生物化學實驗技術常用分離技術實用教案

1、 1、鹽析法鹽析法的根據(jù)是蛋白質在稀鹽溶液(rngy)中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚并從溶液(rngy)中析出。 2、有機溶劑沉淀法有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、破壞溶質周圍形成的水化層，從而降低溶質溶解度；其二、有機溶劑的介電常數(shù)比水小，導致溶劑的極性減小。 3、蛋白質沉淀劑蛋白質沉淀劑則僅對一類或一種蛋白質沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質、凝集素和重金屬等。第1頁/共25頁第一頁，共25頁。4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型

2、聚合物可使蛋白質發(fā)生沉淀作用。 5、選擇性沉淀法根據(jù)各種蛋白質在不同物理化學(w l hu xu)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點，用適當?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達到純化有效成分的目的。第2頁/共25頁第二頁，共25頁。 在生化制備中，沉淀主要用于濃縮(nn su)目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制備中常用的有以下幾種沉淀方法和沉淀劑： 1鹽析法 多用于各種蛋白質和酶的分離純化 2有機溶劑沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化，有時也用于蛋白質沉淀。 3等電點沉淀法 用于氨基酸、蛋白質及其它兩性物質的沉淀。但此

3、法單獨應用較少，多與其它方法結合使用。 4非離子多聚體沉淀法用于分離生物大分子。 5生成鹽復合物沉淀 用于多種化合物，特別是小分子物質的沉淀。 6熱變性及酸堿變性沉淀法 用于選擇性的除去某些不耐熱及在一定PH值下易變性的雜蛋白。第3頁/共25頁第三頁，共25頁。第一節(jié) 鹽析(yn x)(yn x)法 所有固體溶質都可以在溶液中加入中性鹽而沉淀析出，這一過程(guchng)(guchng)叫鹽析。 在生化制備中, ,許多物質都可以用鹽析法進行沉淀分離，如蛋白質、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白質沉淀最為常見，特別是在粗提階段。 鹽析法分為兩類，第一類叫KsKs分段鹽析法，在一定PHPH和溫度下通過

4、改變離子強度實現(xiàn)，用于早期的粗提液；第二種叫b b分段鹽析法，在一定離子強度下通過改變PHPH和溫度來實現(xiàn)，用于后期進一步分離純化和結晶. .第4頁/共25頁第四頁，共25頁。 鹽的選擇 鹽析(yn x)條件的確定 鹽析(yn x)公式 logS=-KsM Ks-鹽析(yn x)常數(shù) M-濃度 S-蛋白質溶解度第5頁/共25頁第五頁，共25頁。一影響(yngxing)鹽析的若干因素 1蛋白質濃度 2離子(lz)強度和類型 3PH值 4溫度 第6頁/共25頁第六頁，共25頁。 1蛋白質濃度(nngd) 高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但許多蛋白質的b 和Ks常數(shù)十分接近，若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴

5、重的共沉淀作用； 在低濃度蛋白質溶液中鹽析(yn x)，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進行適當選擇。 用于分步分離提純時，寧可選擇稀一些的蛋白質溶液，多加一點中性鹽，使共沉淀作用減至最低限度。一般認為2.5%-3.0%的蛋白質濃度比較適中。第7頁/共25頁第七頁，共25頁。2離子強度(qingd)和類型 一般說來，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在進行分離的時候，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。每一組分被鹽析出來后，經過過濾或冷凍(lngdng)離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質組分鹽析出來。 離子種類對蛋白質溶解度也有一定影響，離子半徑

6、小而很高電荷的離子在鹽析方面影響較強，離子半徑大而低電荷的離子的影響較弱，下面為幾種鹽的鹽析能力的排列次序：磷酸鉀硫酸鈉硫酸銨檸檬酸鈉硫酸鎂。第8頁/共25頁第八頁，共25頁。3PH值 一般來說，蛋白質所帶凈電荷越多溶解度越大，凈電荷越少溶解度越小，在等電點時蛋白質溶解度最小。 為提高鹽析效率，多將溶液PH值調到目的蛋白的等電點處。 但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質等電點與高鹽濃度下所測的結果是不同(b tn)的，需根據(jù)實際情況調整溶液PH值，以達到最好的鹽析效果。第9頁/共25頁第九頁，共25頁。4溫度(wnd) 在低離子(lz)強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。但在

7、高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。 在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4進行。第10頁/共25頁第十頁，共25頁。二硫酸銨的使用(shyng) 硫酸銨中常含有少量的重金屬離子，對蛋白質巰基有敏感作用，使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液，通入H2S飽和，放置過夜，用濾紙除去重金屬離子，濃縮結晶(jijng)，100烘干后使用。 另外，高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸調節(jié)至所需PH。第11頁/共25頁第十一頁，共25頁。硫酸銨的加入有以下(yxi)幾種方法： 1）加

8、入固體鹽法 用于要求飽和度較高而不增大(zn d)溶液體積的情況； 2）加入飽和溶液法 用于要求飽和度不高而原來溶液體積不大的情況； 3）透析平衡法 先將鹽析的樣品裝于透析袋中，然后浸入飽和硫酸銨中進行透析，透析袋內硫酸銨飽和度逐漸提高，達到設定濃度后，目的蛋白析出，停止透析。該法優(yōu)點在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性，鹽析效果好，但手續(xù)煩瑣，需不斷測量飽和度，故多用于結晶，其它情況少見。第12頁/共25頁第十二頁，共25頁。使用(shyng)硫酸銨時： 1）必須注意飽和度表中規(guī)定的溫度，一般有0或室溫兩種，加入固體鹽后體積的變化已考慮在表中； 2）分段鹽析中，應考慮每次分段后蛋白質濃度的變化。一種蛋

