血流感染的早期診斷與病原菌識(shí)別

1、會(huì)計(jì)學(xué)1血流感染的早期診斷與病原菌識(shí)別血流感染的早期診斷與病原菌識(shí)別0 01 1020203030404 血流感染的定義、診斷及流行病學(xué) 早期診斷與病原菌識(shí)別的方法-血培養(yǎng)相關(guān)問題早期診斷與病原菌識(shí)別-感染標(biāo)志物相關(guān)問題 早期診斷與病原菌識(shí)別-分子生物學(xué)檢測相關(guān)問題目目 錄錄 血培養(yǎng) 1 次或 1 次以上陽性 , 陽性病原體與其他感染部位無關(guān)。 患者至少有以下 1 項(xiàng)癥狀或體征 : 發(fā)熱 (38 )、 寒戰(zhàn)或低血壓 , 同時(shí)至少滿足以下任意 1 項(xiàng) : 若血培養(yǎng)為常見的皮膚寄植菌需有不同時(shí)間 2 次或 2 次以上的血培養(yǎng)陽性。 若血培養(yǎng)為上述常見皮膚寄植菌 , 血培養(yǎng)僅 1 次陽性則需同時(shí)有靜

2、脈導(dǎo)管培養(yǎng)為陽性的同一病原菌且已開始正確的抗微生物治療。血抗原測定陽性 , 且癥狀、 體征、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果不能用其他部位的感染來解釋全球：全球：18001800萬病例萬病例 美國：確診病例美國：確診病例130130萬萬 歐洲和日本：確診病例歐洲和日本：確診病例190190萬萬每年治療費(fèi)用：每年治療費(fèi)用： 167167億美金美國億美金美國 6767億美金歐洲億美金歐洲 導(dǎo)致死亡病種排名第十位導(dǎo)致死亡病種排名第十位 每年導(dǎo)致大約每年導(dǎo)致大約4040萬人死亡萬人死亡 敗血癥在敗血癥在1010年間增加了年間增加了139139 非心內(nèi)非心內(nèi)ICUICU病區(qū)最常見的死亡病因病區(qū)最常見的死亡病因 在在13013

3、0萬病例中，有萬病例中，有7878萬例發(fā)生在萬例發(fā)生在ICUICU病區(qū)病區(qū)Crit Care Med 2001; 29: 1303-10國內(nèi)血國內(nèi)血流感染的病死率流感染的病死率結(jié)論：普通住院患者BSI的病死率為20.7%，燒傷、血液病腫瘤以及ICU患者病死率更高，而新生兒病房、肝病及糖尿病患者則相對較低。醫(yī)院BSI 病死率為26.8%，明顯高于社區(qū)BSI的病死率。近幾十年來，BSI住院病死率呈下降趨勢。病死率臨床表現(xiàn)血培養(yǎng)治療問題 血流感染血流感染病情兇險(xiǎn)病情兇險(xiǎn)，死亡率，死亡率高達(dá)高達(dá)26-26-41%41% 陽性率低，陽性率低，培養(yǎng)結(jié)果所培養(yǎng)結(jié)果所需時(shí)間長（需時(shí)間長（2-52-5天）天）

4、臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)缺乏特異性缺乏特異性，診斷困難，診斷困難 不恰當(dāng)?shù)慕?jīng)不恰當(dāng)?shù)慕?jīng)驗(yàn)性治療易導(dǎo)驗(yàn)性治療易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥及致細(xì)菌耐藥及醫(yī)療資源浪費(fèi)醫(yī)療資源浪費(fèi) 血流感染早期診斷治療存在的問題血流感染早期診斷治療存在的問題 快速檢測方法，包括原位分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、基因芯片、質(zhì)譜技術(shù)等 針對免疫和炎癥反應(yīng)的指標(biāo);包括TNF-a、PCT、IL-6、CRP、乳酸及內(nèi)毒素等，特異性差 血培養(yǎng)血培養(yǎng)分子生分子生物學(xué)檢物學(xué)檢測測感染標(biāo)感染標(biāo)志物檢志物檢測測血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但陽性率低，檢測周期長（3-7天）臨床細(xì)菌/真菌檢測常用的方法生化表型全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)對2004年1月-2005年12月

5、入住Robert Wood Johnson大學(xué)附屬醫(yī)院及Duke大學(xué)醫(yī)療中心且血培養(yǎng)陽性的成人患者進(jìn)行回顧性分析，患者在24h內(nèi)均接受 3次血培養(yǎng)研究旨在評估血培養(yǎng)次數(shù)與陽性率的相關(guān)性Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):3546354824小時(shí)血培養(yǎng)次數(shù)3次或4次的患者，前兩次血培養(yǎng)的陽性率99%陽性率Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):35463548研究期間，共發(fā)生58例由多種病原體導(dǎo)致的血流感染，該類患者前三次血培養(yǎng)的陽性率為10

