關(guān)系時(shí)表示排除父子關(guān)系。目目 錄錄目目 錄錄 2DNA指紋圖與親權(quán)鑒定指紋圖與親權(quán)鑒定 多位點(diǎn)多位點(diǎn)VNTR系統(tǒng)和系統(tǒng)和DNA指紋圖的電指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計(jì)算復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)分布的計(jì)算

46、復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別時(shí)匹配概率的計(jì)算影響因素較多，目前別時(shí)匹配概率的計(jì)算影響因素較多，目前尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的最合理的計(jì)算方法。尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的最合理的計(jì)算方法。 目前解決親權(quán)糾紛最簡(jiǎn)單的辦法是先在目前解決親權(quán)糾紛最簡(jiǎn)單的辦法是先在孩子孩子DNA指紋圖中找出非母片段并計(jì)數(shù)為指紋圖中找出非母片段并計(jì)數(shù)為P，然后分析爭(zhēng)議父然后分析爭(zhēng)議父DNA指紋圖，看指紋圖，看P條非母帶條非母帶在爭(zhēng)議父中出現(xiàn)多少條。在爭(zhēng)議父中出現(xiàn)多少條。目目 錄錄目目 錄錄親權(quán)鑒定與親權(quán)鑒定與DNA指紋圖指紋圖由此圖可推斷出：由此圖可推斷出：A和和C是親生女兒；是親生女兒；B為妻子和其前夫所生；為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女。為養(yǎng)

47、女。 第六節(jié)第六節(jié) 基因治療的概念及策略基因治療的概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目目 錄錄n基因治療：基因治療：指將目的基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移指將目的基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，目導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病起治療作用。的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病起治療作用。 目目 錄錄 狹義基因治療：狹義基因治療：指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，

48、目的基因表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。 廣義基因治療：廣義基因治療： 外源正?；?qū)氩∽兗?xì)胞，產(chǎn)生正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物外源正常基因?qū)氩∽兗?xì)胞，產(chǎn)生正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物以補(bǔ)充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)；以補(bǔ)充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)； 采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的基因；采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的基因； 將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物；將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物； 向功能異常的細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來(lái)不存向功能異常的細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來(lái)不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達(dá)產(chǎn)物

49、達(dá)到在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。治療疾病的目的。目目 錄錄本節(jié)內(nèi)容提要本節(jié)內(nèi)容提要 一、基因治療的策略一、基因治療的策略二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)三、基因干預(yù)三、基因干預(yù)四、基因治療的應(yīng)用研究四、基因治療的應(yīng)用研究五、基因治療的前景與問(wèn)題五、基因治療的前景與問(wèn)題目目 錄錄目目 錄錄基因治療分類(lèi)基因治療分類(lèi)體細(xì)胞體細(xì)胞(somatic cell)基基因治療因治療生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞(germline)基基因治療因治療v只限于某一體細(xì)胞的只限于某一體細(xì)胞的基因的改變基因的改變v只限于某個(gè)體的當(dāng)代只限于某個(gè)體的當(dāng)代v對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正行

50、矯正v當(dāng)代及子代當(dāng)代及子代目目 錄錄目目 錄錄 一、基因治療的策略一、基因治療的策略目目 錄錄 （一）基因置換（一）基因置換（gene replacement） 定義：定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，導(dǎo)入的正?；颍灾脫Q基因組內(nèi)過(guò)定位重組，導(dǎo)入的正常基因，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。原有的缺陷基因。 目的：目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。 對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。不涉及基因組的任何改變。 目目 錄錄n定向整合的條件定向整合的

51、條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換。列的交換。n基因同源重組技術(shù)又稱(chēng)為基因同源重組技術(shù)又稱(chēng)為基因打靶基因打靶(gene targeting）n細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低。細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低?；蛲粗亟M技術(shù)基因同源重組技術(shù)目目 錄錄（二）（二） 基因添加基因添加（gene augmentation） 定義定義: : 通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身 不表達(dá)的基因。不表達(dá)的

52、基因。類(lèi)型類(lèi)型: :n在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；?，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；n向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。目目 錄錄（三）基因干預(yù)（三）基因干預(yù)（gene interference） 定義：定義： 采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表或

53、者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。目目 錄錄n定義：定義：將將“自殺自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。n應(yīng)用：應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。（四）自殺基因治療（四）自殺基因治療(Suicide Gene Therapy)目目 錄錄目目 錄錄自殺基因的作用機(jī)制自殺基因

54、的作用機(jī)制 目目 錄錄TK/GCV 單純皰疹病毒（單純皰疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類(lèi)基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類(lèi)似物丙氧鳥(niǎo)苷（似物丙氧鳥(niǎo)苷（ganciclovir, GCV）轉(zhuǎn)變成毒轉(zhuǎn)變成毒性性GCV三磷酸核苷，后者能抑制三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。1.自殺基因系統(tǒng)自殺基因系統(tǒng)目目 錄錄 定義定義: “自殺基因自殺基因”導(dǎo)入后，不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了導(dǎo)入后，不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后

55、被殺死，的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因自殺基因”的腫瘤的腫瘤細(xì)胞也被殺死。細(xì)胞也被殺死。 2. 旁觀者效應(yīng)（旁觀者效應(yīng)（bystander effect）目目 錄錄 （五）基因免疫治療（五）基因免疫治療 通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)?？拱┟庖叻磻?yīng)。 目目 錄錄二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基因治療的兩種途徑基因治療的兩種途徑載體載體目的基因目的基因in vivoex vivo靶細(xì)胞目目 錄錄目目 錄錄 基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移(

56、gene transfer)技術(shù)技術(shù) 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移目目 錄錄 1. 1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有有72%72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%71%的病例使用了的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體體。目目 錄錄反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1 1）反轉(zhuǎn)錄病毒）反轉(zhuǎn)錄病毒

57、 目目 錄錄p兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列LTR。 反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) pLTR由由U3、R和和U5三部分組成。三部分組成。p病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因p5端端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（下游有一段病毒包裝所必需的序列（）及剪接）及剪接供體位點(diǎn)供體位點(diǎn)(SD)和剪接受體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)(SA)。 p含有負(fù)鏈含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和正鏈和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)的引物結(jié)合位點(diǎn)。l在在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子； l U3和和U5兩端分別有病毒整合序列兩端分別有

58、病毒整合序列(IS) ；l 在在R內(nèi)還有內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。加尾信號(hào)。 lgag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；lpol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；lenv基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 目目 錄錄反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 由兩部分組成由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺陷型，保留了病毒其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號(hào)的包裝信號(hào)，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆

59、并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成以克隆并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。有增殖能力的病毒顆粒。 輔助細(xì)胞株輔助細(xì)胞株(如如PA317)：由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號(hào)號(hào)的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。能合成包裝蛋的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。裝成輔助病毒顆粒。 目目 錄錄目目 錄錄Retroviral packaging system目目 錄錄 反轉(zhuǎn)錄病毒載

60、體的特點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn) 反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使反轉(zhuǎn)錄病乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。 反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和和pol的缺失不影響其的缺失不影響其他部分的活性。他部分的活性。 前病毒通過(guò)前病毒通過(guò)LTR高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。 包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病包