9、白質如經二次透析，一般來說，第一次鹽析分離范圍（飽和度范圍）比較寬，第二次分離范圍較窄。 3）鹽析后一般放置半小時至一小時，待沉淀完全后才過濾或離心。過濾多用于高濃度硫酸銨溶液，因為此種情況下，硫酸銨密度較大，若用離心法需要(xyo)較高離心速度和長時間的離心操作，耗時耗能。離心多用于低濃度硫酸銨溶液。第13頁/共25頁第十三頁，共25頁。第二節(jié) 有機溶劑沉淀法 有機溶劑的沉淀機理(j l)是降低水的介電常數(shù)，導致具有表面水層的生物大分子脫水，相互聚集，最后析出。 有機溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等

10、。第14頁/共25頁第十四頁，共25頁。有機溶劑沉淀法優(yōu)缺點 : 1 1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀； 2 2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易(rngy)(rngy)； 3 3）在生化制備中應用比鹽析法廣泛。其缺點是對具有生物活性的大分子容易(rngy)(rngy)引起變性失活，操作要求在低溫下進行?？傮w來說，蛋白質和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。第15頁/共25頁第十五頁，共25頁。影響(yngxing)有機溶劑的沉淀效果因素 1）溫度 低溫可保持生物大分子活性，同時降低其溶解度，提高提取效率； 2）樣品濃度(nngd)和PH 與鹽析法中的作用基

11、本相同； 3）金屬離子 一些多價陽離子如Zn 2+和Ca 2+在一定PH下能與呈陰離子狀態(tài)的蛋白質形成復合物，這種復合物在水中或有機溶劑中的溶解度都大大下降，而且不影響蛋白質的生物活性。 4）離子強度 鹽濃度(nngd)太大或太低都對分離有不利影響，對蛋白質和多糖而言鹽濃度(nngd)不超過5%比較合適，使用的乙醇量不超過二倍體積為宜。第16頁/共25頁第十六頁，共25頁。 第三節(jié) 其他(qt)沉淀法 一等電點沉淀法 二生成鹽復合物沉淀法 三 選擇性變性(binxng)沉淀 四非離子多聚物沉淀法 第17頁/共25頁第十七頁，共25頁。一等電點沉淀法 兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不

12、同的兩性電解質具有不同的等電點，以此為基礎可進行分離。 利用等電點除雜蛋白時必須(bx)了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。 不少蛋白質與金屬離子結合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須(bx)注意調整PH值。 等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。第18頁/共25頁第十八頁，共25頁。二生成(shn chn)鹽復合物沉淀法 1金屬復合鹽法 許多有機物質包括蛋白在內，在堿性溶液中帶(zhn di)負電荷，能與金屬離子形成沉淀。根據(jù)有機物與它們之間的作用機制，可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物類，如銅鋅鎘；親羧酸含氮化合物類，如鈣鎂鉛

13、；親硫氫基化合物類，如汞銀鉛。 蛋白質-金屬離子復合物的重要性質是它們的溶解度對溶液的介電常數(shù)非常敏感，調整水溶液的介電常數(shù)（如加入有機溶劑），即可沉淀多種蛋白。第19頁/共25頁第十九頁，共25頁。 2 有機鹽法含氮有機酸如苦味酸、鞣酸等能與有機分子的堿性功能團形成復合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆的沉淀反應，故用于制備蛋白質時，需采用較溫和的條件，有時還需加入一定的穩(wěn)定劑。 3無機復合鹽法如磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等?？偨Y：以上鹽類復合物都具有(jyu)很低的溶解度，極易沉淀析出。若沉淀為金屬復合鹽，可通以H2S使金屬變成 硫化物而除去，若為有機酸鹽或磷鎢酸鹽，則加入無機酸并用乙醚萃取，把有機

14、酸和磷鎢酸等移入乙醚中除去，或用離子交換法除去。值得注意的是此類方法常使蛋白質發(fā)生不可逆沉淀，應用時必須謹慎。第20頁/共25頁第二十頁，共25頁。三 選擇性變性(binxng)沉淀 其原理是利用蛋白質、酶和核酸等生物大分子對某些物理或化學因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達到分離提純的目的。此方法可分為： 1）利用表面(biomin)活性劑(SDS)或有機溶劑引起變性； 2）利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分； 3）酸堿變性。第21頁/共25頁第二十一頁，共25頁。四非離子(lz)多聚物沉淀法 非離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑，最早用于提純免疫球蛋白、

15、沉淀一些細菌(xjn)和病毒，近年來逐漸廣泛應用于核酸和酶的分離提純。這類非離子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖酐硫酸鈉等，其中應用最多的是聚乙二醇。 第22頁/共25頁第二十二頁，共25頁。用非離子多聚物沉淀生物大分子和微粒(wil)，一般有兩種方法： 1）選用兩種水溶性非離子多聚物組成液液兩相體系，不等量分配，而造成分離。此方法基于不同生物分子表面結構不同，有不同分配系數(shù)。并外加離子強度、PH值和溫度等影響，從而(cng r)擴大分離效果。 2）選用一種水溶性非離子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。該方法操作時先離心除去大懸浮顆粒，調整溶液PH值和溫度至適度，然后加入中性鹽和多聚物至一定濃