6、0%陽性率N=58例Lee A et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY.2007;45(11):35463548導(dǎo)致血流感染的G-菌、G+菌、厭氧菌及真菌，其血培養(yǎng)的陽性率均與采血體積相關(guān)陽性率標(biāo)準(zhǔn)體積：采血量為7-10ml,平均8.7ml; 低體積：采血量2.455微克/L,診斷G-菌BSI的敏感度為71.4%，特異度96.2%。在G+菌血流感染所致膿毒癥患者，PCT的AUC為0.619，最佳診斷臨界值1.585微克/L,敏感度41.2、特異度82診斷細(xì)菌性BSI時(shí)，血漿PCT的敏感性和特異性較血清CRP、血漿內(nèi)毒素明顯增高結(jié)論結(jié)論：G-菌血流感染所致

7、膿毒癥患者PCT、CRP、內(nèi)毒素水平高于G+菌血流感染者，三者聯(lián)合檢測有望成為早期判斷血流感染所致膿毒癥及其病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熒光原位雜交技術(shù)基因芯片技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)核酸雜交技術(shù)核酸雜交是指具有一定互補(bǔ)序列的2條核酸單鏈在液相或固相體系中按堿基互補(bǔ)配對原則形成同源或異源雙鏈分子的過程。核酸雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的2條條單鏈之間進(jìn)行。其中，熒光原位雜交技術(shù)（熒光原位雜交技術(shù)（FISHFISH）應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定工作已有10余年，其檢測的敏感性和特異性可達(dá)到96-100%革蘭陰性菌：商品化試劑盒eco/kpn/paeEfa/其它腸球Sau/sc

8、nCal/cgl/其它念珠菌報(bào)道Salmonella spp.90min PNA FISH完成Appl Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301J Clin Microbiol. 2009; 47: 247 新的熒光原位雜交技術(shù)對血培養(yǎng)陽性快速病原體識(shí)別結(jié)果顯示：152例患者血培養(yǎng)陽性的個(gè)標(biāo)本中，F(xiàn)ISH鑒定細(xì)菌生長的陽性例標(biāo)本數(shù)145個(gè)。在病原菌鑒別中138例準(zhǔn)確，7例錯(cuò)誤，微生物識(shí)別準(zhǔn)確率95.2%,可信區(qū)間95%。在需氧菌和厭氧菌的鑒別沒有差異。對血培養(yǎng)陽性病原菌鑒別時(shí)間為30分鐘，上機(jī)時(shí)間

9、僅需10分鐘。結(jié)論：熒光原位雜交技術(shù)對于血流感染的快速診斷和病原菌精確識(shí)別具有重要的臨床意義對照性研究通過對疑似侵襲性真菌感染患者血培養(yǎng)和腦脊液中病原體的檢測，以評價(jià)FISH技術(shù)的診斷價(jià)值。在112份腦脊液標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測真菌的陽性率稍高于傳統(tǒng)墨汁染色顯微鏡檢測值（48/46），且陽性結(jié)果敏感性和特異性均為100%。對血標(biāo)本中病原菌的鑒別能力傳統(tǒng)方法、PCR-RFLP及FISH沒有差異（14/30）血培養(yǎng)確定微生物生長后進(jìn)行病原菌識(shí)別的平均時(shí)間有明顯差異，傳統(tǒng)顯微鏡識(shí)別、PCR-RFLP及FISH分別為6天、12小時(shí)和5小時(shí)結(jié)論：熒光原位雜交技術(shù)在侵襲性真菌感染的病原菌識(shí)別方面具有重要價(jià)值

10、基因芯片(gene chip)基因芯片也稱DNA微陣列，可分固相基因芯片和液相基因芯片?；蛐酒瑱z測基本原理是將已知的核酸片段固定在一定的固相支持物表面制成核酸探針，利用堿基互補(bǔ)原理，使其與待測DNA標(biāo)本進(jìn)行雜交反應(yīng)，從而獲得需要的生物學(xué)信息。液相基因芯片是近年來發(fā)展出的一種新的芯片技術(shù)，與固相芯片相比，液相芯片在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)速度、檢測敏感性、穩(wěn)定性以及自動(dòng)化程度方面都有較大的優(yōu)越性商品化基因芯片血流感染病原體檢測均應(yīng)用于陽性血培養(yǎng)物（血培養(yǎng)陽性病原菌鑒定）結(jié)果：標(biāo)本病原菌識(shí)別率為86%（1807/2017），敏感率為94.7%（95%CI），特異性為98.8%。而對MRSA的特異性為10

11、0%。病原菌檢測時(shí)間僅需18小時(shí)結(jié)論：基因芯片技術(shù)對細(xì)菌種類進(jìn)行最終鑒定具有較傳統(tǒng)血培養(yǎng)敏感性高、特異性強(qiáng)及時(shí)間更短的特點(diǎn)。有利于臨床膿毒癥快速診斷和早期治療?；蛐酒夹g(shù)對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌種類準(zhǔn)確、快速鑒定的一項(xiàng)觀察性研究對英國和芬蘭兩個(gè)醫(yī)學(xué)中心3318例疑似膿毒癥患者的2107份血培養(yǎng)陽性標(biāo)本用新型的PCR擴(kuò)增和基因芯片技術(shù)檢測鑒定血標(biāo)本中病原菌，并與常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)方法對照 質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)技術(shù)，尤其是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)，具有簡便、快速及特異地分析微生物大分子標(biāo)記物質(zhì)譜圖，從而實(shí)現(xiàn)臨床微生物檢驗(yàn)中細(xì)菌、真菌及

12、病毒在屬、種、株水平上的鑒定。 MS 在菌血癥、尿路感染、毒素檢測及耐藥監(jiān)測方面顯示出巨大的優(yōu)勢，有望成為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室感染性疾病常用診斷方法 弗朗西斯阿斯頓于1919年制成的第一臺(tái)質(zhì)譜分析儀，1922年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542J Clin Microbiol. 2010; 48: 900核酸擴(kuò)增及DNA序列分析PCR是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。目前,PCR已成為分子生物學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域的經(jīng)典試驗(yàn)方法。PCR在血流感染微生物檢測和鑒定中的應(yīng)用體現(xiàn)在3個(gè)方面：一是對純的病原菌鑒定

13、；二是對血培養(yǎng)陽性培養(yǎng)物快速鑒定；三是對臨床標(biāo)本中難以培養(yǎng)病原菌進(jìn)行檢測和鑒定。可通過2種方式檢測和鑒定病原微生物，一是使用特異引物擴(kuò)增檢測病原微生物目標(biāo)基因；二是使用通用引物擴(kuò)增檢測細(xì)菌16SrRNA和真菌 ITS及5.8S、26SrRNA等基因D1/D2序列，同時(shí)進(jìn)行測序分析Kary B. MullisThe Nobel Prize in Chemistry 1993Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis. 2011, 24(2):137保守區(qū)反應(yīng)親緣性可變區(qū)反應(yīng)菌種間差異廣譜性細(xì)菌廣譜性細(xì)菌/真菌感染核酸

14、檢測真菌感染核酸檢測-臨床應(yīng)用檢測方法：核酸檢測 16s rDNA/18s rDNA-“細(xì)菌/真菌身份證”(每個(gè)細(xì)菌/真菌都有的一個(gè)基因)不明微生物感染病原體廣譜檢測檢測方法：PCR + ABI 3730 xl 測序法類型報(bào)告周期樣本采集細(xì)菌感染檢測1天內(nèi)標(biāo)本要求：痰液、肺泡灌洗液等真菌感染檢測結(jié)核桿菌檢測細(xì)菌細(xì)菌16s /真菌真菌18s 檢測檢測 16s rDNA/18s rDNA-“細(xì)菌/真菌身份證” 臨床細(xì)菌/真菌檢測常用的方法細(xì)菌/真菌培養(yǎng)生化表型檢測確定菌種基因檢測基因檢測病原體培養(yǎng)病原體培養(yǎng)檢測時(shí)間檢測時(shí)間3-53-5天天( (最快最快18h)18h)3-73-7天，陰性結(jié)果天，陰

15、性結(jié)果2 2個(gè)月個(gè)月靈敏度靈敏度10-100 copies10-100 copies1010* *5 copies5 copies特異度特異度可區(qū)分可區(qū)分10001000種菌種菌350350種菌種菌局限性局限性100100個(gè)菌為陰性個(gè)菌為陰性苛氧菌，厭氧菌不易培養(yǎng)；不能早期診斷苛氧菌，厭氧菌不易培養(yǎng)；不能早期診斷技術(shù)條件要求技術(shù)條件要求PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增無菌無菌3737培養(yǎng)箱與顯微鏡培養(yǎng)箱與顯微鏡臨床意義臨床意義確定感染確定感染懷疑感染懷疑感染細(xì)菌16S分型“細(xì)菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)”Critical Care Medicine 2015目的：選擇歐洲6個(gè)國家共9個(gè)ICU529名重癥感染患者所采集的

16、標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)和分子生物學(xué)檢測，其中包括616份血流感染、185份肺炎及110份無菌區(qū)液體或組織的樣本，評價(jià)聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法的潛在臨床意義分子檢測技術(shù)用于血流感染、肺炎及無菌部位分子檢測技術(shù)用于血流感染、肺炎及無菌部位感染的危重病人快速診斷的多中心研究感染的危重病人快速診斷的多中心研究在625份血流感染標(biāo)本中，PCR鑒定病原菌228例（37%），而血培養(yǎng)為68例（11%）。PCR的靈敏度為81%，特異性為69%，陰性預(yù)測值為97%。Critical Care Medicine 2015結(jié)論：聚合酶鏈反應(yīng)/電噴霧質(zhì)譜檢測（PCR）技術(shù)可以作為血流感染快速識(shí)別病原菌的方法，6小時(shí)內(nèi)排查血流感染

17、，具有潛在的臨床經(jīng)濟(jì)效益Critical Care Medicine 2015一項(xiàng)對照性研究，對263例疑似膿毒癥患者血標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)和多重PCR技術(shù)，檢測標(biāo)本中細(xì)菌和真菌病原體，對兩種檢測方法的檢測率、敏感性、特異性及分層狀況下的結(jié)果進(jìn)行對照分析，評價(jià)多重PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究結(jié)果顯示在該研究263份病例中，確診感染41.5%，可能感染30.7%，余為無感染 以臨床表現(xiàn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)兩種檢測方法敏感性30%、NPV19%均低，而以血培養(yǎng)作為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，PCR檢測的敏感性61%、特異性95%、NPV90，PPV76%在病原菌的鑒別數(shù)量方面血培養(yǎng)高于PCR（66/46），但對于血培養(yǎng)陰性

18、的病例中PCR技術(shù)更顯優(yōu)勢在預(yù)先使用過抗生素的病例中，血培養(yǎng)檢測陽性率高于PCR技術(shù)檢測時(shí)間PCR技術(shù)明顯優(yōu)于血培養(yǎng) 血流感染的早期診斷和病原菌識(shí)別是減少細(xì)菌耐藥、降低死亡率前提 優(yōu)化血培養(yǎng)提高BSI的診斷陽性率 感染標(biāo)志物僅是反映BSI嚴(yán)重程度的重要指標(biāo) 分子生物學(xué)技術(shù)對BSI早期診斷和病原菌識(shí)別具有重要的臨床價(jià)值 分子生物學(xué)技術(shù)不能替代血培養(yǎng)謝謝聆聽！臨床細(xì)菌/真菌檢測常用的方法生化表型全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng)導(dǎo)致血流感染的G-菌、G+菌、厭氧菌及真菌，其血培養(yǎng)的陽性率均與采血體積相關(guān)陽性率標(biāo)準(zhǔn)體積：采血量為7-10ml,平均8.7ml; 低體積：采血量2.455微克/L,診斷G-菌

19、BSI的敏感度為71.4%，特異度96.2%。在G+菌血流感染所致膿毒癥患者，PCT的AUC為0.619，最佳診斷臨界值1.585微克/L,敏感度41.2、特異度82診斷細(xì)菌性BSI時(shí)，血漿PCT的敏感性和特異性較血清CRP、血漿內(nèi)毒素明顯增高結(jié)論結(jié)論：G-菌血流感染所致膿毒癥患者PCT、CRP、內(nèi)毒素水平高于G+菌血流感染者，三者聯(lián)合檢測有望成為早期判斷血流感染所致膿毒癥及其病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。結(jié)果：標(biāo)本病原菌識(shí)別率為86%（1807/2017），敏感率為94.7%（95%CI），特異性為98.8%。而對MRSA的特異性為100%。病原菌檢測時(shí)間僅需18小時(shí)結(jié)論：基因芯片技術(shù)對細(xì)菌種類進(jìn)行最終鑒定具有較傳統(tǒng)血培養(yǎng)敏感性高、特異性強(qiáng)及時(shí)間更短的特點(diǎn)。有利于臨床膿毒癥快速診斷和早期治療?；蛐酒夹g(shù)對血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌種類準(zhǔn)確、快速鑒定的一項(xiàng)觀察性研究對英國和芬蘭兩個(gè)醫(yī)學(xué)中心3318例疑似膿毒癥患者的2107份血培養(yǎng)陽性標(biāo)